הדמיית רקמות עמוקות של מוח דג זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל שלושה פוטונים

תקציר

מקור: Hontani, Y., et al. מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת-פוטוני ברקמות עמוקות במוח שלם של עכבר ודגי זברה. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את ההגדרה והביצוע של הדמיית שלושה פוטונים במוח של דג זברה מורדם. הפרוטוקול מאפשר הדמיה של רקמות עמוקות של נוירונים המסומנים פלואורסצנטית, וחושף פעילות עצבית ומבנים בזמן אמת ליישומי מחקר במדעי המוח.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הדמיה תוך-חיונית במוח דג הזברה
   הערה: כדי לאתר כראוי את מוח הדג מתחת לעדשת האובייקטיב, נעשה שימוש במצלמת מכשיר מצמד מטען (CCD) משנית באותו נתיב כמו אור העירור להדמיית שדה רחב.
   
   1. הגדר את המיקרוסקופ וכיול את הכוח.
   2. הנח מטרה בהגדלה נמוכה (בדרך כלל פי 4) על המיקרוסקופ.
   3. מניחים את צלחת הפטרי המכילה את הדגים והצינורות מתחת למיקרוסקופ.
   4. השתמש במקור אור דיודה פולטת אור (LED) כדי להאיר את צלחת הפטרי.
   5. פתח את מצב המצלמה של תוכנת רכישת התמונות (איור 1).
   6. לחץ על שידור חי.
   7. בחר ערוץ A בצד ימין של המסך.
   8. התאם את הגדרות ההיסטוגרמה כדי לראות את התמונה בבירור.
      הערה: יש לעדכן אותן לפי הצורך.
   9. הגדר את הגדרת המנוע בבקר המנוע לבסיס.
   10. הורד את המטרה עד שהדג נראה.
       הערה: ודא שעדשת האובייקט אינה יוצרת מגע פיזי עם הראש.
   11. מקם את מרכז ראש הדג במרכז שדה הראייה.
   12. הזז את המטרה למעלה והרחק מראש הדג.
   13. החלף את עדשת האובייקט בהגדלה נמוכה בעדשת האובייקט עם צמצם מספרי גבוה (NA) עבור 3PM (מיקרוסקופיה תלת-פוטונית).
       הערה: עדשת ההגדלה הנמוכה ועדשת האובייקט NA הגבוהה אינן צריכות להיות פרפוקליות אלא חייבות להיות קרובות מספיק כדי להבטיח שהדג נמצא בשדה הראייה של עדשת האובייקט NA הגבוהה.
   14. הורד לאט את עדשת האובייקט, וודא שהאובייקט לא יוצר מגע פיזי עם הראש. בתוכנת מצלמת CCD, הפסק להזיז את המטרה כאשר החלק העליון של הראש גלוי. הגדר את מיקום z ל-0 מיקרומטר.
       הערה: ודא שאין בועות אוויר מתחת לעדשת המטרה בעת שימוש במטרה לטבול במים.
   15. כבה את מקור אור ה-LED וסגור את הווילון הכהה סביב המערכת.
   16. הגדר את תוכנת רכישת ההדמיה למצב Multiphoton GG להדמיית 3P והגדר את ההספק מתחת לעדשת המטרה לפחות מ-1 mW (עם קצב חזרת דופק ~1 מגה-הרץ).
   17. שנה את לחצן הגדרת המנוע מבסיס למטרה בבקר המנוע.
   18. כבו את האורות בחדר.
   19. הפעל את צינורות מכפיל האור (PMT) ופתח את תריס מקור העירור של 3PM. ודא שמתאר של העצם מופיע בערוץ אות הקרינה עקב אוטופלואורסצנטיות ובערוץ האותות של הדור ההרמוני השלישי (THG) עקב THG של העצם (איור 1C).
   20. בצע הדמיה בעומקים שונים על ידי הגדלת רמות ההספק בעת הדמיה עמוקה יותר.

תוצאות

איור 1: צילומי מסך מייצגים עבור הדמיה תוך-חיונית בדגים (סעיף פרוטוקול 1). (א) תצוגת מצב מצלמה של תוכנת רכישת התמונות עם עדשת אובייקטיבית פי 4 במקום. התכונות העיקריות של התוכנה מתוארות וממוספרות באופן הבא: 1. מצב הדמיה של תוכ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5% Povidone-iodine	Amazon	NDC 67818-155-32	ניקוי אספקטיבי של אזורי ניתוח
70% אתנול	Thermo Fisher Scientific	CAS 64-17-5	ניקוי אספקטיבי של אזורי ניתוח
Agarose	Sigma	A4718-256	הכנת תא דג זברה
ברגמו II	Thorlabs		מיקרוסקופ הדמיה מולטיפוטון
Bupivacaine	קורנל טיפול
GaAsP מוגבר PMT	Thorlabs	PMT2100	PMT גלאי
מחמם (800 W)	Finnex		למי דג הזברה)
Kimwipes	Kimtech		להכנת מזרק ננופיל דג זברה
(10 מיקרומטר) עם מחט 36 גרם	מזרק WPI	NANOFIL + NF36BV	ומחט להזרקת פנקורוניום ברומיד
משאבה פריסטלטית	מדע יסודות	ESI MP2	משאבת מים להתקנת דג זברה
צינורות פוליאתילן (תעודת זהות 0.58 מ"מ, OD 0.965 מ"מ)	צינורות משאבת MP2	מדע היסודות	שנכנסים לפה של דג הזברה
SR400	סטנפורד מערכות מחקר	SR400	מונה פוטונים
חיישן כוח פוטודיודה סטנדרטי	Thorlabs	S122C	גלאי כוח
שעוות אגרוף רצועה דקה	Corning Rubber Co., Inc.		החזקת צינורות במקומם בתא דג הזברה
ThorImage	Thorlabs		תוכנת רכישת תמונה
טריקאין (מלח אתיל-m-אמינובנזואט מתאן סולפונט)	MP	103106	הרדמה והמתת חסד של דג הזברה
צינורות טיגון (תעודת זהות 1/16 אינץ', O.D. 1/8 אינץ')	צינורות טיגון		לזרימת מים להכנת דגי זברה
	VaporGuard VetEquip	931401	למיחזור דבק רקמות איזופלורן
Vetbond	3M	1469SB	להדבקת חלון הזכוכית על גולגולת העכבר, ולהדבקת רקמת המעבדה בעת הכנת הדג.
XLPLN25XWMP2	Olympus		Multiphoton Excitation מטרה ייעודית

וטרינרי מחמם אקווריום רקמת מעבדה של של צינורות