הדמיית רקמות עמוקות של מוח דג זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל שלושה פוטונים

Abstract

מקור: Hontani, Y., et al. מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת-פוטוני ברקמות עמוקות במוח שלם של עכבר ודגי זברה. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את ההגדרה והביצוע של הדמיית שלושה פוטונים במוח של דג זברה מורדם. הפרוטוקול מאפשר הדמיה של רקמות עמוקות של נוירונים המסומנים פלואורסצנטית, וחושף פעילות עצבית ומבנים בזמן אמת ליישומי מחקר במדעי המוח.

Protocol

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הדמיה תוך-חיונית במוח דג הזברה
   הערה: כדי לאתר כראוי את מוח הדג מתחת לעדשת האובייקטיב, נעשה שימוש במצלמת מכשיר מצמד מטען (CCD) משנית באותו נתיב כמו אור העירור להדמיית שדה רחב.
   
   1. הגדר את המיקרוסקופ וכיול את הכוח.
   2. הנח מטרה בהגדלה נמוכה (בדרך כלל פי 4) על המיקרוסקופ.
   3. מניחים את צלחת הפטרי המכילה את הדגים והצינורות מתחת למיקרוסקופ.
   4. השתמש במקור אור דיודה פולטת אור (LED) כדי להאיר את צלחת הפטרי.
   5. פתח את מצב המצלמה של תוכנת רכישת התמונות (איור 1).
   6. לחץ על שידור חי.
   7. בחר ערוץ A בצד ימין של המסך.
   8. התאם את הגדרות ההיסטוגרמה כדי לראות את התמונה בבירור.
      הערה: יש לעדכן אותן לפי הצורך.
   9. הגדר את הגדרת המנוע בבקר המנוע לבסיס.
   10. הורד את המטרה עד שהדג נראה.
       הערה: ודא שעדשת האובייקט אינה יוצרת מגע פיזי עם הראש.
   11. מקם את מרכז ראש הדג במרכז שדה הראייה.
   12. הזז את המטרה למעלה והרחק מראש הדג.
   13. החלף את עדשת האובייקט בהגדלה נמוכה בעדשת האובייקט עם צמצם מספרי גבוה (NA) עבור 3PM (מיקרוסקופיה תלת-פוטונית).
       הערה: עדשת ההגדלה הנמוכה ועדשת האובייקט NA הגבוהה אינן צריכות להיות פרפוקליות אלא חייבות להיות קרובות מספיק כדי להבטיח שהדג נמצא בשדה הראייה של עדשת האובייקט NA הגבוהה.
   14. הורד לאט את עדשת האובייקט, וודא שהאובייקט לא יוצר מגע פיזי עם הראש. בתוכנת מצלמת CCD, הפסק להזיז את המטרה כאשר החלק העליון של הראש גלוי. הגדר את מיקום z ל-0 מיקרומטר.
       הערה: ודא שאין בועות אוויר מתחת לעדשת המטרה בעת שימוש במטרה לטבול במים.
   15. כבה את מקור אור ה-LED וסגור את הווילון הכהה סביב המערכת.
   16. הגדר את תוכנת רכישת ההדמיה למצב Multiphoton GG להדמיית 3P והגדר את ההספק מתחת לעדשת המטרה לפחות מ-1 mW (עם קצב חזרת דופק ~1 מגה-הרץ).
   17. שנה את לחצן הגדרת המנוע מבסיס למטרה בבקר המנוע.
   18. כבו את האורות בחדר.
   19. הפעל את צינורות מכפיל האור (PMT) ופתח את תריס מקור העירור של 3PM. ודא שמתאר של העצם מופיע בערוץ אות הקרינה עקב אוטופלואורסצנטיות ובערוץ האותות של הדור ההרמוני השלישי (THG) עקב THG של העצם (איור 1C).
   20. בצע הדמיה בעומקים שונים על ידי הגדלת רמות ההספק בעת הדמיה עמוקה יותר.

Results

איור 1: צילומי מסך מייצגים עבור הדמיה תוך-חיונית בדגים (סעיף פרוטוקול 1). (א) תצוגת מצב מצלמה של תוכנת רכישת התמונות עם עדשת אובייקטיבית פי 4 במקום. התכונות העיקריות של התוכנה מתוארות וממוספרות באופן הבא: 1. מצב הדמיה של תוכ...

Materials