הדמיית נדידת תאי גידול ברקמת גליובלסטומה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית סריקה בזמן-lapse

תקציר

מקור: Parker, J. J., et al. מודל תרבית פרוסות אורגנוטיפית של גליובלסטומה אנושית לחקר נדידת תאי גידול והשפעות ספציפיות לחולה של תרופות אנטי פולשניות. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מציג הדמיה של פרוסות רקמת גליובלסטומה המבטאות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. תמונות ברזולוציה גבוהה נלכדות במרווחי זמן עקביים כדי לעקוב אחר תנועת תאי הגידול וכיוונם.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון.

1. תיוג תאי גידול באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק המבטא רטרו-וירוס

הערה: מיקרוסקופ זמן-lapse לניתוח נדידת תאי הגידול דורש תיוג פלואורסצנטי יציב וארוך טווח של תאים בתוך תרבית הפרוסה. השימוש ברטרו-וירוס מוצע מכיוון שהוא מדביק באופן סלקטיבי תאים מתחלקים, ובכך מעשיר את התיוג הפלואורסצנטי בתוך אוכלוסיית תאי הגידול בניגוד למיקרוגליה או סוגי תאים אחרים הקיימים בתוך הפרוסה. סטנדרטיזציה של זיהום מצביעה על כך שטיטר ויראלי של 10⁴ CFUs/μL מביא לביטוי מספיק של חלבון פלואורסצנטי ירוק למעקב וניתוח של נדידת תאים. טיטר ויראלי מוגבר, שימוש בנגיף לא סלקטיבי (כלומר אדנו-וירוס, לנטי-וירוס), או אמצעים אחרים לתיוג כל התאים עלולים למנוע זיהוי של גבולות תאים ברורים במהלך הנדידה, ובכך לסבך את הניתוח. ניתן להשתמש בסמני פלורסנט חלופיים ולבצע אופטימיזציה לפי הצורך.

1. השג רטרו-וירוס להדבקה של פרוסות גידול באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים5,14 או ממקור זמין מסחרית. לדלל את הסופרנטנט הנגיפי על ידי הוספת הנפח המתאים למדיום עצבי ללא תוספת כדי להשיג טיטר ויראלי של 10⁴ CFUs (יחידות יוצרות מושבה) / מיקרוליטר.
2. בין 7 ל-10 ימים של תרבית מדביקים את תרביות פרוסות הגידול המעניינות ב-5-10 מיקרוליטר של נגיף (10-4 CFUs/μL). הנח את הנגיף בעדינות בטיפה על פני כל פרוסת רקמה. הפחת את נפח ה-supernatant שנוסף אם הפרוסה צפה על פני התוספת. החזירו צלחות המכילות תרביות פרוסות לחממה.
3. העריכו את הפרוסות עבור תאי גידול מסומנים החל מ-24 שעות לאחר זיהום ויראלי. עיכוב זמן זה ישתנה בהתאם לשילוב הנגיף ולקינטיקה של ביטוי גנים פלואורסצנטיים. עבור המבנים הוויראליים המשמשים כאן, נדרשו 72 שעות כדי לצפות באות פלואורסצנטי חזק עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי סטנדרטי.
   הערה: לעתים נדירות, פרוסות מציגות התפלגות היקפית בעיקר של תאים המסומנים באופן ויראלי, מה שעלול לסבך הדמיה קונפוקלית. כדי להימנע מסיבוך זה, נסה להפחית את עובי הפרוסה ואת השונות בעובי על פני הפרוסה. אם לתרבית הפרוסות יש אזור עבה יותר ליד המרכז, הדבר עשוי למנוע חדירה מספקת של חומרים מזינים, ובכך להגביל את אוכלוסיית תאי הגידול המתחלקים באופן פעיל. בדיקה איכותית לבדיקת סיבוך זה היא תוספת של מגיב צבע טטרזוליום (כלומר MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)) למצע תרבית הפרוסות. אזורים בפרוסה שאינם הופכים לכחולים לאחר הוספת המגיב מעידים על חוסר פעילות מטבולית ופגיעה בבריאות הפרוסה.

2. הדמיה קונפוקלית של סריקת לייזר פוטון יחיד של נדידת תאי גידול

הערה: לאחר אישור העברה מוצלחת ובריאות התרבית, ניתן לדמות תאים בתנאי בקרה, ולאחר מכן תקופה שווה של הדמיה בתנאי טיפול. באמצעות פרוטוקול זה, התאים צולמו בהצלחה ועקבו אחריהם במשך 12 שעות בכל מצב. עם זאת, תקופות קצרות או ארוכות יותר של הדמיה ומניפולציה סביבתית עשויות גם הן להיות אינפורמטיביות.

1. טעינת המיקרוסקופ
   1. לפני ההדמיה, הניחו 1 מ"ל של מדיה פרוסה טרייה בכלי עם תחתית זכוכית.
   2. אפשר למדיה בצלחת תחתית הזכוכית להתייצב בחממה למשך 15 דקות.
      הערה: בשלב זה ניתן להוסיף חומרי תיוג מסיסים, כגון לקטינים מצומדים פלואורסצנטיים (כלומר איזולקטין IB4 לתיוג מיקרוגליה) או נקודות קוונטיות מצומדות ליגנד, לזיהוי תת-אוכלוסיות תאיות במהלך ההדמיה.
   3. העבירו את התוספת להדמיה לכלי עם תחתית זכוכית באמצעות מלקחיים סטריליים בקולט אדים למינארי. העבר את המנה לשלב המיקרוסקופ.
   4. שמור על תרביות פרוסות באטמוספירה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ בחממה עליונה במיקרוסקופ אטום. השתמש בלחות סטרילית H₂O של תא הדגירה אם זמין כדי למנוע אידוי מדיה מוגזם (חשוב במיוחד לניסויי הדמיה ארוכים יותר).
   5. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרת אוויר פי 10 למרחק עבודה ארוך ועירור לייזר עבור פוטון יחיד ו/או רב פוטון. הערה: ודא שעדשת האובייקטיביות של המיקרוסקופ מספקת מרחק עבודה נאות. כתוצאה מהגובה הנוסף מהחממה העליונה, צלחת תחתית הזכוכית ותוספת תרבית הרקמות, יעדי מרחק עבודה ארוכים הם קריטיים.
   6. אבטח את צלחת הזכוכית התחתונה, הסר את מכסה צלחת הפטרי מפלסטיק וכסה בקרום חדיר גז.
2. רכישת תמונה
   1. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק חזותית את הפרוסה, ולאתר שדה מתאים עם צפיפות נאותה של תאי גידול המסומנים פלואורסצנטית בין קצה הפרוסה למרכז. הימנע משדות הדמיה בקצה הפרוסה, עקב רגישות מוגברת לתזוזות רקמות במהלך ההדמיה. ניתן להשתמש בנבלי פרוסות רקמה כדי להגביל את השינוי הזה.
   2. השתמש בתוכנת הדמיה במצב ניתוח רב-ממדי כדי להגדיר את גבולות מחסנית ה-Z הראשונה (התחתונה) והאחרונה (העליונה), כך שכל המיקומים להדמיה יכילו אות סלולרי פלואורסצנטי גלוי. הדמיה דרך 150 - 200 מיקרומטר של הפרוסה, עם צעד Z קבוע של 10 מיקרומטר, סיפקה רזולוציה נאותה למעקב אחר נתיבי תאים (ניתן להתאים זאת לצרכי הדמיה אישיים).
   3. אם למיקרוסקופ יש שלב ממונע, ודא שמותר זמן מספיק לכל רכישה של Z-stack. הגדר את מרווח הזמן בין רכישות לזמן סריקה שווה לכל מיקום x מספר מיקומים לתמונה (כלומר, אזורי גידול מצולמים).
      הערה: לעירור בו זמנית של הפלואורופורים הירוקים והאדומים, השתמש בתוכנית סריקת קו לייזר כפולה, עם עירור בו זמנית של 488 ננומטר ו-633 ננומטר. אורך הגל של עירור הלייזר שנבחר ישתנה בהתאם לחלבונים הפלואורסצנטיים הבודדים המתבטאים
   4. שמור על עוצמת לייזר אחידה והגדרות חור קונפוקלי בין אזורי הגידול המצולמים. השתמש בהגדרת עוצמת הלייזר הנמוכה ביותר הדרושה כדי לתחום בבירור את גופי תאי הגידול ואת התהליכים כדי להגביל את הפוטוטוקסיות. יחידות פרמטר הדמיה ספציפיות (כלומר הגדרות כוח וחור קונפוקלי) ישתנו בהתאם למפרט המיקרוסקופ ומקור הלייזר.
   5. פיצוי על אידוי מדיה פוטנציאלי על ידי הוספת 2 - 3 צעדי Z-stack "חוצץ" במישורי המוקד המתקדמים לעבר המטרה. זה למעשה מונע מהרקמה לעזוב את טווח רכישות ה-Z-stack במישור האנכי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM High Glucose	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A Medium, מינוס פנול אדום	Invitrogen (Gibco)	12349-015
תוסף B-27 (50X), Invitrogen ללא סרום	(Gibco)	17504-044
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)	Invitrogen (Gibco)	15140-122
תוסף GlutaMAX	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-גלוטמין (200 מ"מ)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	Invitrogen (Gibco)	15630-080
Nystatin תרחיף	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10,000 יחידה/מ"ל ב-DPBS, מעובד אספטית, BioReagent, מתאים לתרבית תאים
UltraPure נקודת התכה נמוכה Agarose	Invitrogen (Gibco)	16520-050	נמס ב-65.5 מעלות צלזיוס, נשאר נוזלי ב-37 מעלות צלזיוס ומתייצב במהירות מתחת ל-25 מעלות צלזיוס.
איזולקטין GS-IB4 מבית Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher (בדיקות מולקולריות)	I32450	משמש במדיה לתיוג Microglia/Macrophages
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector	Clonetech	632520
Retro-X Concentrator	Clonetech	31455	שרף מחייב לריכוז שאינו אולטרה-צנטריפוגה של סופרנטנטים נגיפיים
pVSG-G וקטור	Clonetech	631530	חלק ממערכת הביטוי הרטרו-ויראלית האוניברסלית Retro-X
GP2-293 תאי אריזה ויראליים	Clonetech	631530	חלק ממערכת הביטוי הרטרו-ויראלית האוניברסלית Retro-X
דבק ציאנואקרילט (סופר דבק)	Sigma-Aldrich	Z105899	צמיגות בינונית
(ריבוע - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	תבניות להטמעת דגימת גידול
נירוסטה מיקרו מרית	פישר סיינטיפיק	S50823	מכשיר כיפוף 45 מעלות בצוואר להב הכף
פישרברנד מעוקל מנתח מלקחיים מחודדים עדינים	פישר סיינטיפיק	08-875
סכין גילוח קצה יחיד (סכיני גילוח בטיחות אמריקאיים)	פישר סיינטיפיק	17-989-001	עובי קצה הלהב הוא 0.009 אינץ'. מכסה קהה מכווץ מוסר לפני הטעינה על ויברטום.
Leica VT1000 S Vibratome	Leica Biosystems	VT1000 S
הידרופילי תרבית תאים PTFE הכנס	EMD Millipore	PICM0RG50	30 מ"מ, PTFE הידרופילי, 0.4 מיקרומטר גודל נקבוביות
35 מ"מ כלי תחתית זכוכית	MatTek	P35G-1.5-20-C שרוול	20 מ"מ קוטר זכוכית. עובי זכוכית Coverslip 1.5
LSM 510 מיקוסקופ קונפוקלי	Zeiss	LSM 510	10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45)
PECON Stagetop Incubator	PeCON גרמניה	(הופסק)	Incubator PM 2000 RBT הוא מוצר אמין המיועד לשימוש עם Zeiss Microscopes.

תבנית הטבעה עם