הדמיית סידן ספונטנית עבור דינמיקה ספציפית לתא באסטרוציטים

תקציר

מקור: Bannai, H., et. al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultures by Membrane-Targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019)

הסרטון מדגים הדמיה פלואורסצנטית כדי לצפות בדינמיקת סידן ספונטנית ספציפית לתא באסטרוציטים על ידי ניטור רציף של חלבונים רגישים לסידן הממוקמים על קרום הפלזמה והרטיקולום האנדופלזמי.

פרוטוקול

1. הקלטת הדמיה Ca²⁺

1. פעילויות ספונטניות של אסטרוציטים המבטאים Lck-RCaMP2 ו-OER-GCaMP6f/
   הערה: ללא אופטיקה מפצלת תמונה, ניתן לנטר את אותות Ca²⁺ בקרום הפלזמה ואלה סביב הרטיקולום האנדופלזמי (ER) באותו תא. כאן, מתוארת ההקלטה הרציפה של Lck-RCaMP2 (מחוון Ca²⁺ מקודד גנטית ממוקד ממברנת פלזמה) ו-OER-GCaMP6f (מחוון Ca²⁺ מקודד גנטית של קרום הרשתית האנדופלזמית החיצונית) באותם אסטרוציטים. יעד טבילה בשמן עם צמצם מספרי גדול מ-1.3 מומלץ מאוד לפעילות ספונטנית של Ca²⁺.
   1. הפעל את המיקרוסקופ, המצלמה, מקור האור ותא החימום של המיקרוסקופ למשך 30 דקות לפחות לפני ההקלטה.
   2. התקן את הכיסוי המכיל את התאים שהועברו עם Lck-RCaMP2 ו-OER-GCaMP6f בתא ההקלטה והוסף 400 מיקרוליטר של מדיום ההדמיה. הניחו מכסה על גבי החדר.
   3. בחר את ערכת המסננים עבור GCaMP6f ואת מקור האור (אור עירור כחול, למשל, 470-490 ננומטר; ראה טבלת חומרים). אתר את האסטרוציטים המבטאים OER-GCaMP6f.
   4. בחרו ערכת מסננים ואת מקור האור עבור RCaMP2 (אור עירור ירוק, למשל, 510-560 ננומטר; ראו טבלת חומרים) ואשרו אם Lck-RCaMP2 מתבטא באותם אסטרוציטים. הימנע מחשיפה ארוכה למקור האור כדי למנוע הלבנת אור.
   5. הקלט תמונות דולג זמן של Lck-RCaMP2 ב-2 הרץ למשך 2 דקות. שמור את נתוני ההדמיה בכונן הקשיח.
   6. שנה את המסנן המוגדר לזה עבור GCaMP6f. הקלט תמונות זמן-lapse של OER-GCaMP6f באותו שדה ראייה ב-2 הרץ למשך 2 דקות. שמור את הנתונים בכונן הקשיח.
   7. נתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח התמונות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
-18 מ"מ כיסוי עגול	קארל הכט "Assistent"	#41001118	עובי 1, כיסויים עגולים בקוטר 18 מ"מ; ניתן להשתמש בכיסויים חלופיים.
מצלמה להקלטת			המצלמות הבאות היו זמינות לשימוש: מצלמת CCD מקוררת (למשל, Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD מצלמת (למשל, Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) או מצלמת CMOS (למשל, Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
תוכנת			כגון Metamorph (התקנים מולקולריים), Image J (NIH) ו-TI Workbench14 (מותאם אישית)
מדיום הדמיה ומאגר			השתמש במדיום או מאגר אופטימלי לניסוי. כאשר משתמשים במדיום, רצוי מדיום ללא אדום פנול כדי להפחית את הקרינה ברקע. הוסף 20 מ"מ HEPES כדי לשמור על pH מחוץ לחממת הפחמן הדו חמצני.
		פלואורסצנטי הפוך	כגון IX73 (אולימפוס) או Eclipse TI (Nikon Instech)
סט מסנני מיקרוסקופ להדמיית GCaMP6f	מסנן מתאים ל-GFP (עירור, 480 ± 10 ננומטר; פליטה, 530 ± 20 ננומטר)
		חימום מיקרוסקופ	מערכת חימום לשמירה על תאים ב-37 מעלות צלזיוס במהלך ההדמיה. כדי למנוע סחיפה הנגרמת על ידי התפשטות תרמית, מומלץ להשתמש במערכות חימום המכסות את כל המיקרוסקופ עצמו (למשל, Tokai Hit, Thermobox).
מקור אור מיקרוסקופ לעירור			מנורת כספית (100 וואט), מנורת קסנון (75 וואט), מערכת תאורת דיודה פולטת אור (LED) (למשל, CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., מקור LED ב-4 אורכי גל; Lumencor, מנוע אור SPECTRA X). במקרה של גוש כספית ומנורת קסנון, השתמש במסנן ND כדי להפחית את עוצמת העירור.
		מיקרוסקופ אובייקטיבית	תכנית-אפוכרומט מטרת טבילה בשמן עם צמצם מספרי גבוה מ-1.3 מומלצת מאוד לתיעוד פעילות Ca²⁺ ספונטנית בנוירונים ואסטרוציטים.
תא הקלטה	Elveflow	Ludin Chamber	תא הקלטה זה מיועד לכיסויים עגולים בקוטר 18 מ"מ.
סטריאומיקרוסקופ			משמש לניתוח היפוקמפוס. אולימפוס SZ60 או סטריאומיקרוסקופים מקבילים זמינים.

תמונה מיקרוסקופית ניתוח תמונה מיקרוסקופ סט מסנני מיקרוסקופ להדמיית RCaMP2 מסנן מתאים ל-RFP (עירור, 535 ± 50 ננומטר; פליטה, מעבר ארוך 590 ננומטר)מערכת עדשת