Method Article

ביצוע ניסויים אישית microarray MicroRNA

DOI:

10.3791/3250

⸱

October 28th, 2011

 , 
1Department of Pharmacology, University of Minnesota , 2Masonic Cancer Center, University of Minnesota

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך פשוט של ביצוע ניסויים אישית microarray microRNA מתואר. הצעדים כוללים בידוד RNA, תיוג RNA ו-DNA התייחסות, והכלאה דגימות כדי microarrays, סורקת את microarrays, כימות וניתוח אותות הכלאה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רנ"א (miRNAs) הם משפחה גדולה של ~ 22 נוקלאוטידים (NT) זמן מולקולות RNA אשר באים לידי ביטוי נרחב אאוקריוטים 1. הגנום מורכב לקודד לפחות מאות miRNAs, אשר בראש ובראשונה לדכא את הביטוי של מספר רב של גני מטרה שלאחר transcriptionally 2, 3. miRNAs לשלוט במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים 1. בנוסף, הביטוי מירנה שינה נמצא קשור מחלות אנושיות, כגון סרטן, ואת miRNAs עשוי לשמש סמנים למחלות הפרוגנוזה 4, 5. חשוב, אפוא, להבין את הביטוי פונקציות של miRNAs בתנאים שונים.

שלוש הגישות העיקריות היו מועסקים לביטוי פרופיל מירנה: PCR בזמן אמת, microarray, וסדר עמוק. הטכניקה של microarray מירנה יש את היתרון של להיות תפוקה גבוהה, בדרך כלל פחות יקר, ורוב הפעולות הניסוי וניתוח ניתן קארied החוצה במעבדה לביולוגיה מולקולרית במרבית האוניברסיטאות, בתי ספר לרפואה ובתי חולים הקשורים. כאן, אנו מתארים שיטה לביצוע אישית microarray ניסויים מירנה. מערכת בדיקה מירנה יודפסו על שקופיות זכוכית כדי לייצר microarrays מירנה. רנ"א הוא מבודד באמצעות שיטה או מגיב ששומרת קטן מינים RNA, שכותרתו אז עם צבע פלואורסצנטי. כמו שליטה, DNA התייחסות oligonucleotides המקביל משנה של miRNAs מסומנים גם עם צבע פלואורסצנטי שונים. ה-DNA התייחסות ישמש כדי להדגים את האיכות של השקופית ואת ההכלאה ואת ישמש גם לנורמליזציה נתונים. רנ"א ודנ"א הם מעורבים הכלאה לשקופית המכילה microarray בדיקות עבור רוב miRNAs במסד הנתונים. לאחר הכביסה, להחליק את נסרק להשיג תמונות, בעוצמות של מקומות מסוימים לכימות. אותות אלה הגלם יעובדו נוסף ניתח את הנתונים ביטוי miRNAs המקביל. Microaמגלשות rray ניתן הפשיטו מחדש כדי להפחית את העלות של microarrays כדי לשפר את העקביות של ניסויים microarray. אותם עקרונות ונהלים החלות על סוגים אחרים של ניסויים microarray אישית.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הדפסה של microarrays מירנה אישית

  1. הדפס את השקופיות microarray באמצעות מתקן הגרעין שירותי microarray באוניברסיטה או חברה. איכות ייצור microarray היא אחד הגורמים הקריטיים ביותר להצלחה של הניסוי microarray. נסו כמה שירותים במידת האפשר. באופן אידיאלי, אפשר היה להדפיס שקופיות 5-10 בכל פעם, ואת כל השקופיות ייראה זהה, עם כתמים בודדים מופרדים היטב.
  2. לקבלת תמיכה microarray, אנו משתמשים פערים שקופיות השנייה מצופה.
  3. עבור בדיקות מירנה, אנו משתמשים NCod....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות ההתקדמות עמוק טכנולוגיות רצף, microarray נשאר בחירה מעשית עבור ניתוח תפוקה גבוהה של DNA ו-RNA. בהשוואה רצף עמוק, ניסויים microarray זולים, וכן מעבדה לביולוגיה מולקולרית טיפוסי יכול לבצע את רוב הניסויים ניתוח נתונים בתוך הבית, אשר מאפשר גמישות חוסך זמן. בעתיד, סביר להניח microarrays היטב המותאם באופן אינטנסיבי לחקור קבוצות הגנים, למשל, או כל קבוצת משנה של גורמי תעתוק בגנום או miRNAs, ואת אותם עקרונות ונהלים שהוצגו כאן ניתן להשתמש בניסויים microarray מנהג ללמוד הגן משפחות מלבד.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לשימוש בסמים מרכז (P50 התובע 011,806) ו צבא ארצות הברית מחלקת ההגנה (W81XWH-07-1-0183).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
פריטים מוכר מספר קטלוגי תגובות
NCode Multi-Species מירנה microarray בדיקה קבע V2 Invitrogen MIRMPS201 עיצוב המבוסס על miRBase שחרור 9.0 (אוקטובר 2006). הוא מכיל ~ 1140 ללא שינוי, 34-44 oligonucleotides nt עוד בדיקות עבור להטיס תולעת, דג הזברה, עכבר, חולדה, ו miRNAs אדם, ומספר בדיקות בקרה פנימית כגון snoRNAs. בדיקות מירנה הן כפילויות של רצפי משלים miRNAs בוגרת, ומכאן גודל של ~ 44 NT. ניתוח אחד יכול להתמקד miRNAs מן הגנום מסוים (ים) של עניין.
Trizol Invitrogen 15596018 יש לנו גם השתמשו מועשר, חלק קטן RNA תיוג, למרות הכל דגימות רנ"א הם מהירים יותר, קל יותר להכין לכמת מתאים ליישומים במורד כגון ניתוח ה-mRNA.
T4-RNA האנזים 1 ניו אינגלנד Biolשרירי הבטן M0204L
Ulysis אלקסה פלואוריד 647 ערכת גרעין תיוג חומצה Invitrogen U21660 ערכה זו או מוצרים דומים ניתן להשתמש בתווית ניסיוני דגימות RNA או RNA השליטה (במקום ה-DNA שליטה) גם כן.
5'-PCU-DY547-3 " Dharmacon מותאמים ללקוח חלק קטן RNA יכול להיות מתויג באופן דומה על ידי קשירת.
CentriSep עמודות פרינסטון הפרדות CS-901
GAPSII מצופה שקופיות קורנינג 40004 סוגים אחרים של שקופיות ניתן להשתמש גם.
Microarray לתאי הכלאה קורנינג 2551 או 40080 סוגים אחרים של תאים הכלאה ו coverslips צריך גם לעבוד. באמצעות מכונות הכלאה זמינים מסחרית יכולה להפחית באופן משמעותי את זמן הכלאה, למשל, ל ~ 2 שעות.
Lifterslips ה 'ermo / אירי מדעי 25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse BlueGenome
GeneSpring Agilent

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
  2. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
  3. Chekulaeva, M., Filipowicz, W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MicroRNA MicroarrayRNA IsolationFluorescent LabelingHybridization ProcedureSlide RegenerationMicroarray ScanningData NormalizationCustom MicroarrayProbe DesignNucleic Acid Labeling

Related Articles