Method Article

ויזואליזציה של תפקודי נשימה מיטוכונדריאלי באמצעות ציטוכרום C מונואמין / succinate dehydrogenase (COX / SDH) תיוג פעמיים Histochemistry

DOI:

10.3791/3266

⸱

November 23rd, 2011

1Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 2National Institute on Drug Abuse (NIDA)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציטוכרום c אוקסידאז / נתרן דהידרוגנז (COX / SDH) פעמיים תיוג השיטה מאפשרת להדמיה ישירה של המיטוכונדריה אנזים ליקויים בדרכי הנשימה טרי קפוא סעיפים רקמות. זוהי טכניקה פשוטה histochemical שימושי חוקרת מחלות מיטוכונדריאליות, הזדקנות, הזדקנות בהפרעות הקשורות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דנ"א מיטוכונדריאלי (mtDNA) ליקויים הם גורם חשוב של המחלה וייתכן ביסוד הזדקנות מהזדקנות 1,2 שינויים. התיאוריה המיטוכונדריה של הזדקנות מציע תפקיד מוטציות mtDNA, אשר יכול לשנות הומאוסטזיס bioenergetics ותפקוד התא, בתהליך ההזדקנות 3. שפע של עדויות כבר מלוקט תמיכה 1,4 זה בתיאוריה, להיות דוגמה המוטטורי mtDNA עכבר 5, אך את התפקיד המדויק של הנזק mtDNA בהזדקנות הוא לא הבין לגמרי 6,7.

התבוננות את הפעילות של אנזימים הנשימה היא גישה פשוטה לחקירת תפקוד המיטוכונדריה. קומפלקס IV, או ציטוכרום אוקסידאז ג (COX), חיוניים לתפקוד המיטוכונדריה. יחידות משנה קטליטי של COX מקודדים על ידי mtDNA חיוניים להרכבה של המתחם (איור 1). לפיכך, סינתזה לתפקוד תקין והם מבוססים במידה רבה על mtDNA שלמות 2.למרות מתחמי נשימתיות אחרות יכול להיחקר, מתחמי IV ו-II הם נוחים ביותר לבחינה histochemical 8,9. קומפלקס II, או דהידרוגנז succinate (SDH), מקודד כולו על ידי ה-DNA גרעיני (איור 1), ואת הפעילות שלה הוא בדרך כלל לא מושפעים לקויי mtDNA, למרות עלייה עשויים להצביע biogenesis המיטוכונדריה 10-12. MtDNA לקויי שנצפתה מחלות מיטוכונדריאליות, ההזדקנות, מחלות הקשורות לגיל מוביל לעתים קרובות נוכחות של תאים עם פעילות COX נמוך או נעדר 2,12-14. למרות פעילות COX ו SDH יכול להיחקר בנפרד, שיטת רציפים פעמיים תיוג 15,16 הוכיח את יתרון באיתור תאים עם תפקוד המיטוכונדריה 12,17-21.

רבים מן החוקות אופטימלי של assay נקבעו, כגון ריכוז המצע, acceptors האלקטרון / תורמים, נושאות אלקטרון ביניים, ההשפעה של ה-pH, ו-t התגובהIME 9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidine (DAB) הוא תורם אלקטרון יעיל ואמין 22. בתאים עם תפקוד COX, המוצר פולימר חום indamine יהיה להתמקם cristae המיטוכונדריה ו להרוות תאים 22. תאים אלה עם COX מתפקדת ולכן לא יהיה רווי ידי DAB המוצר, המאפשר הדמיה של פעילות SDH על ידי הפחתה של nitroblue tetrazolium (NBT), acceptor האלקטרון, למוצר formazan כחול סוף 9,24. ציטוכרום C ו succinate מצעים נתרן מתווספים לנרמל את רמות אנדוגני מלאה בין חולה / מוטציה רקמות 9. Catalase נוסף כאמצעי זהירות, כדי למנוע זיהום אפשרי התגובות מפעילות peroxidase 9,22. Methosulfate Phenazine (PMS), נושאת אלקטרון ביניים, הוא משמש יחד עם אזיד הנתרן, מעכב שרשרת הנשימה, כדי להגביר את היווצרותם של תוצרי התגובה הסופית 9,25. למרות זאת להודיעation, כמה פרטים קריטיים המשפיעים על התוצאה של assay זה פשוט נאה, בנוסף שולטת הספציפיות התקדמות הטכניקה, טרם הציג.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. רקמות כהכנה cryosectioning

  1. הקורבן בעלי חיים על ידי פריקה או עריפת ראש או צוואר הרחם, על פי היתר מוסרי זמין.
  2. במהירות לאסוף רקמות עניין (למשל. במוח), במהירות הקפאת קרח יבש (רקמות עשויה לדרוש הקפאת isopentane או פרופאן מקורר עם חנקן נוזלי כדי להשיג מורפולוגיה אופטימלית). רקמות חנות בנייר אלומיניום ב -80 ° C עד מוכן סעיף.
  3. הטמע הרקמה הקפואה לקראת cryosectioning.
  4. איסוף של 14 מיקרומטר ס....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המשולבת COX / SDH histochemical מאפשרת ויזואליזציה של תאים בעלי תפקוד המיטוכונדריה. טכניקה זו, עם מחקרים מוקדמים שראשיתה 1968, נותר פופולרי, עם הרבה בהתחשב בכך את "תקן הזהב" לזיהוי מחלות מיטוכונדריאליות בחולים 14,19,26,27. עכשיו זה משמש לעתים קרובות כדי לחקור mtDNA מוטציה מונע הזדקנות הזדקנות בהפרעות הקשורות 12,13,18,20,21,24. COX / SDH פעמיים שיטת תיוג משמש לעתים קרובות במקביל עם טכניקות אחרות כדי לזהות מוטציות mtDNA ספציפיים להמשיך לחקור את .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להזדקנות (AG04418), המכון הלאומי לשימוש בסמים, המכון הלאומי לבריאות, קרולינסקה תוכנית Institutet שותפויות בוגר, קרולינסקה Institutet, שוודית מועצת המחקר, כוח המוח שוודית, קרן המוח שוודית. תודות רבות Mattias קרלן, ד"ר ג'וזפה Coppotelli לתמיכה יצירתי עם איור 1 ו - 2, בהתאמה; קארין Pernold לקבלת סיוע טכני; ואת בני הזוג. בארי ג'יי הופר, לארס אולסון, נילס, גוראן לארסון עבור עצות מועילות דיון רב.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

שם מגיב חברה מספר קטלוגי הערות (אופציונלי)
קרח יבש AGA גז AB לחסום טופס
Isopentane (2-methylbutane) Sigma-Aldrich 277258
CAS: 78-78-4
Cyrostat פתרון הטבעה סאקורה Finetek רקמות Tek 4583
Cryostat Microm Microm דגם HM -500
שקופיות Thermo Scientific פרוסט סופר פלוס
Menzel גלזר
J1800AMWZ
כיסוי משקפיים
בורוסיליקט זכוכית 		VWR הבינלאומי 16004-098 24 x 50 מ"מ
מסנן נייר Munktell סינון AB איכות: 1350
מאמרמספר: 242 001 		430 x 430 מ"מ
3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) Sigma-Aldrich סיגמא מערכת התשתית נוזלי, D7304
ציטוכרום C (סוג III, מהלב סוסים) Sigma-Aldrich C2506
CAS: 9007-43-6
שור Catalase (מהכבד) Sigma-Aldrich C9322
CAS: 9001-05-2
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma-Aldrich N6876
CAS: 298-83-9
נתרן succinate Sigma-Aldrich S2378
CAS: 6106-21-4
Phenazine methosulfate (PMS) Sigma-Aldrich P9625
CAS: 299-11-6 		PMS הוא רגיש לאור. מגן מפני אור.
אזיד הנתרן Sigma-Aldrich S8032
CAS: 26628-22-8
קסילן VWR הבינלאומי EM-XX0060-4
Entellan VWR הבינלאומי 100503-870
Malonate
(חומצה Malonic) 		Sigma-Aldrich M1296
CAS: 141-82-2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Larsson, N. G. Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).
  2. Cottrell, D. A. Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).
  3. Harman, D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial Respiratory FunctionCOX SDH Double labelingHistochemical TechniqueCytochrome C OxidaseSuccinate DehydrogenaseMitochondrial DysfunctionFresh Frozen TissueCryostat SectioningDAB NBT StainingMitochondrial DNA Mutator

Related Articles