Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג'ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
TGF-β יש המתנגדים תפקידים התקדמות סרטן השד על ידי מתנהג כמו מדכאי גידול בשלב הראשוני, אבל מגרה הפלישה גרורות ב 1,2 בשלב מאוחר יותר. יתר על כן, TGF-β הוא overexpressed לעתים קרובות סרטן השד וביטויו בקורלציה עם תחזית גרועה וגרורות 3,4. המנגנונים שבאמצעותם TGF-β גורם הפלישה אינם מובנים היטב.
TGF-β מעורר תגובות הסלולר שלה באמצעות TGF-β מסוג II (TβRII) ואת סוג I (TβRI) קולטנים. עם היווצרות TGF-β-Induced מורכב heteromeric, TβRII phosphorylates TβRI. TβRI מופעל יוזם מסלול איתות תאיים הקנונית שלה על ידי Smads קולטן phosphorylating (R-Smads), כלומר Smad2 ו Smad3. אלה מופעלים R-Smads טופס מתחמי heteromeric עם Smad4, אשר מצטברים בגרעין ולווסת את שעתוק של גני מטרה 5. בנוסף ד בעברמסלול Smad escribed, הפעלת קולטן תוצאות ההפעלה של מספר אי - Smad מסלולים אחרים איתות, למשל Mitogen הופעל חלבון kinase (MAPK) 6 מסלולים.
כדי לחקור את תפקידה של TGF-β בשלבים שונים של סרטן השד, עשינו שימוש במערכת תא MCF10A. מערכת זו מורכבת הנציח ספונטני MCF10A1 (M1) בתאי אפיתל השד 7, הפך את H-M1-RAS נגזרת MCF10AneoT (M2), אשר מייצרת נגעים טרום ממאיר בעכברים 8, ו-M2 נגזרת MCF10CA1a (M4), אשר הוקמה מ xenografts M2 וצורות קרצינומות ציון גבוה עם היכולת ליצור גרורות לריאות 9. סדרה זו MCF10A מציע את האפשרות ללמוד את תגובותיהם של תאים עם דרגות שונות של ממאירות שאינם מוטים על ידי רקע גנטי שונה.
ניתוח הפלישה TGF-β-Induced, אנחנו שנוצר homotypic MCF10A embe תרבויות spheroid תאdded במטריצה קולגן 3D במבחנה (איור 1). מודלים כאלה דומים גידולים אנושיים in vivo על ידי הקמת שיפוע של חמצן וחומרים מזינים, וכתוצאה מכך התאים פעיל פולשני על תאים בחוץ שקט או אפילו נמקי בפנים של 10 spheroid. מבחני מבוסס Spheroid יש גם הוכח בצורה טובה יותר לסכם את עמידות לתרופות מאשר תרבויות monolayer 11. מערכת זו MCF10 מודל 3D אפשרה לנו לחקור את ההשפעה של איתות TGF-β על המאפיינים פולשני של תאים השד בשלבים שונים של ממאירות.
פרוטוקול
1. הכנת התמיסה methocel (500 מ"ל)
- החיטוי 6 גרם של methylcellulose בבקבוק 500 מ"ל המכיל stirrer מגנטי.
- ממיסים את methylcellulose ב 250 מ"ל של DMEM/F12 שחומם מראש ללא בסרום (60 מעלות צלזיוס) במשך 20 דקות.
- מוסיפים 250 מ"ל של DMEM/F12 (RT) המכילה סרום סוס 10%. מערבבים לילה (4 ° C).
- נקה את הפתרון על ידי צנטריפוגה (5000g, 2h, 4 ° C).
- קח את פתרון צמיגה מאוד ברור צינור חדש (כ 90-95% של הפתרון המלאי).
- חנות ב 4 ° C עד השימוש.
2. Spheroid תרבות
- הכן פתרון methocel 20% (10 מ"ל ו - 40 methocel צמיחה בינוני מ"ל).
- שטפו תאים פעמיים עם PBS, להוסיף טריפסין 0.1% ותאי לדגור על 37 מעלות צלזיוס
- Resuspend תאים בינוני צמיחה לספור את התאים.
- הכן השעיה של 10 תאים לכל 000 מ"ל ב methocel 20%.
- מוסיפים את ההשעיה תא 96 תחתית עגולה היטב suspension צלחות (100 μl לכל היטב).
- למחרת, לבדוק את היווצרות spheroid על צלחות ההשעיה. Spheroids יהיה מוכן לשימוש אחרי 1-3 ימים.
3. הכנה של קולגן
- הכן על הקרח פתרון של קולגן 8 מ"ל, 1 מ"ל PBS 10x, 1 מ"ל 0.1 N NaOH ו - 3 טיפות 0.1 N HCl. בדוק אם ה-pH 7.4 ידי תצפית חלק מהפתרון על רצועות אינדיקטור pH. התאם את ה-pH אם מחוץ לטווח.
- הוסף 50 μl של פתרון קולגן לנטרל בבארות של צלחת 96 באר
- לדגור על 37 ° C עד קולגן הוא ביסס (90 דקות).
- הכן methocel-קולגן ליגנד פתרונות על הקרח: עבור כל חלק פיפטה 1 ליגנד של הפתרון קולגן. הוסף 20 ננוגרם לכל מ"ל של קולגן TGF-β. לאחר דילול עם methocel ודיפוזיה על שכבות שונות, הריכוז הסופי של TGF-β יהיה 5 ng / ml מערבבים ידי vortexing. הוסף 1 חלק מהפתרון-methocel. מערבבים ידי vortexing.
4. Spheroid להטביעדינג
- המקום טיפ 200 μl אשר יש כ 5 מ"מ של קצה לחתוך, על פיפטה 200 μl. תמצצי את אחד spheroid עם פיפטה ובזהירות לוותר על המדיום לתוך צלחת ריקה. צפה spheroid אם נשאר בתוך קצה. Spheroid נראה כנקודה לבנה. מבלי לשחרר את הבוכנה, להתחנף 100 תערובת μl קולגן methocel ולחלק spheroid בתערובת הקולגן לתוך מצופה קולגן-96 גם כן. עשו זאת במשך 12 spheroids לכל מצב.
- בואו הקולגן לחזק לפחות 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס
- הסר בועות אוויר עם טיפ 200 μl.
- הוסף 50 μl של המדיום עם סרום 1.6% ו מעכבי מומס DMSO. עבור SB-431542 להוסיף 4 μl של פתרון המניות (10 mM) ל 1 מ"ל של מדיום. לאחר הקניה, את הריכוז הסופי של המעכב יהיה 10 מיקרומטר. TGF-β ו מעכבי יישאר את מהלך הניסוי. צלמו תמונות של spheroids תחת מיקרוסקופ באמצעות הגדלה 40X.
- לאחר 48h של גירוי עם TGF-β ו / או מעכבי, לצלם spheroids תחת מיקרוסקופ באמצעות הגדלה 40X.
- מדוד את השטח של פולשים spheroids אחרי 2 ימים להחסיר את אזור ההתחלה. מדידת שטח של spheroid: פתח את התמונה מן spheroid ב-Adobe Photoshop Extended (דמות 2A) ובחר את הכלי בחירה מהירה (דמות 2B). מצביע העכבר משתנה לתוך מעגל עם 'פלוס' (+) סימן (דמות 2C). בעוד גרירת הסמן מעל spheroid, Photoshop יכירו את גבולות spheroid. אם האזור שמחוץ spheroid נבחר, באזור זה ניתן לשלול מהרשימה על ידי לחיצה על מקש Alt או באמצעות כלי הבחירה השלילית אשר מסומנת על ידי - סימן בסרגל הכלים (). השינויים הסמן לתוך מעגל עם 'מינוס' (-) לחתום על ידי גרירת הסמן מעל האזור הנבחר שלא בצדק, בתחום זה היא להסיר את הבחירה (דמות 2D). אם יש צורך, באזורים מרובים ניתן לבחור על ידי לחיצה על שכפתור IFT. כדי לעבוד בצורה מדויקת יותר, בגודל של מצביע העכבר יכול להיות מותאם על ידי שינוי קוטר המברשת בסרגל הכלים (2E דמות). כאשר spheroid כל נבחרת, אזור הבחירה מחושב דרך למדוד ניתוח בשורת התפריטים או על ידי לחיצה על Ctrl + Shift + M (דמות 2F). חלון ההקלטה מדידה יופיעו מראה את שם הקובץ ואת השטח של הבחירה בפיקסלים, כמו גם נתונים אחרים (דמות 2G). אם בחירות מרובות נמדדים, השורה הראשונה מציגה את הסכום של כל האזורים. המדידות של בחירות הפרט מוצגים קווי להלן. הנתונים של כל המדידות ניתן לייצא לקובץ טקסט ופתח ב-Excel.
5. נציג תוצאות:
דוגמה של assay spheroid עם MCF10A1 (M1) בתאי אפיתל השד נורמלי, הפך H-RAS MCF10AneoT (M2) תאים M2-derived MCF10CA1a (M4) ניתנת באיור 3. תאים M1 הראו רק פלישה חלש ללאגירוי, אבל פלש באופן משמעותי יותר על ידי גירוי TGF-β. לעומת זאת, RAS-טרנספורמציה M1-M2 נגזרת פלשו כבר וביעילות ללא תוספת של גירויים, וזה היה גדל עוד יותר פי 4-5 על טיפול TGF-β. תאים M4 הראה את הפלישה החזק ביותר, עם או בלי תוספת TGF-β.
בשלב הבא, בחנו אם נוכל להפריע הפלישה TGF-β-Induced במודל זה spheroid באמצעות מעכבי כימיים. לשם כך השתמשנו SB-431542, אנלוגי ו-ATP מעכב סלקטיבי של פעילות קינאז של TβRI, כמו גם סוג activin IB קולטן (ActRIB) ו activin קולטן כמו קינאז (ALK) 7 12. כצפוי, SB-431542 potently עכבות TGF-β-Induced הפלישה של M1, M2 ו M4 התאים (איור 4), המציין כי הפלישה TGF-β-Induced הוא TβRI-kinase תלויים. בנוסף, הפלישה הבסיס של spheroids היה גם מאוד עכבות, מה שמראה כי הפלישה הבסיס הוא גם דהתלוי על TGF-β.
1. תרשים זרימה תרשים של assay spheroid 3D. ראשית, התאים הלא מצופה תחת חסיד התנאים u בצורת צלחות השעיות. תאים aggregrate לתוך spheroids multcellular והוא יכול להיות מוטבע לתוך מטריצה קולגן. למטריצה זו קולגן, הם יכולים לפלוש.
באיור 2. כימות שטח של spheroids באמצעות Adobe Photoshop Extended. (א) התמונה של spheroid הוא נפתח לבחירה Adobe Photoshop (ב) Extendend של הכלי בחירה מהירה (C) לגרור את הסמן מעל spheroid כדי לבחור את האזור של להסרת (ד) spheroid אזור כלול wongly באמצעות כלי Quick Selection שלילי (E) התאמת גודל המברשת של הכלי בחירה מהירה יותר מדויק לבחור את האזור (F) בחירה שלמדידה הפקודה להקלטה (G) דוגמה של רשומה המדידה.
באיור 3. TGF-β-Induced הפלישה spheroids של MCF10A1 הונצח באופן ספונטני (M1) (א), RAS-טרנספורמציה MCF10AneoT (M2 (B) נגזרת גרורתי שלה MCF10CA1a (M4) (ג). M1, M2 ו M4 spheroids מוטבע לתוך קולגן טופלו 5ng/ml של TGF-β עבור 48h כמצוין. AC תמונות נציג נלקחה ב יום הטבעה וכעבור יומיים. הפלישה D יחסית היה לכמת כהפרש באזור ביום יום מינוס 2 0. התוצאות באות לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן מעובד מתוך 13.
איור 4. הפלישה spheroid הבסיס, TGF-β-Induced מעוכבת בy SB-431542. Spheroids M1, M2 ו M4 היו מוטבע קולגן שטופלו 5ng/ml TGF-β ו / או 10 מיקרומטר SB-431542, כמצוין. נציג תמונות שצולמו לאחר 2 ימים (א '). הפלישה היתה יחסית לכמת כהפרש שטח ביום יום מינוס 2 0 (B). התוצאות הן כפי שבאה לידי ביטוי ממוצע ± סטיית תקן מעובד מתוך 13.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הקמנו מודל spheroid שבו MCF10A1 תאים ממאירים ונגזרות שלו לפלוש לתוך מטריצה קולגן בצורה TGF-β תלויים. ראשית, spheroids נוצרות 96-בארות ההשעיה בסיבוב צלחות התחתונה בנוכחות methylcellulose. כמובן, גם בצורת U מרובה המה צלחות מצופה יכול לשמש למטרה זו. Methylcellulose דרושה לחלוטין בשלב זה, שכן התאים ימותו בהעדר methylcellulose. TGF-β הוא הוסיף ישירות תערובת קולגן methocel מאז מצאנו כי תאים הגיב פחות טוב את TGF-β, כאשר גורם זה התווסף העליון אופ בינוני של הקולגן. עם זאת, מומלץ להוסיף מ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים.
תודות
אנו מודים קן איווטה (OSI Pharmaceuticals, ניו יורק, ארה"ב) עבור ריאגנטים פרד מילר (ברברה אן Intitute Karmanos סרטן, דטרויט, ארה"ב) על שורות תאים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
| מתיל צלולוזה | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | מתקדם Biomatrix | 5005-B | |
| אינדיקטור pH רצועות | מרק | 9533 | |
| 96, גם השעיה צלחות | גריינר ביו אחד | 650 185 | |
| 96-TC גם הידבקות צלחות | גריינר ביו אחד | 655 180 |
מקורות
- Akhurst, R. J., Derynck, R. TGF-β signaling in cancer--a double-edged sword. Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).
- Massagué, J. TGF-β in Cancer. Cell. 134, 215-215 (2008).
- Ghellal, A. Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma. Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).
- Sheen-Chen, S. M. Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer. Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).
- ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signaling. Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).
- Moustakas, A., Heldin, C. H. Non-Smad TGF-β signals. J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).
- Soule, H. D. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).
- Strickland, L. B. Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers. Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).
- Santner, S. J. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).
- Kobayashi, H. Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).
- Inman, G. J. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).
- Wiercinska, E. The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system. Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).
- Tang, B. TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC. Med. 6, 11-11 (2008).
- Ramaswamy, S. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).
- Lee, G. Y. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).
- Petersen, O. W. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. 30, 256-256 (2011).
- Li, Q. p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. 10, 314-314 (2011).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
