Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Abstract

גירויים חזותיים מזוהים והועברה על פני טווח דינמי רחב של עוצמות אור ושינויים תדירות על ידי נוירונים מתמחים הרשתית החולייתנים. שתי כיתות של נוירונים, קולטני האור ברשתית תאים דו קוטבית, לעשות זאת באמצעות סרט מסוג אזורים פעילים, המאפשרים שחרור הנוירוטרנסמיטר מתמשכת תפוקה גבוהה על פני תקופות זמן ארוכות. על סוג המעורבות דו קוטבית (MB) תא מסופי ברשתית דגי זהב, אשר depolarize לגירויים אור ולקבל מוט מעורבת קלט חרוט photoreceptor, מתאימים ללימוד סרט מסוג סינפסות הן בשל גודל גדול שלהם (~ 10-12 מיקרומטר קוטר) וכן קשרים סינפטיים רבים שלהם לרוחב והדדית עם דנדריטים תא amacrine. גישה ישירה מסופי Mb דו קוטבית תא פרוסות דג זהב רשתית עם טכניקה טלאי-clamp מאפשר מדידת Ca presynaptic ^{2 +} זרמים, קיבול שינויים קרום, משוב הדדי עיכוב סינפטי בתיווכו של GABA <תת> A _ו-C קולטני GABA הביע על המסופים. Presynaptic קיבול הממברנה מדידות של exocytosis לאפשר אחד כדי ללמוד את הפלסטיות לטווח קצר של שחרור הנוירוטרנסמיטר מעוררים ^14,15. בנוסף, גמישות לטווח הקצר ולטווח הארוך של שחרור נוירוטרנסמיטר מדכא מתאי amacrine יכול להיות גם נחקר על ידי הקלטות של עיכוב משוב הדדי להגיע למסוף Mb ^21. במהלך פרקי זמן קצרים (למשל 10 ~ ים), משוב GABAergic עיכוב הדדי מתאי amacrine עובר לזווג הדופק דיכאון דרך דלדול בריכה GABA שלפוחית ^​​11. הדינמיקה הסינפטי של הרשתית microcircuits בשכבת plexiform הפנימי של הרשתית כך ניתן ללמוד באופן ישיר.

הטכניקה המוח פרוסה הוצג למעלה מ 40 שנה אבל הוא עדיין מאוד שימושי עבור חקירת התכונות החשמליות של נוירונים, הן סומה תא בודד, יחיד או דנדריט האקסון, ואת מ 'icrocircuit ברמה הסינפטית ^19. רקמות כי הם קטנים מדי כדי להיות מודבק ישירות על גבי התא חיתוך לעיתים קרובות מוטבעים הראשון אגר (או להציב על גבי נייר פילטר) ופרוסים אז ^{20, 23, 18, ​​9.} בסרטון הזה, אנו מעסיקים את הטכניקה מראש הטבעה אגר באמצעות הרשתית דגי זהב. חלק מסופי ענק דו קוטבית תא פרוסות שלנו הרשתית דגי זהב הם axotomized (האקסון לחתוך) במהלך ההליך חיתוך. זה מאפשר לנו לבודד אחד presynaptic מסוף תשומות עצב, כי הקלטה של ​​מסופי axotomized כולל את האותות מתא סומה, דנדריטים. לחלופין, אפשר גם להקליט מתאי Mb שלמים דו קוטבית, על ידי הקלטה של ​​מסופים המחוברים אקסונים שלא נותקו במהלך ההליך חיתוך. באופן כללי, השימוש בפרוטוקול זה הניסוי יסייעו לימודים של פיסיולוגית הסינפטי ברשתית, ניתוח Microcircuit פונקציונלי, שידור הסינפטי ב סינפסות סרט.

Protocol

1. פתרונות חיצוניים ופנימיים

1. הכן פתרון חיתוך (סידן נמוכה) מפתרון מניות 10x ולהוסיף MgCl _2, CaCl _2, ו-D-גלוקוז יומי. הפתרון הסופי מורכב 1x (מ"מ): 119 NaCl, KCl 2.5, 3.2 MgCl _2, 0.25 CaCl _2, 12 D-גלוקוז, 0.2 L-חומצה אסקורבית, 12 HEPES. הגדר את ה-pH עד 7.4 (עם NaOH), ולהתאים את osmolarity mOsm 260 (באמצעות H ₂ O פתרון מניות 10x).
2. לשקול את 3% אגר gelling בטמפרטורה נמוכה (agarose סוג ז', A0701, Sigma, Rieke, 2001) ומערבבים עם פתרון חותך. מח....

Discussion

שלב קריטי וקשה בפרוטוקול שלנו היא העברת היצירה של הרשתית לתוך הפתרון אגר (פרוטוקול 3.4). יש צורך להסיר בזהירות את ההומור זגוגי פתרון פרוסה שיורית מן היצירה רשתית ולהעביר אותו ללא עיוות או כיפוף. כדי להשיג זאת, אנו משתמשים מרית קטנה (21-401-25B, Fisherbrand) עם קצה כפוף לטופס 90 ° זווית, יחד עם מלקחיים קצה זוויתי (11251-35, כלי המדע פיין), כדי למקם את הרשתית חתיכת לאורך כל תהליך ההעברה פתרון פרוסה. פתרון שיורית פרוסה על פרוסת את המרית הרשתית ניתן להסיר על ידי להיזה.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
אגר gelling בטמפרטורה נמוכה	סיגמא	A0701	Agarose סוג ז'
תיקון פיפטה	העולם מכשירים Precision	1B150F-4	חומה עבה (1.5 מ"מ קוטר חיצוני) בורוסיליקט זכוכית
אנכי חולץ	Narishige	PP830
שיניים שעווה	Cavex
האביב מספריים	המדע כלים פיין	15003-08
45 ° זווית מלקחיים קצה קנס	המדע כלים פיין	11251-35
להב התער	Personna		פיפיות, לנקות עם 70% אתנול ו - H 2 O
גלילי צינור	Fisherbrand	03-338-1B	מדגם פוליאתילן בקבוקונים 2.5 מ"ל
Hyaluronidase	סיגמא	H6254
Vibratome מבצעה	לייקה	VT1000S או VT1200S
זקוף מיקרוסקופ	אולימפוס	BX51WI
המטרה 60x מים טבילה	אולימפוס	LUMPlanFl	NA 0.90
מצלמת CCD	סוני	XC-75
מצלמה בקר	Hamamatsu	C2400
צג	סוני		13 "שחור ולבן לפקח
מזרק מסנן	Nalgene		0.2 מיקרומטר
Micromanipulator	סאטר Instrument	MPC-200
Lock-in amplifier	HEKA		EPC-9/10 מגברים יש תוכנת אמולציה
ספינינג לייזר דיסק confocal מיקרוסקופ	Yokogawa	CSU-X1	הדמיה תא חי לאחר תיקון מהדק הקלטה התא כולו
Slidebook תוכנה	Intelligent הדמיה מכשירים (3i)		הדמיה וניתוח נתונים הרכישה
Paraformaldehyde	סיגמא	P6148
פוספט חיץ פתרון	GIBCO	70013
Superfrost שקופיות	פישר סיינטיפיק		שקופיות הזכוכית
נגד דהייה סוכנים	Biomeda קורפ.
Confocal מיקרוסקופ לייזר סורק	Carl Zeiss	LSM 710	הדמיה של רקמות קבוע
מרית	Fisherbrand	21-401-25B
מנואל אנכי מבצעה	Narishige	ST-20
אורגון גרין 488 BAPTA-1	Invitrogen	O-6806	Ca 2 + צבע פלואורסצנטי רגיש
אלקסה פלואוריד 555 Hydrazide	Invitrogen	A-20501MP	פלורסנט צבע