נוירונים בוגרים שנולדו של הנורה חוש הריח יכול להיות נשלט באמצעות optogenetically Channelrhodopsin2-לבטא הזרקת lentiviral בזרם נודדות מקורי ו photostimulation כרונית עם מיניאטורי מושתל LED.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי
במאמר זה
סיכום
תקציר
Interneurons מקומיות מחדש ברציפות הנורה חוש הריח של מכרסמים הבוגרת 1-3. בתהליך זה, הנקרא neurogenesis למבוגרים, בתאי גזע עצביים בקירות החדר לרוחב להצמיח neuroblasts הנודדים של מילימטרים אחדים לאורך הנחל נודדות מקורי (RMS) כדי להגיע לשלב לתוך הנורה חוש הריח. כדי לחקור את השלבים השונים ואת ההשפעה של שילוב בוגרים שנולדו לתוך נוירון preexisting מעגלים חוש הריח, יש צורך סלקטיבי התווית לתפעל את הפעילות של האוכלוסייה הספציפי הזה של נוירונים. ההתפתחות האחרונה של optogenetic טכנולוגיות מציעה את ההזדמנות כדי להשתמש באור כדי להפעיל את זה בדיוק קבוצה ספציפית של נוירונים מבלי להשפיע על נוירונים סביב 4,5. כאן, אנו מציגים סדרה של נהלים virally להביע Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP במדגם מוגבלת temporally של neuroblasts ב RMS לפני שהם מגיעים הנורה הריח ולהיות מבוגר יליד נהurons. בנוסף, אנו מראים כיצד לכייל את השתל מיניאטורי LED עבור כרונית גירוי vivo של ChR2-לבטא נוירונים.
פרוטוקול
1. Stereotaxic זריקות
- הווירוס השתמשו בניסויים אלו הוא וקטור שכפול מחסר lentiviral מבוסס על נגיף ה-HIV להביע Channelrhodopsine2-YFP (חלבון פלואורסצנטי צהוב) היתוך לבנות מונע על ידי מקדם synapsin 6. הפלסמיד נמסר בנדיבות על ידי ק Deisseroth של קבוצת המחקר ( http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Lentiviruses ניתן להשיג ממקורות מסחריים או המיוצר במעבדה על פי פרוטוקולים הוקמה 7. Titers ממוצע וקטור היו בסדר גודל של 10 10 יחידות התמרה / ml. Aliquots ויראלי מאוחסנים ב -80 ° C ויש מופשר רק לפני טעינת פיפטה. ריבוי להקפיא / להפשיר מחזורים יש להימנע. לעולם החשיפה וירוס הפתרון ישירות קרח יבש.
- הכן pipettes זכוכית באמצעות בורוסיליקט זכוכית נימים על תקן פיפטה חולץ (סאטר Pחולץ -97 פיפטה). הגדרת משיכת צריך להיות מכויל כראוי להניב פיפטה ארוך ונוקשה. בשלב הבא, לחתוך את קצה פיפטה בעזרת זוג מספריים כדי לקבל טיפ של 30-40 מיקרומטר קוטר. חנות משך pipettes בקופסה אבק חינם.
- ההתקנה השנייה Nanoject microinjector עם הוראות היצרן עבור משלוח של 50 NL. הכן את פיפטה הזרקת ידי גב עם מילוי שמן מינרלי הכנס אותו על הבוכנה microinjector. צרף את microinjector למסגרת stereotaxic. שמן ריק חלקית מן פיפטה הזכוכית לפני מילוי עם פתרון וירוס
- עם micropipette, להעביר 2 μl של פתרון וירוס על גבי פיסת סטרילית של Parafilm. בעדינות להוריד את פיפטה זכוכית לתוך ירידה של פתרון וירוס ולמלא את פיפטה עם μl 1-2. ודא שאין בועות אוויר בתוך פיפטה.
- הרדימי עכבר עם קטמין מ"ג / ק"ג 100 ו 10 מ"ג / ק"ג Xylazine, בדילול מלא מלוחים סטרילית. הסר את השיער מהקרקפת שלבעלי חיים באמצעות קוצץ מכרסם, גילוח, מספריים, או depilitory סוכן כימיים. לחטא את הקרקפת עם שלושה יישומים לסירוגין 70% אתנול ו בבטאדין. כל מכשירי ניתוח צריך להיות גם autoclaved וחיטוי מכן עם 70% אתנול. מניחים את חיה בתוך מסגרת stereotaxic במוטות האוזן בר האף, והבטיח כי הראש הוא מאובטח. החל משחה העין כדי למנוע התייבשות של הקרניות.
- עם אזמל, לחתוך את הקרקפת מ בין העיניים אל בין האוזניים. משוך את העור בצד לחשוף את הגולגולת לעגן את העור עם זוג מלחציים. נקו את פני השטח של הגולגולת. מנגנון stereotaxic הוא התביית עם קצה פיפטה זכוכית גבחת. אז הטיפ ממוקמת במקום ההזרקה (Antero-Posterior, 3.30; מדיו-Lateral, ± 0.82, עבור שני חצאי ימין ועל שמאל, בהתאמה). המיקום של הבר האף צריך להיות מותאם על פי חישוב הקואורדינטות stereotaxic. בניסוי שלנו, בר האף מותאם until גבחת ואתר הזרקת מיושרות באותו גובה.
- זהה את ההזרקה. באמצעות מקדחה במהירות גבוהה כירורגי, בזהירות לקדוח חורים לתוך הגולגולת. עם מחט מזרק כפוף המעוקל בקצהו, להסיר שאריות של עצמות דק לחשוף את דורה מאטר. בדוק את החור מרוכז במיקום הנכון. הקפד לא כלי הדם הקרע על פני השטח של המוח בזמן הקידוח. אם כלי הדם הם מקרע, לחצו בעדינות על פני השטח של המוח עם ניצן כותנה רקמה קטנה או למשך מספר שניות עד זרימת הדם נפסקת.
- מנמיכים את פיפטה ואפס את גובה הגחון Dorso, כאשר קצה פיפטה נוגע פני השטח של המוח. ואז, נמוך יותר לעומק הנכון Dorso-הגחון (Dorso-הגחון, 2.9 ממשטח המוח) ולחכות 30 שניות על שיווי משקל הלחץ. להזריק 4 פעמים 50 nl של וירוס עבור סכום כולל של 200 nl. המתן 30 שניות בין כל הזרקה.
- דקה אחת לאחר הזריקה האחרונה, לאט למשוך את הצינורTTE. חזור על 1.6-1.8 נקודות עבור חצי הכדור השני. הסר את החיה מן המנגנון stereotaxic, לנקות את החתך תפר לחתוך את העור באמצעות ניתוח האשכולות. אפשר החיה להתאושש על כרית חימום לפני החזרה לכלוב. בנוסף, חיות אפשר לתת סטרואידיות נוגדות דלקת משכך כאבים (למשל, Carprofen 4mg/kg) מיד לאחר ו 3 ימים לאחר הניתוח.
2. ההשתלה LED כרונית שכן גירוי optogenetic vivo ב הנורה חוש הריח
- בעלי חיים הזריקו חלקיקים lentiviral בילטרלי הבא הם מושתלים כרוני עם LED כחול מיניאטורי (Osram, CMS 4.6W LED כחול). הלחמה הפינים LED למחבר נקבה חשמלי מיניאטורי כך מחבר ממוקם בצד השני של ה-LED. בדוק כי אין לקצר חשמלי לזהות את הסיכה חיוביות ושליליות על המחבר. מבחן ה-LED על ידי חיבורו בקר הנוכחית LED כי כבל מתאים.
- כדי למדוד ו / או להגדיר את כוח האור המוחלט של ה-LED, הר LED על micromanipulator לבין עמדת LED במגע ישיר עם photodetector של מד הכוח של עוצמת אור לשיא של 470 ננומטר. מקדחה חריר בקוטר של 3 מ"מ לוח PVC אטום. להטביע זה חריר למונה החשמל לבנות עקומת תקן של כוח אופטי לעומת קלט הנוכחי כדי לחשב את כוח לכל מ"מ 2.
- כדי למדוד את התפשטות האור דרך המוח, לחתוך בלוקים של רקמת המוח הטרי של 300, 500, 1000, 1500 ו 2500 עובי מיקרומטר 0-4 מעלות צלזיוס ACSF באמצעות 14 vibratome. מניחים פיסת הגולגולת עם craniotomy זהה לזה שבוצע בעכברים לחיות תחת ה-LED. ראשית, למדוד את כוח האור בלי רקמות התרכזו LED. ואז, במקום כל בלוק של רקמות בין LED לבין photodetector של מד כוח, למדוד את הכוח. בנה עקומה של עובי רקמת לעומת חלק יחסי הילוכים, מחושב כיחס ביןבין הכוח נמדד דרך רקמות וללא רקמות.
- הרדימי עכבר עם קטמין מ"ג / ק"ג 100 ו 10 מ"ג / ק"ג Xylazine, בדילול מלא מלוחים סטרילית. לנקות ולחטא ה-LED עם אתנול 70%. הסר את השיער מהקרקפת של החיה ולחטא את הקרקפת עם שלושה יישומים לסירוגין אתנול 70% ו בבטאדין. אז במקום חיה בתוך מסגרת stereotaxic. החל משחה העין כדי למנוע התייבשות של הקרניות. חבר את מחבר בעל stereotaxic. המיקום של הבר האף צריך להיות מותאם עד פני השטח של הגולגולת מעל הנורה חוש הריח הוא אופקי לחלוטין מקביל פני השטח של מיניאטורית ה-LED.
- עם אזמל, לחתוך את הקרקפת של 3 מ"מ קדמי על העיניים 3 מ"מ האחורי של האוזניים. משוך את העור בצד לעגן אותה עם זוג מלחציים. לגרד ממנו את הקרומים על פני השטח של הגולגולת באמצעות סכין גילוח. נקי ויבש את הגולגולת. החלת כיסוי דקה של דבק cyanoacrylate לאפשר מודעות עוקבותhesion של אקריליק שיניים.
- באמצעות מקדחה במהירות גבוהה כירורגי, לבצע craniotomy מלבני (1 מ"מ הזנב ו 3 מ"מ לרוחב, התרכזו 5.1 מ"מ הזנב, 0 מ"מ לרוחב מן גבחת) על נורות חוש הריח. כדי לעשות זאת, דק בזהירות את הגולגולת עד שרק שכבה דקה של עצם נשאר. מוציאים בזהירות את העצם הנותר בעזרת מחט מזרק כפופות. טיפול מיוחד צריך לקחת כדי למנוע ניקוב העניין הדורה ו פקיעת כלי הדם העיקריים העומדים בין שתי ההמיספרות ועל הגבול הזנב של נורות חוש הריח. הצטברות דם קרישה על פני המוח מונע חדירת אור אופטימלי לרקמת. שוטפים את craniotomy ואת פני השטח של המוח עם תמיסת מלח סטרילית ולאחר מכן לייבש את הגולגולת.
- צרף את מיניאטורי LED למחבר. מנמיכים את מיניאטורי LED בחלק העליון של הנורות חוש הריח. הציר המרכזי של ה-LED זעירות צריך להיות מקביל לציר מקורי, הזנב של העכבר, נקו עם מי מלח סטרילית דר"י גולגולת. ואז להבטיח את LED לגולגולת בשכבה הראשונה של אקריליק (מלט כלומר, polycarboxylate), ואחריו שכבה שנייה של אקריליק שיניים. התוספת של שני ברגים קטנים עשויים להידרש לתקן את LED. ברגים צריך להיות מוכנס על הגולגולת (האחורי לעמדת LED) ומכוסים אקריליק שניהם. בעוד אקריליק עדיין נוזלי, משוך לאחור דבק את הקצוות חינם של הקרקפת על פני השטח של אקריליק שיניים. הקפד לא חלים כל אקריליק על המחבר. לאחר אקרילי יש מוקשה, להסיר את החיה מן המנגנון stereotaxic ולתת לו להתאושש על כרית חימום לפני החזרה לכלוב. בעלי חיים נותרים מבודדים בתוך הכלוב שלהם להתאושש מהניתוח לפחות שבעה ימים. בנוסף, חיות אפשר לתת סטרואידיות נוגדות דלקת משכך כאבים (למשל, Carprofen 4mg/kg) מיד לאחר ו 3 ימים לאחר הניתוח. נוריות יש לבדוק לפני ההשתלה לאחר סיום הניסויים.
- אור electrical כבל משמש לקשור את בעל החיים בקר הנוכחית LED מצמידים את הגנרטור דופק (Master-8) כדי לשלוט על התזמון והעוצמה של ה-LED. כבל דק מאפשר חופש מוחלט של תנועה. תשמרי לכבד את הקוטביות של המחבר. היפוך קוטביות עשוי לשבור את LED.
3. נציג תוצאות:
ChR2-YFP מתבטא transduced נוירונים כ 48 שעות לאחר ההזרקה, ונשאר יציב במשך מספר חודשים 7. איור 1 הוא תמונה מייצגת של קטע sagittal של חיה paraformaldehyde-קבוע של 15 ימים לאחר ההזרקה. שים לב תיוג צפוף בגודל של הזריקה ב-RMS. מספר גדול של תאים שזה עתה נולד היגרו לאורך RMS ליישב את השכבות השונות של הנורה חוש הריח (איור 1). החלבון היתוך מתבטא כל נוירון תאים, כולל סומה, דנדריטים, ואת עמוד השדרה.
מיניאטורות LED impla ntation מאפשר בקנה מידה גדול גירוי אופטי זול של אזור רחב של עניין. בעל חיים הוא קשור בקר ה-LED עם כבל חשמל אור המאפשר חופש מוחלט של תנועה. על ידי אפיון דיפוזיה אור רקמת המוח ואת סף של הפעלת ChR2, אנו מעריכים כי הפעלת אופטי יכול להיות מופעלות בעומק של ~ 2 מ"מ מתחת לפני השטח של ה-LED (איור 2A). כדי לפקח על הפעלת תפקודית של ChR2-in vivo להביע עצב, ביטוי של c-פוס, סמן של הפעילות העצבית, ניתן לנתח לאחר גירוי אור חוזר (איור 2 ב). כחלופה, בהקלטות חוץ גופית של אלקטרו ChR2-לבטא נוירונים מצמידים את גירוי האור מוקד יכול להתבצע 14. לבסוף, שני הפוטונים ממוקד רופף, תיקון הקלטות שימשו במחקר הפעלה תפקודית של ChR2-לבטא נוירונים בקליפת המוח על ידי מיניאטורי דומה LED in vivo 9.
ntent ">
באיור 1. ChR2-YFP ביטוי מן lentiviral הזרקה לתוך זרם נודדות מקורי. תמונות confocal נציג קטעים saggital של הנורה חוש הריח של העכבר 15 ימים לאחר זריקות של lentivirus ב RMS מקורי. הערה נוכחות מפוזרים נוירונים היילוד YFP נודדות מקצה ה-RMS של שכבות שונות של OB. רוב התאים היילוד (95%) הם תאים גרגיר, אשר שקר סומה בשכבת גרעין התא (GCL) ו דנדריטים arborize בשכבת Plexiform חיצוני (EPL). אוכלוסייה קטנה של נוירונים היילוד להעביר עד השכבה השטחית ביותר של OB, על שכבת גלומרולרי (GL). סרגל קנה מידה, 100μm. הגדלה הבלעה, גבוה של תא גרגר היילוד, מראה את הביטוי של קרום ChR2-YFP ב הדנדריטים וגם קוצים. סרגל קנה מידה, 20μm.
באיור 2. תרשים של מושתל LED בחלק העליון של הנורה חוש הריח ואת אור עורר c-Fos ביטוי ChR2-YFP להביע תאים גרעין חדש.
ציור סכמטי של ה-LED מושתל מעל נורות חוש הריח.
B, תמונות confocal נציג מראה פעמיים שכותרתו ChR2-YFP + c-Fos + תאים גרגיר כשעה לאחר גירוי האור של הנורה חוש הריח. C-Fos הביטוי מתגלה באמצעות אנטי c-Fos ארנבת הנוגדן הראשוני (Calbiochem, 1:5000) ו-A568 מצומדות נגד ארנב נוגדנים משני (Invitrogen, 1:1000). סרגל קנה מידה, 10μm.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כלים Optogenetic הגדילו לאחרונה השליטה שלנו באוכלוסיות עצביות סלקטיבית, כולל נוירונים נולד מבוגר במערכת ההרחה. כאן אנו מתארים כיצד לבצע הזרקה stereotaxic של וקטור lentiviral להביע ChR2-YFP באוכלוסייה ספציפית של מבוגר יליד נוירונים. על ידי בקפידה ניטור בתקופה שלאחר הזריקה, אנו מסוגלים לנתח ולטפל הפעילות של דור של מבוגרים, יליד נוירונים עם הגיל הומוגנית יחסית.
בגלל התפשטות דיפוזיה נמוכה שלהם, יעילות התמרה גבוהה שלה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי חברת ביטוח החיים "Novalis-Taitbout", Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), את Agence Nationale de la משוכלל ונדיר "ANR-09-NEUR-004" במסגרת של "נוירון ERA-NET" של FP7 התוכנית על ידי הנציבות האירופית, "קרן לשפוך la משוכלל ונדיר Medicale", קרן Letten וקרן פסטר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חומר | חברה | מספר קטלוגי | |
| קטמין | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer בריאות | Rompum 0.2% | |
| פיפטה פולר | סאטר | P-97 | |
| זכוכית נימים (3.5 ") | דראמונד מדעי | 3-000-203-G / X | |
| Nanoject II Microinjector | דראמונד מדעי | 3-000-204 | |
| מהירות גבוהה מקדח כירורגי | המדע כלים פיין | 18000-17 | |
| פלדה מיקרו מקדחה קוצים 0.7mm קוטר קצה | המדע כלים פיין | 19008-07 | |
| LED כחול CMS 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| מחבר חשמל נקבה (2.54 מ"מ) | פישר Elektronik | BL5.36Z | |
| בקר מקומי עבור LED (מקסימום: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| דופק גנרטור | AMPI | Master-8 | |
| כוח אופטי מטר | Thor Labs | PM100 | |
| Cyanoacrylate דבק | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate מלט (צמנט השכבה הראשונה) | Septodont | Selfast (# 0068Q) | |
| Methacrylate מלט (צמנט שכבה שנייה) | GC InternationalCorp. | Unifast טראד - נוזלי (# 339292) Unifast טראד - פאודר (# 339114) | |
| Carprofen | פייזר | Rimadyl |
מקורות
- Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ. J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).
- Mouret, A. Learning and survival of newly generated neurons: when time matters. J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).
- Bardy, C. How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).
- Haubensak, W. Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear. Nature. 468, 270-276 (2010).
- Zhang, F. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature protocols. 5, 247-254 (2010).
- Huber, D. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature. 451, 61-64 (2010).
- Arenkiel, B. R. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 Forthcoming.
- Albeanu, D. F. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).
- Slotnick, B., Bodyak, N. Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs. J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons. J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
