ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

Stacy L. Gelhaus; A. Clementina Mesaros; Ian A. Blair

doi:10.3791/3399

מאמר שיטה

ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

DOI:

10.3791/3399

⸱

17 בנובמבר 2011

Stacy L. Gelhaus¹^,² , A. Clementina Mesaros¹^,² , Ian A. Blair¹^,²

¹Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania , ²Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה ידגים מיצוי וניתוח של חומצות שומן ביו-אקטיביות חופשיות ואסטריות מהתאים. חומצות שומן מכומתות במדויק באמצעות דילול איזוטופים יציב, כרומטוגרפיה נוזלית כיראלית, לכידת אלקטרונים, יינון כימי אטמוספרי, ספקטרומטריית מסה לניטור תגובות מרובות (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חילוף החומרים של חומצות שומן, כגון חומצה ארכידונית (AA) וחומצה לינולאית (LA), מביא להיווצרות שומנים ביו-אקטיביים מחומצנים, כולל סטריאואיזומרים רבים^1,2. מטבוליטים אלה יכולים להיווצר מחומצות שומן חופשיות או אסטריות. לרבים מהמטבוליטים המחומצנים הללו יש פעילות ביולוגית והם היו מעורבים במחלות שונות כולל מחלות לב וכלי דם ומחלות ניווניות, אסטמה וסרטן^3-7. שומנים ביו-אקטיביים מחומצנים יכולים להיווצר באופן אנזימטי או על ידי מיני חמצן תגובתיים (ROS). אנזימים המבצעים חילוף חומרים של חומצות שומן כוללים ציקלואוקסיגנאז (COX), ליפוקסיגנאז (LO) וציטוכרומים P450 (CYPs)^1,8. מטבוליזם אנזימטי מביא להיווצרות אננטיוסלקטיבית ואילו חמצון ROS מביא להיווצרות רצמית של מוצרים.

בעוד שפרוטוקול זה מתמקד בעיקר בניתוח של AA- וכמה מטבוליטים ביו-אקטיביים שמקורם בלוס אנג'לס; ניתן ליישם אותו בקלות על מטבוליטים של חומצות שומן אחרות. ליפידים ביו-אקטיביים מופקים מליזאט תאים או ממדיה באמצעות מיצוי נוזל-נוזלי (L-l). בתחילת תהליך מיצוי l-l, מתווספים תקנים פנימיים של איזוטופים יציבים כדי לקחת בחשבון שגיאות במהלך הכנת הדגימה. דילול איזוטופים יציב (SID) מסביר גם את כל ההבדלים, כגון דיכוי יונים, שמטבוליטים עשויים לחוות במהלך ניתוח ספקטרומטריית המסה (MS)⁹. לאחר המיצוי, נגזרת עם מגיב לכידת אלקטרונים (EC), נעשה שימוש בפנטפלואוריל בנזיל ברומיד (PFB) כדי להגביר את רגישות הגילוי^10,11. ניטור תגובות מרובות (MRM) משמש להגברת הסלקטיביות של ניתוח MS. לפני ניתוח טרשת נפוצה, שומנים מופרדים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית כיראלית עם ביצועים גבוהים (HPLC). תנאי ה-HPLC מותאמים להפרדת האננטיומרים והסטריאואיזומרים השונים של השומנים המנוטרים¹². שיטת LC-MS ספציפית זו מנטרת פרוסטגלנדינים (PGs), איזופרוסטנים (isoPs), חומצות הידרוקסיאיקוסאטטראנואיות (HETEs), חומצות הידרוקסיאוקטדקדינואיות (HODEs), חומצות אוקסואיקוסאטטראנואיות (oxoETEs) וחומצות oxooctadecadienoic (oxoODEs); עם זאת, ניתן לבצע אופטימיזציה של הפרמטרים HPLC ו-MS כך שיכללו כל מטבוליטים של חומצות שומן¹³.

רוב השיטות הביואנליטיות הקיימות כיום אינן לוקחות בחשבון את הכימות הנפרד של אננטיומרים. זה חשוב ביותר כאשר מנסים להסיק אם המטבוליטים נוצרו באופן אנזימטי או על ידי ROS. בנוסף, היחסים של האננטיומרים עשויים לספק ראיות למסלול היווצרות אנזימטי ספציפי. השימוש ב-SID מאפשר כימות מדויק של מטבוליטים ומביא בחשבון כל אובדן דגימה במהלך ההכנה וכן את ההבדלים שחווים במהלך היינון. שימוש במגיב לכידת אלקטרונים PFB מגביר את רגישות הזיהוי בשני סדרי גודל בהשוואה לשיטות APCI קונבנציונליות. בסך הכל, שיטה זו, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, היא אחת השיטות הרגישות, הסלקטיביות והמדויקות ביותר לכימות של שומנים ביו-אקטיביים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תערובות סטנדרטיות סטנדרטיות ופנימיות

לפני מיצוי השומנים יש להכין תערובת סטנדרטית (SM) ותערובת סטנדרטית פנימית (ISM). עבור ה-SM, ציטט את הנפח המקביל של 1 מיקרוגרם מכל תקן (25 סה"כ) המפורט בטבלת הריאגנטים שלהלן, באמצעות מזרק מכויל, לבקבוק נפח של 10 מ"ל. לייבש את התקנים תחת חנקן ולהרכיב מחדש ב-10 מ"ל אצטוניטריל (ACN). הריכוז הסופי של התערובת הסטנדרטית יהיה 100 pg/μL. מחלקים ל-1 מ"ל ושומרים ב-80 מעלות צלזיוס עד הצורך.
מתמהיל סטנדרטי זה, ניתן לבצע 6 דילולים סטנדרטיים בסך הכל 7 תקני כיול (1 pg/μL, 2 pg/μL, 5 pg/μL, 10 pg/μL, 20 pg/μL, 50 pg/μL ו-100 pg/μL). תקנים אלה אמורים להיות מופעלים עם כל אצווה של דגימות שהוכנו לפיתוח עקומת הכיול המשמשת בניתוח כמותני.
עבור ה-ISM, ציין את הנפח השווה ערך של 1 מיקרוגרם מכל IS (14 בסך הכל) המפורט בטבלת הריאגנטים למטה לבקבוק נפח של 10 מ"ל, באמצעות מזרק מכויל, וייבש תחת חנקן. הרכיבו מחדש את ה-ISM ב-10 מ"ל של ACN וחלקו ל-1 מ"ל. הריכוז הסופי של ה-ISM צריך להיות 100 pg/μL. יש מספיק ISM כדי לעבד 1000 דגימות.
אחסן את ה-SM וה-ISM ב-80 מעלות צלזיוס.

2. אוסף מדיה וליזאט תאים

עבור כל צלחת של 10 ס"מ של תאים דבקים (~ 1 X 10⁷), אסוף 3 מ"ל מדיה בצינור צנטריפוגה מזכוכית של 10 מ"ל. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים במי מלח חוצצים פוספט (PBS). הוסף 1 מ"ל PBS לצלחת וגרד את התאים מהצלחת ופינט לצינור צנטריפוגה שני מזכוכית של 10 מ"ל. בשלב זה ניתן לאחסן תאים ומדיה אם ההליך לא יימשך בשלב זה. אחסן דגימות ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך או ב-20 מעלות צלזיוס למשך פחות משבוע.

3. מיצוי שומנים ממדיה

שומנים ביו-אקטיביים חופשיים נמצאים במדיה התאית וניתן לחלץ אותם בקלות בהליך מיצוי L-L בשלב אחד. למדיה שנאספה (2.1), הוסף 10 מיקרוליטר של ISM. בשלב זה, יש לסמן 8 צינורות צנטריפוגה נוספים מזכוכית של 10 מ"ל #0-7 לתקני הכיול. הוסף 3 מ"ל PBS לכל אחד מהצינורות הללו ולאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של ה-SM המתאים לצינורות 1-7 (1-7 מ-1.1).
אפשר ל-ISM לאזן בכל תקן כיול ולדגום למשך 10 דקות ולאחר מכן להוסיף 5 מ"ל של אתר דיאתיל. לאחר מכן הדגימות ותקני הכיול מונחים בשייקר במהירות נמוכה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הטלטול, כל תקני הכיול והדגימות עוברים צנטריפוגה ב-1935 x גרם למשך 10 דקות. לאחר מכן, בעזרת פיפט פסטר, העבירו את השלב העליון (אורגני) לצינור צנטריפוגה זכוכית חדש של 10 מ"ל וייבשו תחת חנקן.

4. מיצוי ליפידים מליזאט תאים

סובב את דגימות התאים בצינורות הצנטריפוגות מזכוכית ב-1935 X g למשך 5 דקות. להיפטר מהסופרנטנט; הוסף 2 מ"ל PBS לכל צינור, ומערבולת קצרה. הסר 25 מיקרוליטר של דגימה לכימות חלבון. החלבון הכולל ישמש לנורמליזציה של ליזאט תאים.
לאחר מכן, העבירו מחצית מתערובת הליזאט/PBS לצינור צנטריפוגה מזכוכית נפרד של 10 מ"ל. הוסף 2 מ"ל נוספים של PBS יחד עם 10 מיקרוליטר ISM לכל דגימה. עקוב אחר תהליך חילוץ l-l המתואר עבור מדיה ב-3.2 ו-3.3. אליקוט זה ישמש למדידת שומנים חופשיים בתאים ומניעת פירוק אלקליין של שומנים, כגון הפרוסטגלנדינים. אליקוט זה לא יעבור את שלבים 4.3 ו-4.4 המתוארים להלן.
השלב הראשון בתהליך מיצוי השומן האסטרי l-l דורש תוספת של 5 מ"ל של CHCl₃/MeOH (2:1) לכל אחת מהדגימות. הדגימות מוגדרות בשייקר במהירות נמוכה למשך 30 דקות. לאחר הטלטול, הדגימות עוברות צנטריפוגה בטמפרטורה של 1935 x גרם למשך 10 דקות. לאחר מכן, בעזרת פיפט פסטר, העבירו את השכבה התחתונה (האורגנית) של מיצוי l-l לצינור צנטריפוגה זכוכית חדש של 10 מ"ל וייבשו את הדגימה תחת חנקן.
יש לסבון שומנים אסטריים לפני הכמות. לאחר שהדגימות יבשות, הוסף 0.5 מ"ל של 0.4N KOH ב-80% MeOH לכל צינור. לאחר מכן הדגימות מודגרות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר הדגירה מוסיפים 2 מ"ל PBS. התאימו את ה-pH ל-6 עם חומצת HCl מרוכזת (~30 מיקרוליטר). הוסף 10 מיקרוליטר של ISM לכל דגימה. שאר ההליך זהה למיצוי שומנים ממדיה וניתן לבצע אותו ב-3.2 ו-3.3.
אם מיצוי זה מופעל במקביל לדגימות המדיה, ניתן להשתמש באותם תקני כיול כדי לפתח עקומת כיול; עם זאת, אם דגימות אלו מופעלות במועד אחר, יש לעבד גם תקני כיול כמתואר ב-3.1-3.3.

5. נגזרת פנטפלואוריל בנזילברומיד (PFB)

לדגימות המיובשות ולתקני הכיול, הוסף 100 מיקרוליטר של דיכלורומתאן נטול מים (CH₂Cl₂) ואחריו 100 מיקרוליטר של 20% (v/v) N,N-diisopropylethylamine ב-CH₂Cl₂ נטול מים, ולבסוף 100 מיקרוליטר של 20% (v/v) PFB ב-CH₂Cl₂ נטול מים.
לאחר הוספת ריאגנטים לנגזרות, הדגימות עוברות מערבולת, מודגרות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה ומיובשות תחת חנקן. הדגימות ותקני הכיול עשויים להיות מאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס אם הם לא מנותחים מיד או ב-20 מעלות צלזיוס עד שבוע.

6. דילול איזוטופ יציב כרומטוגרפיה נוזלית כיראלית לכידת אלקטרונים ניתוח ספקטרומטריית מסה יינון כימי בלחץ אטמוספרי (SID-LC-ECAPCI-MS)

הדגימות המיובשות ותקני הכיול משוחזרים ב-100 מיקרוליטר של הקסאן/אתנול (97:3). לאחר מכן ניתן להעביר את הדגימה כולה לבקבוקון HPLC עם תוספת. הנח את הדגימות בדגימה האוטומטית המצוננת (4 מעלות צלזיוס) וצור רשימת דוגמאות לניתוח.
לאחר מכן, הגדר את שיטות HPLC ו-MS באמצעות הפרמטרים המתוארים בטבלה 1 ובטבלה 2 להלן. טבלה 3 מכילה מידע מורכב ספציפי, כולל אנרגיית המעבר וההתנגשות של MRM (CE) עבור כל ליפיד וכן זמן השמירה המשוער מניתוח Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra. ה-CE נקבע על ידי כוונון כל ליפיד בודד במהלך פיתוח השיטה.
עמוד Chiralpak AD-H (4.6 X 250 מ"מ, 5 μ) המחומם ל-30 מעלות צלזיוס משמש להפרדת הפאזה הרגילה. השלב הנייד ההתחלתי הוא 98% הקסאן ו-2% מתנול/איזופרופנול (1:1). לאחר הפרדת ה-HPLC, מתווסף מתנול לאחר העמודה (0.75 מ"ל/דקה) כדי למנוע שקיעה על מחט הקורונה שתגרום לירידה ברגישות. ה-MS מוגדר במצב יונים שליליים באמצעות מקור APCI. אם יש צורך לשנות את המקור מ-ESI ל-APCI, הקפד להכניס מחט קורונה.
הדגימה הראשונה שיש להריץ היא תמיד ריק הקסאן. זה יאזן את העמודה וגם יגלה אם יש זיהום כלשהו בעמודה שעלול להפריע לתקן הכיול ולניתוח הדגימה.
הדגימות הבאות צריכות להיות דגימות תקן הכיול בסדר של 0-7 (הגדלת ריכוז SM). תקנים אלה ישמשו ליצירת עקומת כיול המכילה את היחס בין שטח סטנדרטי/שטח IS על ציר ה-y והריכוז או המסה הסטנדרטיים על ציר ה-x. מהמשוואה y = mx + b הנגזרת מתרשים זה, ניתן להשתמש ביחס בין שטח הדגימה / שטח IS (y) כדי לקבוע את כמות הדגימה (לא ידועה) או הריכוז (x).
ניתן לנרמל את כמות השומנים הביו-אקטיביים המצויים במדיה לנפח הכולל של המדיה וניתן לנרמל את כמות השומנים המצויים בליזאט התא למספר הכולל של תאים/צלחת או לכמות החלבון/צלחת הכוללת. יש לנקוט באמצעים במהלך 4.1 של הפרוטוקול כדי להבטיח שתאים נספרים או שהחלבון מכומת.

7. תוצאות מייצגות:

הכרומטוגרמות באיור 1 מייצגות פרופיל ליפידומיקה ממוקד. הפאנל הראשון (איור 1A) מראה 13 ו-9-HODE יחד עם 13 ו-9-oxoODE המתאימים, שמקורם בחומצה לינולאית. בנוסף, 15-oxoETE, המטבוליט המחומצן של 15-HETE מוצג גם בפאנל השני. שני הפאנלים התחתונים מציגים 20-HETE ו-20-HETE-IS, [²H₆]-20-HETE. איור 1B מציג את ההפרדה והמעברים הייחודיים שנקבעו עבור סטריאואיזומרים HETE הנובעים מחמצון אנזימטי של AA או על ידי ROS. איור 1C הוא ייצוג של PGs, isoPs ו-LTB₄. לחלק מהתקנים אין ייצוב תמונה זמין מסחרית; לכן, IS הדומה בזמן השמירה משמש לכימות. לדוגמה, [²H₈]-12(S)-HETE משמש לכימות מינים של 11-HETE ו-8-HETE בנוסף ל-12(R)-HETE ו-12(S)-HETE.

מהכרומטוגרמות המייצגות, ניכר שיש שינוי קטן בשימור ה-IS המנותק בהשוואה לתקן הלא מסומן. מעבר זה לזמן שמירה מאוחר יותר הוא תוצאה של אינטראקציה של דאוטריום עם עמודת הפאזה הרגילה. דאוטריום הוא קוטבי יותר ממימן; לכן, יש אינטראקציה חזקה יותר עם השלב הרגיל של העמודה. אם הפרדה זו הייתה מתרחשת באמצעות עמודת פאזה הפוכה, המעבר היה לזמן שמירה מוקדם יותר מכיוון שלחלק קוטבי יותר תהיה אינטראקציה חלשה יותר עם הפאזה ההפוכה.

figure-protocol-1
איור 1. נתון זה הוא דוגמה מייצגת לניתוח ליפידומיקה ממוקד. איור 1A מציג את סך כרומטוגרמות היונים (TIC) עבור מספר מטבוליטים מחומצנים LA ו-AA כולל 13-oxoODE ו-9-oxoODE בפאנל הראשון, 15-oxoETE בפאנל השני, 13-HODE ו-9-HODE (פאנלים 3 ו-5) ו-20-HETE (פאנל 7). ל-HODEs ול-20-HETE יש IS deuterated תואם בפאנל למטה (4, 6 ו-8). ה-TICs באיור 2B מראים את ההפרדה והמעברים הייחודיים של סטריאואיזומרים HETE שמקורם ב-AA. איור 2C הוא ייצוג של PGs, isoPs ו-LTs. אנרגיית ההתנגשות (CE), מעברי MRM וזמן השמירה (RT, min) עברו אופטימיזציה באמצעות Waters 2695 LC בשילוב עם Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra ומפורטים בטבלה 3 עבור כל תרכובת.

<גבול טבלה="1"> זמן (דקות) % א % B 0 98 2 3 98 2 11 96.4 3.6 15 92 8 27 92 8 30 50 50 38 50 50 39 98 2 45 98 2

טבלה 1. תנאי שיפוע HPLC להפרדת ליפידומיקה בשלב הנורמלי הכיראלי. ממס A הוא 100% הקסנים וממס B הוא מתנול/איזופרופנול (1:1).

<גבול טבלה="1"> פרמטר ספקטרומטריית מסה הגדרה מקור APCI מצב יון שלילי אורך השיטה 40 דקות רוחב סריקה MRM 0.002 מ'/ז זמן סריקה MRM 0.15 שניות רוחב שיא MRM 0.70 FWHM עדשת צינור 164 וולט מקור: CID 10 eV Q2 גז התנגשות 1.5 יחידות טמפרטורת וופורייזר 450 מעלות צלזיוס טמפרטורה נימית 250 מעלות צלזיוס זרם פריקה 0 מיקרו-אמפר לחץ גז נדן 25 יחידות לחץ סחף יונים 3 יחידות לחץ גז עזר 5 יחידות

טבלה 2. המפורטים לעיל הם פרמטרי ספקטרומטריית המסה האופטימליים למדידת שומנים ביו-אקטיביים. פרמטרים אלה נלקחים מ- Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

<גבול טבלה="1"> תרכובת מעבר CE (eV) RT (דקות) 13-אוקסודה 293.03 → 113.10 21 9.9 9-אוקסודה 293.03 → 113.10 21 17.9 15-oxoETE 317.05 → 113.18 18 8.1 13(R)-HODE 295.03 → 195.12 18 12.5 13(S)-HODE 295.03 → 195.12 18 14.8 [²H₄]-13(S)-HODE 299.03 → 198.12 18 14.9 9(R)-HODE 295.03 → 171.10 18 13.7 9(S)-HODE 295.03 → 171.10 18 21.2 [²H₄]-9(S)-HODE 299.03 → 172.12 18 21.2 20-HETE 319.03 → 289.10 18 12.4 [²שעות₆]-20-HETE 325.03 → 295.10 18 12.4 5(R)-HETE 319.04 → 115.04 16 15.7 5(S)-HETE 319.04 → 115.04 16 16.2 [²H₈]-5(S)-HETE 327.04 → 116.04 16 16.4 12(R)-HETE 319.04 → 179.11 14 11.7 12(S)-HETE 319.04 → 179.11 14 12.3 [²H₈]-12(S)-HETE 327.13 → 184.11 14 12.5 15(R)-HETE 319.04 → 219.12 13 12.4 15(S)-HETE 319.04 → 219.12 13 15.9 [²H₈]-15(S)-HETE 327.03 → 226.12 13 16.1 11(R)-HETE 319.04 → 167.11 16 11.1 11(S)-HETE 319.04 → 167.11 16 12.5 8(R)-HETE 319.04 → 155.09 16 11.7 8(S)-HETE 319.04 → 155.09 16 12.6 LTB4 335.03 → 195.10 18 32.0 [²ח'₄]-LTB₄ 339.03 → 197.10 18 32.0 עמוד₂ 351.03 → 271.15 18 31.2 [₂ח'⁴]-PGE₂ 355.03 → 275.15 18 31.2 PGD₂ 351.03 → 271.15 25 32.5 [²ח'₄]-PGD₂ 355.03 → 275.15 25 32.5 8-איזו-PGE₂ 351.03 → 271.15 18 37.4 11β-PGF₂ 353.03 → 193.11 25 27.6 [²שעות₄]-11β-PGF₂ 357.03 → 197.11 25 27.6 PGF_2α 353.03 → 193.11 25 33.1 [²שעות₄]-PGF_2α 357.03 → 197.11 25 33.1 8-איזו-PGF_2α 353.03 → 193.11 25 34.4 [²שעות₄]-8-איזו-PGF_2α 357.03 → 197.11 25 34.4

טבלה 3. טבלה זו מפרטת את התרכובות שזוהו בכרומטוגרמות היונים הכוללות של איור 1A-C. העמודה השנייה מספקת את המעבר המשמש עבור MRM/MS, העמודה השלישית מפרטת את אנרגיית ההתנגשות (CE, eV) והעמודה האחרונה מפרטת את זמן השמירה (RT, min). הפרמטרים עברו אופטימיזציה באמצעות מודול הפרדה Waters 2695 בשילוב עם Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקנים והתקנים הפנימיים המשמשים בפרוטוקול זה מספקים ייצוג של שיטת ליפידומיקה ממוקדת. מודול הפרדה Waters 2695 ו-Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra שימשו לניתוח LC-MS וניתן למצוא את הגדרות הפרמטרים האופטימליות בטבלאות 1 ו-2. בנוסף, פרוטוקול מיצוי זה תוכנן עבור תאים נצמדים, אך ניתן לשנות אותו לסוגי תאים אחרים כמו גם למטריצות ביולוגיות אחרות כולל שתן, דם ורקמות. תקני שומנים רבים זמינים מסחרית וניתן לשלב אותם בניתוח זה. להליך הנגזרת, חשוב להשתמש בממיסים נטולי מים ובטוהר הגבוה ביותר N,N-diisoprop...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רוב השיטות הביואנליטיות העדכניות הזמינות למדידת ליפידים ביו-אקטיביים אינן נרחבות מכיוון שהן אינן כוללות כרומטוגרפיה כיראלית של פאזה נורמלית או SID. שלב נורמלי כיראלי LC הוא קריטי להפרדת אננטיומרים וליכולת להבחין בין חילוף חומרים בתיווך אנזים או ROS. השימוש ב-SID מבטיח כי טעויות אנוש או סיבוכים המתעוררים במהלך מיצוי או ניתוח נלקחים בחשבון במהלך הכמות. רכיבים נוספים אלה יחד עם ECAPCI-MRM הופכים אותה לשיטה הרגישה והסלקטיבית ביותר הזמינה לניתוח שומנים ביו-אקטיביים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-6,8,9,11,12,14,15-d7 חומצה	קיימן כימית	334250	[²H₇]-5-ox–TE תקן פנימי
5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 חומצה	קיימן כימית	334230	[²H₈]-5(S)-תקן פנימי HETE
12S-הידרוקסי-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 חומצה	קיימן כימית	334570	[²H₈]-12(S)-HETE תקן פנימי
15S-הידרוקסי-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 חומצה	קיימן כימית	334720	[²H₈]-15(S)-HETE תקן פנימי
20-הידרוקסי-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-16,16,17,17,18,18-d6 חומצה	קיימן כימית	390030	[²H₆]-20-HETE תקן פנימי
9S-hydroxy-10E,12Z-octadecadienoic-9,10,12,13-d4 חומצה	קיימן כימי	338410	[²H₄]-9(S)-HODE תקן פנימי
13S-hydroxy-9Z,11E-octadecadienoic-9,10,12,13-d4 חומצה	קיימן	כימית 338610	[²H₄]-13(S)-HODE תקן פנימי
9α,11α,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20,20-d4 acid	Cayman Chemical	316010	[²H₄]-PGF_2α תקן פנימי
9α,11α,15S-trihydroxy-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 חומצה	קיימן כימית	316350	[_{2H₄]-8-iso-PGF2a תקן פנימי}
>9α,11β.,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 חומצה	קיימן כימית	10008989	[²H₄]-11β-PGF₂ תקן פנימי
9&אלפא;,15S-דיהידרוקסי-11-אוקסו-פרוסטה-5Z,13E-דיאן-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20,20-d4 חומצה	קיימן כימית	312010	[²H₄]-PGD₂ תקן פנימי
9-oxo-11α,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acid	Cayman Chemical	314010	[²H₄]-PGE< תת>2 תקן פנימי
5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic-6,7,14,15-d4 חומצה	קיימן	כימית 320110	[²H₄]-LTB₄ תקן פנימי
9α,11,15S-trihydroxy-thromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 חומצה	קיימן כימית	319030	[²H₄]-TxB₂ תקן פנימי
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-חומצה איקוסאטטראנואית	קיימן כימי	34250	5-ox–TE סטנדרטי
12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-חומצה איקוסאטטראנואית	קיימן	כימי 34580	12-ox–TE סטנדרטי
15-oxo-5Z, 8Z,11Z,13E-חומצה איקוסאטטראנואית	קיימן כימית	34730	15-אוקס–TE סטנדרטי
5R-הידרוקסי-6E,8Z,11Z,14Z-חומצה איקוסאטטראנואית	קיימן כימי	34225	5(R)-HETE סטנדרטי
5S-הידרוקסי-6E,8Z,11Z,14Z-חומצה איקוסאטטראנואית	קיימן כימית	34230	5(S)-HETE סטנדרטי
8R-הידרוקסי-5Z,9E,11Z, 14Z-חומצה איקוסאטטראנואית	קיימן כימית	34350	8(R)-HETE סטנדרטי
8S-הידרוקסי-5Z,9E,11Z,14Z-חומצה איקוסאטטראנואית	קיימן כימי	34360	8(S)-HETE סטנדרטי
11R-הידרוקסי-5Z,8Z,12E,14Z-חומצה איקוסאטטראנואית	קיימן כימית	34505	11(R)-HETE סטנדרטי
11S-הידרוקסי-5Z,8Z,12E, 14Z-חומצה איקוסאטטראנואית	קיימן כימית	34510	11(S)-HETE סטנדרטי
12R-הידרוקסי-5Z,8Z,10E,14Z-חומצה איקוסאטטראנואית	קיימן כימי	34560	12(R)-HETE סטנדרטי
12S-הידרוקסי-5Z,8Z,10E,14Z-חומצה איקוסאטטראנואית	קיימן כימי	34570	12(S)-HETE סטנדרטי
15R-הידרוקסי-5Z,8Z,11Z, 13E-חומצה איקוסאטטראנואית	קיימן כימית	34710	15(R)-HETE סטנדרטי
15S-הידרוקסי-5Z,8Z,11Z,13E-חומצה איקוסאטטראנואית	קיימן כימי	34720	15(S)-HETE סטנדרטי
20-הידרוקסי-5Z,8Z,11Z,14Z-חומצה איקוסאטטראנואית	קיימן כימי	90030	20-HETE סטנדרטי
9R-הידרוקסי-10E,12Z-חומצה	אוקטדקדינואיתקיימן כימיקל	38405	9(R)-HODE סטנדרטי
9S-הידרוקסי-10E,12Z-חומצה אוקטדקדינואית	קיימן כימי	38410	9(S)-HODE סטנדרטי
13R-הידרוקסי-9Z,11E-חומצה אוקטדקדינואית	קיימן כימי	38605	13(R)-HODE סטנדרטי
13S-הידרוקסי-9Z,11E-חומצה אוקטדקדינואית	קיימן כימית	38610	13(S)-HODE Standard
9α,11α,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid	Cayman Chemical	16010	PGF_2α סטנדרטי
9α,11α,15S-trihydroxy-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid	Cayman Chemical	16350	8-iso-PGF2α תקן
9&אלפא;,11β,15S-טריהידרוקסי-פרוסטה-5Z,13E-דיאן-1-חומצה אואית	קיימן כימי	16520	11β-PGF<תת>2 תקן
9&אלפא;,15S-דיהידרוקסי-11-אוקסו-פרוסטה-5Z,13E-דיאן-1-אוic חומצה	קיימן כימית	12010	PGD₂ תקן
9-oxo-11α,15S-dihydroxy-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid	Cayman Chemical	14350	8-iso-PGE₂ Standard
9-oxo-11α,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid	Cayman	Chemical 14010	PGE₂ Standard
5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic acid	Cayman Chemical	20110	LTB₄ Standard
9α,11,15S-trihydroxythromba-5Z,13E-dien-1-oic acid	Cayman Chemical	19030	TxB₂ פוספט סטנדרטי
מלוח	GIBCO, מאת Life Technologies	14190
Diethyl Ether	Sigma-Aldrich	346136
Dichloromethane	Acros Organics	61030-1000	נטול מים
N,N-דיסופרופילאתיל אמין	סיגמא-אולדריץ'	387649
פנטפלואוריל בנזיל ברומיד	סיגמא-אולדריץ	101052
חומצה הידרוכלורית	סיגמא-אולדריץ	320331
אשלגן הידרוקסיד	פלוקה	00650
אצטוניטריל	פישר מדעי	A996-4
מתנול	פישר סיינטיפיק	A454-4
כלורופורם	פישר סיינטיפיק	366927
הקסאן	פישר סיינטיפיק	H303-4
איזופרופנול	פישר סיינטיפיק	A464-4
אתנול	דקון מעבדות	2716
ווטר	פישר סיינטיפיק	W7-4
פסטר פיפטס	פישר סיינטיפיק	13-678-200
10 מ"ל צינורות צנטריפוגה מזכוכית	Kimble Chase	73785-10	מכסה בורג
מכסי בורג פנוליים	Kimble Chase	73802-13415
Chiralcel ADH Column	Chiral Technologies	19325
בקבוקוני HPLC	Waters	60000751CV
HPLC מוסיף	Waters	WAT094171

' '

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. Arachidonic acid metabolism. Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).
Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. Stereochemical nature of the products of linoleic acid oxidation catalyzed by lipoxygenases from potato and soybean. Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 491-496 (1990).
Panigrahy, D., Kaipainen, A., Greene, E. R., Huang, S. Cytochrome P450-derived eicosanoids: the neglected pathway in cancer. Cancer. Metastasis. Rev. 29, 723-735 (2010).
Basu, S. Bioactive eicosanoids: role of prostaglandin F(2alpha) and F-isoprostanes in inflammation and oxidative stress related pathology. Mol. Cells. 30, 383-391 (2010).
Sanchez-Mejia, R. O., Mucke, L. Phospholipase A2 and arachidonic acid in Alzheimer's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1801, 784-790 (2010).
Hersberger, M. Potential role of the lipoxygenase derived lipid mediators in atherosclerosis: leukotrienes, lipoxins and resolvins. Clin. Chem. Lab Med. 48, 1063-1073 (2010).
Allayee, H., Roth, N., Hodis, H. N. Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular disease: implications for nutrigenetics. J. Nutrigenet. Nutrigenomics. 2, 140-148 (2009).
Capdevila, J. H., Falck, J. R. Biochemical and molecular properties of the cytochrome P450 arachidonic acid monooxygenases. Prostaglandins Other Lipid Mediat. , 68-69 (2002).
Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2, 311-341 (2010).
Blair, I. A. Electron-capture negative-ion chemical ionization mass-spectrometry of lipid mediators. Methods in Enzymology. 187, 13-23 (1990).
Singh, G., Gutierrez, A., Xu, K., Blair, I. A. Liquid chromatography/electron capture atmospheric pressure chemical ionization/mass spectrometry: analysis of pentafluorobenzyl derivatives of biomolecules and drugs in the attomole range. Analytical Chemistry. 72, 3007-3013 (2000).
Blair, I. A. Encyclopedia of Mass Spectrometry. Capriol, R. M., Gross, M. L. , Elsevier. 283-307 (2005).
Lee, S. H., Blair, I. A. Targeted chiral lipidomics analysis by liquid chromatography electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (LC-ECAPCI/MS). Methods in Enzymology. 433, 159-174 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HPLC

ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

במאמר זה

סיכום

תקציר

פרוטוקול

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים