זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

סיכום

כאן אנו מתארים את שיטת ישירות לדמיין היפוקסיה ברקמות microregional של קליפת המוח העכבר In vivo. היא מבוססת על הדמיה של שני פוטונים בו זמנית של dinucleotide nicotinamide אדנין (NADH) ו microcirculation קליפת המוח. שיטה זו שימושית לצורך ניתוח ברזולוציה גבוהה של אספקת החמצן לרקמות.

תקציר

היכולת של המוח לתפקד ברמות גבוהות של הדרישה המטבולית תלויה באספקת חמצן רציפה באמצעות זרימת דם וחמצן לרקמות דיפוזיה. כאן אנו מציגים פרוטוקול הניסוי ומתודולוגיים דמיינו ישירות לדמיין היפוקסיה ברקמות microregional ו להסיק הדרגתיים חמצן perivascular בקליפת העכבר. הוא מבוסס על מערכת היחסים הבלתי ליניארי בין dinucleotide nicotinamide אדנין (NADH) עוצמת הקרינה אנדוגני ולחץ חמצן חלקי הרקמה, שם נצפתה רקמה NADH הקרינה לפתע מגביר את רמות החמצן ברקמות מתחת 10 מ"מ כספית ^1. אנו משתמשים שני הפוטונים עירור ב 740 ננומטר המאפשר עירור זמנית של הקרינה NADH מהותי רקמות הפלזמה בדם בניגוד טקסס האדום dextran. יתרונותיה של שיטה זו על פני הגישות הקיימות כוללות: הוא מנצל את האות הרקמה הפנימית וניתן לבצעו באמצעות תקן 2 פוטון in vivo imהזדקנות ציוד, אלא מאפשר ניטור רציף בתחום שלם של נוף עם רזולוציה עומק של ~ 50 מיקרומטר. אנו מראים כי רקמת המוח באזורים המרוחקים מן כלי הדם המוחיים מתאימות באזורים הפגיעים קו פרשת המים אשר 1 להיות hypoxic תפקודית לאחר ירידה באספקת החמצן בכלי הדם. שיטה זו מאפשרת לאדם חמצון התמונה microregional קליפת המוח, ולכן הוא שימושי עבור בחינת התפקיד של אספקת מספיק חמצן לרקמות או מוגבל במחלות neurovascular ושבץ.

פרוטוקול

1. הכנת בעלי חיים הדמיה

הערה: אנו משתמשים בעכברים c57BL בוגרים. זנים שונים מהונדס ניתן להשתמש בהתאם לשאלת המחקר. ניתוחי כלי הדם ואת הדופק oximetry הם הקלו בעכברים עם פרווה לבנה (למשל זן FVB).

1. מכינים את האתר כירורגית ב הספסל. כל מכשירי ניתוח יש autoclaved או לחטא עם אתנול 70%.
2. הוספת בדיקה רקטלית, ו ברציפות למדוד את טמפרטורת הגוף של בעל החיים לאורך כל ההליך
3. להרדים את העכבר באמצעות תחילה 5% isoflurane. ב 15-30 S, כאשר בעל חיים לא זז, ומניחים אותו על משטח חימום (37 מעלות צלזיוס), ולהחיל מסכה הפנים למסירה רציפה של אוויר המכיל 1.3-1.5% isoflurane). לוודא כי בעל החיים אינו מגיב לגירוי כאב (למשל קמצוץ הזנב).
4. שימוש בג'ל דמעה מלאכותית כדי לכסות את עיניו של העכבר, כדי למנוע חשיפה לאוויר יבש.
5. באמצעות מכונת גילוח חשמלית, להסיר שיער FROM הראש מן הירכיים הצדדים. החל מסיר שיער (למשל Nair) לירך 2 דקות ולאחר מכן לנגב את זה בזהירות כדי להסיר את השיער הנותר. הירך זה ישמש oximetry.
6. לחטא את הקרקפת באמצעות 10% povidone-יוד פתרון ואתנול 70%.

2. הכנת את החלון פתוח הגולגולת הגולגולת

1. החל 5 מ"מ הזנב לגולגולת, עושים חתך בקרקפת במספריים, ולקדם סנטימטר אחד. העבר העור לצדדים לחשוף את הגולגולת.
2. כדי להסיר את קרום על גבי הגולגולת להחיל 10% הפתרון כלוריד Ferric לחלק העליון של הגולגולת. למחות את הפתרון עודפי שומן, לגרד את הקרומים משם עם 45 מעלות # 5 פינצטה זווית. חשוב להכין את האתר בזהירות, על מנת להבטיח את הצלחת ראש יכול להיות מחובר היטב אל הגולגולת (צעדים # 4-6).
3. באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה, לזהות תחומי עניין. שים לב, את התפרים הגולגולת יש להימנע, כי ג הגולגולתבאופן בלתי צפוי לשבור ברוח זו.
4. למרוח שכבה דקה של דבק מהיר (למשל Locktite 454) סביב שולי החלון הצלחת הראש (איור 1). מקם את הצלחת ראש בצורה כזאת, כי שטח של עניין נחשף בחלון. להפעיל לחץ קל על צלחת את הראש. למרוח כמות קטנה של דבק דנטלי כדי לפלמר דבק במהירות. החזק למשך 10 שניות תוך דבק הוא polymerizing.
5. למרוח כמות קטנה של דבק מהיר את הקצוות של החלון לאטום את הצלחת ראש הגולגולת. לדפוק את הראש בצלחת לבעל חיים תחת היקף לנתיחה.
6. באמצעות תרגיל II Microtorque להגדיר בסל"ד 6000 וקצת 005 IRF תרגיל, להסיר את כל הדבק הנוסף הגולגולת מהצלחת ראש. דבק כל שנותר בצלחת הראש יש להסיר, שכן זה יהיה אחרת להפריע מצורף מכסה זכוכית.
7. הגדר את התרגיל בסל"ד 1000, ולהתחיל קידוח בגולגולת על ידי יצירת מעגל בתוך החלון את הצלחת ראש, קוטר ~ 5 מ 'מ. השתמש בתנועות גורפות אור כאילו אתה מצייר בעיפרון רך מאוד. עצור קידוח כל 20-30 שניות כדי להסיר אבק העצם באמצעות אוויר דחוס.
   הערה: צורת הפתיחה בצלחת הראש מאפשר גישה נוספת המקדח (למנתח שמאל ו ימני), מה שהופך את זה קל יותר ליצור חלון גולגולתי חוזר. בנוסף, שני חורים בצורת מזדמנות לספק את המרחב הדרוש לצורך הוספת קלארק, האלקטרודה או זכוכית אלקטרודה לתוך רקמת המוח מתחת לחלון גולגולתי למדידות polarographic או אלקטרו נוספים.
8. כמו קידוח מתקדמת, להתחפר נוצר סביב הגולגולת שלמים במרכז. להיזהר לא לתקוע את הגולגולת דליל, אבל כדי להפוך את המאורה של עובי אפילו. היזהרו במיוחד סביב כלי דם גדולים, הם לא צריכים להיות בסכנה, ואם אפשר, לא נגע אפילו.
9. השתמש 1 "הרגל" של פינצטה # 3 להרים ("מכבה") עצם במרכז החלון. החל ירידה של artificial נוזל המוח והשדרה (aCSF) על החלון.
10. נגב בעדינות באמצעות aCSF פינה של נייר טישו רך (למשל Kimwipe). בדרך כלל דורה פגום אחד או יותר מקומות ברחבי קצה החלון. החל באחד האתרים האלה, להרים בעדינות ולאחר מכן להסיר את דורה מפני השטח של המוח, באמצעות 45 ° פינצטה זווית # 5. בבחירת האתר בו כדי להתחיל להסיר דורה, למנוע את האזורים הסמוכים כלי דם גדולים. אם הדימום מתרחש, להחיל ירידה של aCSF ולחכות 2-3 דקות של דימום קטן לעצור.
11. הכן 0.07% נמוך ההיתוך agarose מומס aCSF) תביא agarose מומסת על טמפרטורת הגוף. למחות מעל aCSF מפני השטח של המוח. יוצקים את agarose בחלון, ומכסים שקופיות זכוכית. לחצו על הכוס בעדינות לעשות קשר בין זכוכית לבין הצלחת הראש, ולחכות 10-20 שניות עד agarose הוא מוצק.
12. הסר agarose עודף כיסוי זכוכית באמצעות פינצטה ונייר רקמות רכות.
13. שים קטןכמות דבק מהיר מסביב לכוס להדביק את הזכוכית לצלחת הראש. למרוח כמות קטנה של דבק דנטלי כדי לחזק את הדבק (איור 1).

3. הזרקה תוך ורידית וניטור חמצון בדם

הערה: אנו משתמשים באופן קבוע וריד הירך ליישום תוך ורידי של טקסס אדום ולא וריד הזנב. הסיבה לכך היא זריקות וריד הירך לספק זריקות בולוס בטוח לשחזור של צבע.

1. הפעל את הפרה חלקית לחשוף את החלק הפנימי של הירך השמאלית. להשתמש בקלטת כדי להבטיח חיים במצב הזה.
2. החל לשפשף חיטוי ולאחר מכן אתנול 100% על העור.
3. לעשות חתך לאורך הירך המדיאלי של הברך כדי מאחה הערווה. הרקמות הרכות הפרדה באמצעות דיסקציה קהה באמצעות פינצטה # 5.
4. מלא את המזרק עם 1ml μl 130 טקסס האדום (2.5 מ"ג / מ"ל). צרף מחט חדשה (מד 30), לכופף את זה בזהירות על 30 °, שמירה על מסגרת משופעת למעלה. מלא Wi מחטה טקסס פתרון האדום.
5. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, הכנס את המחט לווריד הירך ו להזריק 100 μl של טקסס האדום. הסר המחט לחץ קלות את הווריד עם גזה כדי לעצור את הדימום.
6. סגור את העור באמצעות תפר 4-0.
7. לניטור רציף של דם SpO ₂ (על מנת להבטיח חמצון דם מספקת) למקם את החללית oximeter על הירך הימני (שממנו השיער הוסר בעבר).

4. שני פוטונים הדמיה

הערה: אנו משתמשים Fluoview1000 אולימפוס multiphoton מערכת הדמיה (זקופה) עם Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee femtosecond טי: שא לייזר כמקור עירור. הדמיה, אנו משתמשים 10 × 0.45 NA (C-Zeiss Apochromat), או 1.05 × 25 NA (אולימפוס XLPlan N) מים טבילה מטרות. אנחנו לוקחים תמונות בעומק 12 סיביות ברזולוציה של 512 × 512 פיקסלים עם פיקסל להתעכב זמן של 2 μs. NADH ו-Texas Red-dextran שמחים במקביל ב 740 ננומטר, ו פלואורידescence מופרד אור עירור באמצעות מראה dichroic / כמעט IR-חסימת שילוב המסנן (FF665-Di01; FF01-680/SP, Semrock, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב) מחולק לשני הערוצים באמצעות מראה dichroic (505DCXRU, Chroma , רוקינגהם, ורמונט, ארה"ב), ו bandpass מסוננים (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). כוח לייזר נמדד אחרי המטרה היתה 10-20 mW הדמיה בשכבה I ו 20-50 mW הדמיה בשכבה II.

1. העברת העכבר מוכן בניתוח לשלב את המיקרוסקופ. קח את התמונה הראשונית של האתר בחלון גולגולתי באמצעות תאורה בשדה בהיר בהגדלה 4x להשתמש כמפה התייחסות אחת עם ההגדלה גבוה 2 פוטון angiographies.
2. קרב על שטח של עניין באמצעות × 10 ההגדלה. בחר תחום עניין שכבות בקליפת המוח I או II (עד 150 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial). אם ההגדלה גבוה יותר הוא הרצוי, השתמש × 25 אובייקטיבי
3. להתחיל להקליט את הסדרה בזמן (Figuמחדש 2). אנו ממליצים להשתמש בממוצע של 3-5 מסגרות להגדיל את איכות התמונה.
4. לגרום hypoxemia ידי הוספת N2 50% לאוויר כי החיה נושמת. זה יביא את רמת O2 10%. ודא hypoxemia על ידי ניטור הנתונים oximeter.
5. ממשיכים להקליט את הסדרה בזמן דרך hypoxemia (למשל, למשך 30 שניות), ולאחר נורמלי ברמה O2 משוחזר.
6. איסוף נתונים לצורך חישוב חלוקת חמצן על ידי איתור, מדידה וכימות שטח של חוסר חמצן ברקמות צילינדרים ו מחומצן סביב כלי הדם.

5. עיבוד נתונים

1. לקבוע גליל Krogh רקמות רדיוס ר 'ניתן לעשות זאת באופן ידני (איור 3) על ידי מדידת המרחק בין מרכז של כלי דם הגבול שבו הקרינה גבוהה NADH הוא זוהה.
2. לחלופין, השתמש חישובית חוקר עצמאי למחצה אוטומטי קביעת R רדיוס הגליל רקמות blo המרכזיr עוד כלי זה תוארה בעבר ¹ בצורת משלים ו סיכם את הדיון בסעיף של פרוטוקול זה.
3. קבע את שטח של היפוקסיה באמצעות גישה פתוחה ניתוח תמונת התוכנה, למשל ImageJ. לשם כך, השתמש האות NADH, להגדיר סף התוחמת את האזור בעוצמה גבוהה NADH, ולאחר מכן למדוד את השטח עם הקרינה NADH גבוהות רקמות.

6. נציג תוצאות

תרשים 2 מציג וידאו של NADH / אנגיוגרפיה תמונות במהלך hypoxemia חולף (עבור גרסת PDF של נתון זה, שנבחרו תמונות סטילס היו בשימוש). ריכוז החמצן השראה ירדה מ 21% ל 10% לתקופה של 3 דקות. רמה זו של hypoxemia המושרה בניסוי מספיק כדי לגרום היפוקסיה קשה בקליפת המוח. היפוקסיה הוביל לעלייה NADH הקרינה, תחילה באזורים שהיו רחוק יותר מן אספקת הדם העורקי. הערה רקמות NADH חדהגבולות, המייצגים גבולות רקמה נצפים דיפוזיה של חמצן microcirculation קליפת המוח. תמונה איור 3 מציג את הגיאומטריה של דיפוזיה גבולות חמצן סביב כלי המוח. ניתן להסיק Krogh קוטר צילינדר של גבולות אלה, כפי שתואר קודם ^1.

באיור 1. (א ') מאוס עם חלון גולגולתי מוכן הדמיה. (ב) מידות לוחית הראש.

איור 2. אנדוגני NADH ירוק הקרינה דמיינו עם הדמיה של שני פוטונים דרך החלון גולגולתי, כ 50 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial. כלי הדם הם דמיינו עם טקסס האדום dextran. החמצן באוויר הנשאף ירד 10% עבור 3 דקות, ולאחר מכן לשחזר 21%. סרגל קנה מידה: 50μm.

איור 3. גיאומטריה של גבולות הקרינה NADH. מתווה הצהוב מראה הגבול של היפוקסיה תפקודית, עיגולים כחולים להראות מוקרן מחומצן (Krogh) צילינדרים. קווים כחולים להראות רדיוס הגליל, המספרים מראים רדיוס ב מיקרומטר.

דיון

ברזולוציה גבוהה מידע מרחבי על דיפוזיה חמצן חשוב להבין כיצד זרימת הדם במוח מוסדר לספק חמצן לתאי המוח, כדי לענות על הביקוש מטבולית. מסורתית מדידות חמצן polarographic באמצעות קלארק בסגנון אלקטרודות זכוכית הם פולשני מאוד ויש לי ברזולוציה מרחבית נמוכה ^2-3 וזמן תגובה משמעותית (טווח 2). עד כה השיטה היחידה לא פולשנית למדידת ת.ד. ₂ ברקמת המוח הוא מרווה זרחני, שם קצב הדעיכה של החללית נרגש הוא יחסי ריכוז חמצן ^4. שיטה זו מספקת בריכוז החמצן מדויקים, אבל דורש צבע קנייני מערכת מתוחכמת מבחינה טכנית זרחני הדמיה לכל החיים. כאן, אנו מראים גישה ישירה, פשוטה, כי ניתן לבצע במערכת שני פוטונים סטנדרטית הדמיה עם שני ערוצי flurescence. הגישה שלנו מנצלת את האות הרקמה הפנימית ⁵ND רק דורש ראיה מנוגדים של microcirculation קליפת המוח. בגלל הגידול, שאינו ליניארי בינארי בעיקרו של NADH הקרינה ב תפקודית הגבלת ריכוזי חמצן ^1, גדל מהותית NADH הקרינה הוא ציין רק באזורים עם היפוקסיה, להגביל משמעותית מבחינה מטבולית. השלכה חשובה היא כי גבולות רקמה של דיפוזיה חמצן microvessels קליפת המוח משתקפות ישירות על ידי שינויים בצורת cylindrically בעוצמה של הקרינה NADH אנדוגני. אנו מכנים את המבנים האלה כמו גלילים Krogh, כי את הרעיון של מבנים בצורת cylindrically המגדירים את עוצמת הקול מחומצן של הרקמה הסובבת כלי דם הוצג על ידי אוגוסט Krogh כבר מזמן נצפתה בניסוי באמצעות שני פוטונים NADH הדמיה ^1. Krogh תמונות צילינדרים ניתן לאסוף ב-3D על ידי לקיחת Z-מחסנית של מסגרות תמונה. הם בולטים במיוחד באזור arterioles נוקבות והם שנינות בקנהH נימי מדולדל צילינדרים ^1,4 periarteriolar רקמות.

כדי לספק הגדרה אובייקטיבית של R גליל רקמות Krogh רדיוס (ראה סעיף 5.2) מדדנו בעוצמה רדיאליים שלהם ערכים פיקסל במגזר מוגדר היטב בין המרכז של גליל ואת הגבול החיצוני באמצעות הפונקציה Matlab "improfile". הגבול החיצוני של המגזר יש לבחור להרחיב עם מרווח ביטחון מעבר לגבול הנראה. כדי לשפר את רמת האות לרעש אנו averageed על כל קווי רדיאליים הדרושות כדי לחסן את הקטע גליל הנראה על צעדים 1 מעלות. בעוצמה וכתוצאה מכך רדיאלי הממוצע בכרטיס במגזר הציג עלייה חדה, אשר תואם את R רקמות גלוי הגבול. אנו מתאימים פונקציה sigmoidal (פונקציה למשל בולצמן) לפרופיל בעוצמה ממוצעת רדיאלי בשימוש נקודת פיתול שלו (הידוע גם בשם x ₀₎ כהגדרה של R. מתאים 2-Photon microangiography (טקסס אדום) חשפה חתך של כלי דם בודד מרכזי במרכז הגליל. הקוטר של כלי הדם המרכזי ניתן ליישם ישירות על מנת לקבוע r.

שני הפוטונים NADH מספק הדמיה ברזולוציה מרחבית כמו הדמיה ברזולוציה גבוהה בו זמנית של microangiography קליפת המוח. תכונה חשובה עבור היישום כמותית של שיטה זו הוא עמ _'50 של עלייה הקרינה NADH כבר נמדד להיות של 3.4 ± 0.6 מ"מ כספית ¹ וכי עוצמת הקרינה NADH כפונקציה של רקמות ת.ד. microregional ₂ ניתן לתאר באופן מתמטי עם פונקציה sigmoidal. . אנו מראים כי טכניקה זו מאפשרת לזהות אזורים במוח שהם הפגיעים ביותר היפוקסיה (על ידי הפחתת תכולת החמצן באוויר כדי% 10). כמו כן, אנו מראים כי דיפוזיה חמצן כדלקמן דפוס פשוטה perivascular גיאומטרי.

אחת קריטיתצעד iCal בשיטה זו הוא איכות הכנה חלון גולגולתי. הניתוח צריך לייצר פגיעה מינימאלית על מנת לא להפריע את זרימת הדם באזור חשוף. החשש הוא כי לקראת פגיעה בניתוח, קליפת המוח מתחת לחלון יכול להיות חוסר חמצן מלכתחילה, לא ניתן שום ניסויים משמעותיים. חלון מוכנה היטב גולגולתי צריך שלמות כלי הדם ראשיות ומשניות עם זרימת הדם חי בכל סוגי כלי ולא דימום משמעותי לאורך הקצוות. בתנאים normoxic (PaO2 80-100 מ"מ כספית, Sp O2 97-99%) parenchyma המוח צריך להפגין הקרינה אחידה, NADH הומוגנית ללא כתמים בולטים, רקמות בהירים עם הקרינה NADH גבוהות.

המגבלה הפיזית היסוד של הגישה שלנו היא מוגבלת חדירה לעומק. הקרינה כחול ירוק NADH במוח הוא נחלש במהירות על ידי ספיגת המוגלובין פיזור רקמת באורכי גל אלה. אפילו עם צמצם המספרי גבוהה (למשל 1.05) מיםמטרות טבילה שני הפוטונים NADH הדמיה מוגבל כיום קליפת המוח שכבות I ו-II. מגבלה זו היא רלוונטית מבחינה מדעית, כי חילוף החומרים של אנרגיה או בקרבת החומר הלבן צפויה שונים החומר האפור. עם זאת, החקירה של מבנים קורטיקליים עמוקים כגון שכבות IV-VI או מבנים קורטיקליים כמו שטחים החומר הלבן או הסטריאטום ידרוש את השימוש microlenses מיוחדים כמתואר vivo ⁶ ב קליפת העכבר.

NADH מבוססת המדידה של גבולות דיפוזיה חמצן יכול להיות שימושי במיוחד בשילוב עם מדידות אחרות כגון ניתוח hyperemia פונקציונלי, וזיהוי של שיעורי השטף נימי ^7. לדוגמה, טכניקה זו ניתן להתאים לדמיין היפוקסיה ב שבץ ומחלת אלצהיימר (AD) מודלים. גיאומטריה פשוטה של ​​דיפוזיה חמצן מאפשר לחזות את צבע החמצן מיטות כלי הדם בנסיבות בהן צפיפות נימי הוא דהמקומט ⁸ (למשל, AD ⁹⁾ ולבדוק אם רקמת המוח באזורים עם צפיפות נימי מופחת נמצאים בסיכון מוגבר לנזק היפוקסיה עקב microstrokes. היכולת התמונה microregionally גם מאפשר לבחון את הגיאומטריה ואת הגודל של microstrokes רקמות ולקבוע את עוצמת הקול של הרקמה שבה מתרחשת היפוקסיה, כמו גם את הקשר בין היפוקסיה רקמות ומוות עצבי לאחר שיפוץ או נימי ^10.

לבסוף, מאז עליית הקרינה NADH אנדוגני הם תוצאה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה חריפה, שיטה זו יוצרת הזדמנות להשתמש הדמיה NADH ככתב ספציפי לחילוף חומרים של אנרגיה עצבית ¹¹ ו - Proxy עבור תפקוד המיטוכונדריה.

לסיכום, שני פוטונים הדמיה של אנדוגני NADH הקרינה הוא כלי פשוט, תובעני, שניתן להשתמש בהם כדי להבין את העברת חמצן וצריכת במוח הן תחת נורמליובמדינות פתולוגיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (לא חובה)
כריות חימום	מעבר חום Bodi
משחת עיניים (דמעות מלאכותיות)	פייזר
Povidone-יוד 10% הפתרון	בבטאדין
כלוריד פתרון Ferric 10%
מלט	Stoelting החברה	51456
Cyanoacrylate 454	Loctite
aCSF	הרווארד Apparatus	597316
Microtorque II handpiece ערכת	פירסון	R14-0002
IRF 007 חתיכות מקדח	מדע כלים עדינים	19008-07
מלקחיים # 5	מדע כלים עדינים	11295
מלקחיים # 5/45	מדע כלים עדינים	11251-35
# 0 זכוכית coverslip	מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים	63750-01
מכפיל צינור	Hamamatsu	HC125-02
טי: ספיר לייזר מאי טאי	Spectra-Physics