מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

Summary

במאמר זה נתאר את השימוש פינצטה מגנטיים ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis האנזימטית ברמה של מולקולה בודדת באופן parallelizable ביותר.

Abstract

הדור וזיהוי של כוחות מכניים הוא היבט של פיזיולוגיה התא נמצא בכל מקום, עם שייכות ישירה סרטן גרורות ^{1, 2} ו atherogenesis ריפוי פצעים ^3. בכל הדוגמאות הללו, התאים להפעיל כוח הן על סביבתם ובמקביל enzymatically לשפץ תאי מטריקס (ECM). השפעת כוחות על ECM הפך בכך על שטח של עניין רב בשל החשיבות שלה סביר ביולוגי ורפואי ^4-7.

טכניקות מולקולה בודדת, כגון השמנה אופטי ^8, מיקרוסקופ כוח אטומי ^9, פינצטה מגנטיים ^10,11 לאפשר לחוקרים לבחון את תפקוד האנזימים ברמה המולקולרית על ידי הפעלת כוחות על חלבונים בודדים. של שיטות אלו, פינצטה מגנטי (MT) ידועות ובעלות נמוכה שלהם, קצב העברת נתונים גבוה. MT מפעילים כוחות בטווח של 1-100 ~ PN והוא יכול לספק פתרון זמני אלפית השנייה,תכונות כי הם מתאימים גם ללימוד מנגנון האנזים ברמת מולקולה בודדת ^12. כאן אנו מדווחים assay MT parallelizable מאוד ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis של מולקולות חלבון בודדות. אנו מציגים דוגמה ספציפית של proteolysis של פפטיד קולגן trimeric ידי מטריקס metalloproteinase 1 (MMP-1), אך זה assay ניתן להתאים בקלות ללמוד מצעים אחרים פרוטאזות.

Protocol

1. תא זרימה הכנה

1. Coverslips (# 1.5, 22x22 מ"מ מ"מ 22x40, VWR) מנקים באמצעות sonication.
   1. מוסיפים את coverslips למיכל זכוכית קטן מסוגל להחזיק coverslips ו להשתלב sonicator (ראה שלב 2).
   2. למלא את המיכל עם isopropanol ו sonicate ב sonicator אמבטיה במשך 20 דקות.
   3. מחק isopropanol ולשטוף את coverslips עם כמויות עצומות של מים deionized המיוצר על ידי מנגנון MilliQ Barnsted או מכשיר דומה. למלא את המיכל במים sonicate במשך 20 דקות.
   4. לאחר sonication, לייבש את coverslips בזרם של אוויר מסונן, נקי מאבק. השתמש רק coverslips המופיעים נקי (כלומר אין כתמים).
   5. בעדינות הלהבה coverslips למשך כמה שניות כדי לנקות מהם את האבק כל הלחות הנותר: לעבור את coverslips דרך להבה גז מיוצר עם מבער בונזן, נזהר שלא עיוות coverslip בשל עודף החום. צעד זה מסיר משטח שיוריתמזהמים.
2. באמצעות דו צדדית נייר דבק, לצרף את שני coverslips יחד. חותכים את הסרט ~ 3 ס"מ אורך, 0.3 ס"מ רוחב. צרף את הקלטת על coverslip 22x40 מ"מ עוזב ערוץ 1.6 ס"מ באמצע. השתמש קצה פיפטה כדי ללחוץ בעדינות על coverslip כדי להבטיח את הקלטת דבק כראוי.

2. הגדרת מגנטי מלקטת וכיול

1. פינצטה מגנטיים היו ההתקנה באמצעות קבע נדיר אדמה מגנטים כפי שתואר קודם לכן ^10,12. אלומיניום L-סוגר נבנה עם חריר בקוטר 1 מ"מ רכוב על אנכי Z-מתרגם (Thorlabs) לווסת את גובה פינצטה את. שני קבע נדיר אדמה מגנטים צורפו סוגר משני צדי חריר ליצור מלכודת מגנטית (איור 1).
2. הכנת ה-DNA: DNA של הפאג למבדה שכותרתו ב 5 שלה 'ו 3' מסתיים עם ביוטין digoxigenin (IDT DNA, סן דייגו, קליפורניה) שימש לכייל את MAGפינצטה netic.
   1. מערבבים 50 μL של nM 4 λ-DNA עם μL 2 של 40 ננומטר ביוטין oligonucleotide חום מצומדות ו ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אז מגניב לאט בטמפרטורת החדר יותר משעה 1.
   2. הוסף ligase ה-DNA על פי מפרט היצרן ו ולקשור בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות.
   3. הוסף 2 μL של oligonucleotide 400 nm digoxigenin דגירה מצומדות ו בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
   4. הוסף 1.5 μL של 10 mM ATP ולהמשיך קשירת oligonucleotide מצומדות digoxigenin ל-DNA-λ במשך 3 שעות.
   5. הסר את oligonucleotides עודף ligase DNA באמצעות 100 ספין KDA מסננים (Microcon Ultracell YM-100). בתמורה כוללת של 1,000 פי למאגר ב TE למאגר, יש לדאוג להסיר את oligos עודף. הערה: חשוב לא להשתמש במהירויות ספין> 500xG כי זה יוביל הגז של ה-DNA.
   6. לבדוק דגימה של הדנ"א באמצעות אלקטרופורזה על 0.7% agarose ג'ל על מנת להבטיח כי ה-DNA אנילא מפוגל או טעון.
   7. למדוד את הריכוז של ה-DNA. השימוש ספקטרומטר UV-VIS Nanodrop (Thermo Scientific) מומלץ כי נפח דגימה זמין עשוי להיות קטן מאוד.
3. הכן תאים הזרימה, כמתואר בסעיף 1.
4. על החיבור של ה-DNA התא זרימה, להוסיף אנטי digoxigenin נוגדנים (IgG כבשים, 1 מיקרוגרם למ"ל ^-1; רוש Bioscience, מנהיים, גרמניה) ולאפשר לו לדבוק משטח הזכוכית במשך 15 דקות.
5. Passivate את פני השטח של התא זרימה כדי למנוע אי - דבק ספציפי של ה-DNA על ידי הוספת 2 מ"ג למ"ל ^-1 BSA, 0.1% Tween-20 ב 1x PBS. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
6. חזור על שלב 2.5.
7. הוסף 50 PM של fuctionalized λ-DNA ולאפשר לצרף coverslip במשך 15 דקות.
8. לשטוף את ה-DNA העודף עם 1x PBS.
9. הוסף streptavidin מצופים חרוזים חרוזים פאראמגנטי (1 מיקרומטר = 2 מיקרוגרם ^-1 מ"ל, 2.8 מיקרומטר חרוזים = 20 מיקרוגרם מ"ל ^-1
10. לשטוף עם חרוזים עודף 1x PBS.
11. כיול מגנטי מלקטת
    1. להעביר את מגנטים קבועים לתפקיד כי הוא רחוק מדגם השטח (> 15 מ"מ).
    2. מניחים את התא זרימה מוכן במיקרוסקופ.
    3. להעביר את מגנטים קבועים למצב מעל התא זרימה.
    4. בחר את המטוס מרחק של λ-DNA חרוזים פונקציונליות תוך התמקדות חרוזים במרחק שני משטחי זכוכית. משטח הפוקוס הנכונה היא זו שבה את החרוזים הרצויים לנו מרכז בהיר.
    5. קח וידאו של תנועה חרוז ב 80 הרץ ומעלה 500 מסגרות.
    6. הזז את המגנט קרוב יותר מדגם השטח. מעבר למרחקים 5 מ"מ, להעביר במרווחים של 1 מ"מ. למרחקים בין 1 מ"מ ו - 5, לנוע במרווחים של 0.5 מ"מ. למרחקים פחות מ 1 מ"מ, לנוע במרווחים של 0.25 מ"מ.
    7. חזור על שלבים 2.11.5 ו 2.11.6 במיקום זה מגנט חדש.
    8. עבור כל הנתוניםנקבע, לעקוב אחר מרכז את החרוזים באמצעות התאמה 2D גאוס.
    9. לחשב את הכוח באמצעות תנודות הבראונית באמצעות:

    
    כאשר k _B T הוא אנרגיה תרמית בולצמן, L הוא אורך ה-DNA λ, ו 2> הוא את השונות במצב centroid.

    10. לאשר את הדיוק של הכוחות על ידי בדיקת חישוב הכוח באמצעות התאמה קשת כוח הלורנצי כדי למצוא את התדר rolloff. הכוח ליישם קשורה לתדירות rolloff ידי היחס:

    
    כאשר ₀ ƒ הוא תדר rolloff, הוא רדיוס חרוז, ו μ הוא צמיגות הנוזל ^12.

3. קולגן פפטיד קובץ מצורף לתאים זרימה

כדי לתת דוגמה קונקרטית עבור היישום של המתודולוגיה שלנו, אנו מתארים העבודה האחרונה במעבדה שלנו המאפיינת proteolysis של קולגן פפטיד trimeric המודל. אנו צופים כי גישה זו בכלל ניתן ליישם באופן רחב חלבונים polynucleotides אחרים.

1. הפפטיד מודל קולגן מורכב התג שלו-N-terminal 6x לטיהור, ואחריו תג myc 5x (תחנת הכוח של עזה) ₁₀ לאכוף היווצרות הסליל המשולש, קולגן α1 שאריות 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), המהווים MMP- 1 האתר הכרה, רצף foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), ו-C מסוף KKCK כדי להקל על סימון ביוטין, maleimide. Foldon נובע fibritin T4-הפאג חלבון, מייצב מודל trimers קולגן כאשר התמזגו ב או N - או C-הסופית ^13,14.
2. פפטיד קולגן MMP-1 באו לידי ביטוי חלבונים מטוהרים כפי שתואר קודם לכן ^4,15.
3. הוסף אנטי-myc (15 מיקרוגרם מ"ל ^-1) לתא זרימה דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לאפשר אנטי-myc לצרף אל פני השטח של התא זרימה.
4. Passivate התא זרימה כדי למנוע הלא ספציפית מצורף של חלבונים באמצעות 5 מ"ג למ"ל ^-1 BSA באותו אופן כפי שתואר בשלב 2.5.
5. הוספת 150 קולגן פפטיד PM ולאפשר לו לצרף נוגדנים באמצעות תג myc במשך 45 דקות.
6. לשטוף את עודפי קולגן באמצעות PBS המאגר.
7. הוסף חרוזים מצופים streptavidin פאראמגנטי (1 חרוזים מיקרומטר = 2 מיקרוגרם ^-1 מ"ל ו -2.8 מיקרומטר חרוזים = 20 מיקרוגרם מ"ל ^-1) ולאפשר להם לצרף את מולקולות קולגן במשך 45 דקות. 1 החרוזים מיקרומטר יש לדלל את הריכוז הרצוי PBS. 3 החרוזים מיקרומטר יש להפריד פתרון באמצעות מגנטים חזקים, resolubilized אז PBS. תהליך זה יש לחזור 3 פעמים. שמנו לב כי צעד זה הוא חיוני כדי GEלא 3 חרוזים מיקרומטר להיקשר פפטיד פני משותק קולגן.

4. Proteolysis חיל Assay

1. לאחר התא זרימה מורכב עם פפטיד קולגן חרוזים מגנטיים, התמונה התא זרימה במלכודת המגנטי תחת כוח נמוך, PN ~ 1. מניסיוננו, subpopulation של החרוזים הוא לפעמים דבק חלש אל פני השטח באופן בלתי ספציפי. הפעלה של כוח צנוע מבטיח כי החרוזים האלה משוחררים.
2. הוספת האנזים הפעיל אל התא זרימה. במקרה זה MMP-1 היה מראש מופעל על ידי הוספת 3.5 מ"מ APMA (4-aminophenylmercuric אצטט) ו מודגרות על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. ההפעלה אומתה באמצעות SDS-PAGE.
3. ברגע התא זרימה מחדש מוחדר מכשיר פינצטה מגנטי, להקליט וידאו פורש כמה שדות של נוף, בדרך כלל מניב כמה מאות חרוזים המצורפים. זה יהיה t = 0.
4. חזור על אותו תהליך של רישום מספר שדות של התצוגה (תוך חזרה tהו אותו שדה הראייה) בנקודות זמן קבועות, עד כל חרוזי לנתק או לא proteolysis נוספת היא להבחין.
5. ניתוח נתונים הקינטית
   1. לספור את החרוזים בתחומים שונים של נוף בנקודות זמן שונות וממוצע אותם. לנרמל את מספר החרוזים על ידי חלוקת המספר הממוצע של חרוזים בכל נקודת זמן על ידי מספר של חרוזים בזמן t = 0. הדבר מבטיח כי אנחנו יכולים להשוות את שיעורי proteolysis מניסויים שונים, כי המספר המוחלט של החרוזים יהיה שונה מניסוי לניסוי.
   2. להתוות את היחס כפונקציה של הזמן. במקרה זה, אנחנו מצויד אותו ריקבון מעריכי בתוספת קבועה.

   
   שם ƒ (t) הוא היחס בין החרוזים המצורפת (או מולקולות קולגן unproteolyzed), לא הזמן, הוא שבריר של חרוזים שיצרף לקשור קולגן, b הוא קצב הדעיכה קבוע, ו-Cהוא חלק קטן של חרוזים המצורפים לא במיוחד.

   3. הניסוי אותו חוזר על עצמו בכל שינוי בכוח MMP-1 ריכוזים על מנת להבהיר את ההשפעה של כוח על ידי proteolysis קולגן MMP-1.

5. נציג תוצאות

הפרוטוקול הנ"ל מתאר שימוש הרומן של פינצטה מגנטיים (איור 1) לחקר השפעת כוח על proteolysis האנזימטית. אנחנו לכייל את הפינצטה של 1 מיקרומטר ו -3 חרוזים מיקרומטר בשתי גודל התנודות הבראונית הנצפות וחישוב תדירות הכלח על עמדות מגנט שונים (איור 2). בניסויים proteolysis כוח, ההתקנה דומה, פרט לכך DNA מוחלף קולגן (איורים 3, 4). מספר מנורמל של חרוזים הנותרים ניתן להתוות כפונקציה של זמן כדי למצוא את שיעורי proteolysis (איור 5), תהליך זה יכול להיותחזר על האנזים בריכוזים שונים וכוחות.

באיור 1. סכמטי של תהליך מלכודת מגנטית כיול (לא בקנה מידה). שני מגנטים קבועים הארץ נדיר ליצור שדה מגנטי שמושך על פאראמגנטי חרוז. תרגום מגנט למעלה ולמטה מתאים את הכוח ליישם. החרוזים הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ רגיל בהיר שדה עם חלוף אור דרך חריר בין שני מגנטים הבלעה. התמונה נלקחה במטרה אוויר 40X. את החדות, כתמים עגולים מתאימות את החרוזים מחוברים אל פני השטח coverslip. את מחוץ להתמקד באובייקטים חרוזים הם מנותקים.

איור 2. מגרשים של כוח מכויל כפונקציה של מרחק המגנט מפני השטח מדגם של 1 מיקרומטר (משמאל) 2.8 מיקרומטר (מימין) חרוזs. הנתונים היו כשירים לתפקד אמפירית , כאשר x הוא המרחק בין המגנט. = 31.8, B = 5.61, ו-C = 4.39 עבור 1 חרוזים מיקרומטר ו = 140, B = 3.10 ו-C = 1.86 במשך 3 חרוזים מיקרומטר. ערכים אלה הם ספציפיים למכשיר הספציפי שלנו וגיאומטריה ניסיוני, וכל מכשיר צריך להיות מכויל בנפרד. הסורגים שגיאה בשלב זה לייצג השתנות ~ 10% בכוח להחיל על חרוז בסיס חרוז, עקב השתנות בגודל חרוז. הכוח ליישם עומד ביחס לנפח של החרוזים, והיקף חרוז משתנה ~ 9% מעל הממוצע (על פי מפרט היצרן).

3. איור חיל proteolysis ההתקנה assay (לא בקנה מידה). Trimer מודל קולגן מחובר אל פני השטח של coverslip דרך מ 'י"ס / אנטי-myc הצמידה. Streptavidin מצופה חרוזים פאראמגנטי מחוברים את trimers קולגן באמצעות הצמדה ביוטין-streptavidin. פעיל MMP-1 חותך את קולגן לאורך זמן, גורם החרוזים לנתק מפני השטח ולעבור מן המטוס מרחק.

איור 4. הקריקטורה סכמטי של proteolysis כפונקציה של הזמן. הקריקטורה מראה שדה מדגם של נוף עם הזמן, ככל proteolysis מתרחשת. עם הזמן, MMP-1 חותך את הקולגן ואת חרוזים להתנתק ולהתרחק מהמטוס מוקד בהשפעת השדה המגנטי.

איור 5. שיעורי proteolysis תלוי יישומי כוח ^16. הם הראו הנתונים שנאספו על 1.0 PN (3 מיקרומטר MMP-1, שחור), 6.2 PN (3 מיקרומטר MMP-1, אדום) ו 13 pn (0.2 מיקרומטר MMP-1, קוסםנ.ת. ע). שיעורי proteolysis פרמטרים (בכושר) הם: 0.22 ± 0.02 דק ^'-1 (1 PN), 0.46 ± 0.09 דק' ^-1 (6.2 PN), ו 2.08 ± 0.18 דק ^'-1 (13 PN). את החלק היחסי של חרוזים unproteolyzed בנקודות זמן רב (> 15 דקות) נשארת קבועה על כ ~ 0.25 על ניסויים שונים. ברים שגיאה מתאימות הסטטיסטיקה פואסון המשקף את מספר התצפיות בכל נקודת זמן. שגיאה בכל נקודת זמן חרוזים n הוא n ^1/2. שגיאה בשבריר של חרוזים המחוברים חושב על ידי שגיאה propagation.1 חרוזים מיקרומטר שימשו PN 1.0 ו 6.2 ניסויים PN ו -2.8 מיקרומטר חרוזים שימשו 13 ניסויים PN.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שימוש חדש במולקולה טכניקה קלאסית אחת. פינצטה מגנטיים מאפשרים בינונית עד גבוהה התפוקה מבחני מולקולה בודדת בצורה יעילה וחסכונית. עם זאת, כמו כל ניסיוני בטכניקות ישנם אתגרים ואת החסרונות פוטנציאליים.

מגבלות פינצטה מגנטיים

לעומת מלכודת אופטי רזולוציה במרחב ובזמן של מנגנון MT הוא נמוך. יתר על כן, הכוחות שנוצר על ידי MT הפשוטה המתוארת כא...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
מיקרו כיסוי זכוכית # 1.5 (22x22)	VWR	48366-067
מיקרו כיסוי זכוכית # 1.5 (22x40)	VWR	48393-048
Lambda-DNA	Invitrogen	25250-010
האנזים T4 DNA	Invitrogen	15224-041
Microcon Ultracel YM-100	Millipore	42413
נגד Digoxigenin	Roche Diagnostics	11-333-089-001
Tween 20	סיגמא	P9416-100 מ"ל
Anti-myc נוגדן	Invitrogen	46-0603
שור אלבומין בסרום	סיגמא	B4287-5G
Dynabeads M-280 streptavidin	Invitrogen	658.01D
Dynabeads MyOne T1 streptavidin	Invitrogen	658.01D
P-Aminophenylmercuric Acetate	Calbiochem	164610
ביוטין-Maleimide	סיגמא אולדריץ'	B1267
ביוטין שכותרתו oligo	IDT-DNA	התאמה אישית סינתזה
Digoxigenin שכותרתו oligo	IDT-DNA	התאמה אישית סינתזה
קולגןהפפטיד גן	ה-DNA 2.0	התאמה אישית סינתזה
MMP-1 cDNA	הרווארד פלסמיד מסד נתונים
Z-מתרגם	Thorlabs	MTS50
סרוו בקר על המתרגם	Thorlabs	TDC001