הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיפור האינדוקציה אפופטוטיים, Autophagic ידי אנלוגי רומן סינתטי C-1 של deoxypancratistatin-7 ב אדנוקרצינומה השד האדם תאים neuroblastoma עם טמוקסיפן

18.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/3586

⸱

30 במאי 2012

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 2Chemistry Department and Centre for Biotechnology, Brock University

במאמר זה

סיכום

יש לנו מסונתז אנלוגי הרומן של pancratistatin עם פעילות נוגדת סרטן דומה כמו pancratistatin יליד; מעניין, טיפול הקומבינטורית עם טמוקסיפן הניב שיפור דרסטי אינדוקציה אפופטוטיים ו autophagic ידי המיטוכונדריה מיקוד עם השפעה מזערית על fibroblasts סרטני. לכן, JCTH-4 בשילוב עם טמוקסיפן יכול לספק טיפול בטוח נגד סרטן.

תקציר

סרטן השד הוא אחד מסוגי הסרטן השכיחים ביותר בקרב נשים בצפון אמריקה. רבים כיום טיפולים נגד סרטן, כולל קרינה מייננת, לעורר אפופטוזיס באמצעות נזק לדנ"א. למרבה הצער, טיפולים כאלה הם לא סלקטיבית לתאים הסרטניים מייצרים רעילות דומה תאים נורמליים. דיווחנו אינדוקציה סלקטיבית של אפופטוזיס של תאים סרטניים על ידי pancratistatin מרכיב טבעי (PST). לאחרונה, PST רומן אנלוגי, נגזרת C-1 acetoxymethyl של 7-deoxypancratistatin (JCTH-4), הופק על ידי סינתזה דה נובו והוא מציג התרמה דומה סלקטיבית פעילות אפופטוזיס של שורות תאים סרטניים שונים. לאחרונה, autophagy היה מעורב ממאירות כמו ההישרדות-Pro וגם תומכי המוות מנגנוני בתגובה כימותרפיה. טמוקסיפן (TAM) הוכיחה תמיד אינדוקציה של autophagy הפרו הישרדות סוגי סרטן רבים. במחקר זה, יעילותם של JCTH-4 לבד או ביחד עם TAM לגרום מותם של תאים cance השד האנושיR (MCF7) ו נוירובלסטומה (SH-SY5Y) תאים הוערך. TAM לבד המושרה autophagy, אבל מוות של תאים חסר משמעות בעוד JCTH-4 לבדה גרמה לזירוז משמעותי של אפופטוזיס עם אינדוקציה חלק autophagy. מעניין לציין, כי הטיפול הקומבינטורית הניבו עלייה דרסטית אינדוקציה אפופטוטיים ו autophagic. אנחנו במעקב זמן תלויי שינויים מורפולוגיים MCF7 תאים שעברו TAM-Induced autophagy, JCTH-4-induced אפופטוזיס ו autophagy, ומוות תאים מואצת עם טיפול קומבינטורית באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ. אנחנו הוכיחו התרכובות הללו כדי לגרום לאפופטוזיס / autophagy ידי מיקוד המיטוכונדריה אלה תאים סרטניים. חשוב לציין, טיפולים אלה לא השפיעו על ההישרדות של fibroblasts אדם סרטניים. לפיכך, תוצאות אלה מצביעות על כך JCTH-4 בשילוב עם TAM יוכל לשמש כטיפול נגד סרטן בטוח חזק מאוד מפני סרטן השד תאים neuroblastoma.

פרוטוקול

הקדמה

אפופטוזיס, או הקלד אני מוות תאים מתוכנת, הוא תהליך פיזיולוגי שיכול לפעול extrinsically, באמצעות קשירה של ליגנד לקולטן מוות מוות, או באופן מהותי. מסלול הפנימי של אפופטוזיס הוא שיזם מתח תאיים כמו נזק לדנ"א ואת תפקוד המיטוכונדריה, זה מוביל בסופו של דבר permeabilization של פיזור, המיטוכונדריה של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה (MMP), שחרור של גורמים apoptogenic מהחלל intermembrane המיטוכונדריה, וביצוע הבאים של אפופטוזיס 1.

Autophagy הוא תהליך שבו התא הפסקות, מבזה, ו ממחזר מרכיבים תאיים שלה, תוך שמירה על שלמות קרום הפלזמה, היא מופעלת על ידי סוגים שונים של לחצים הסלולר כולל היפוקסיה לחץ חמצוני, אגרגטים חלבון, מחסור תזונתי, מחסור גורם צמיחה, אברונים פגומים 2. בשלבים הראשוניםבתהליך זה, החומר cytosolic נבלע על ידי autophagosomes, פעמיים membraned שלפוחית, אשר מתחברות lysosomes כדי ליצור autolysosomes. הודעה היתוך lysosomal, חומרים cytosolic שננקטו בעבר על ידי autophagosomes מפורקים על ידי אנזימי lysosomal 2. הפעלה נרחבת של מסלול זה מניב השפלה נרחב של מרכיבים תאיים דבר שעלול להוביל למוות התא autophagic או סוג ב 'מוות מתוכנת התא 3.

ההתחמקות של מוות של תאים נחשב לאחד מסימני ההיכר של סרטן 4. סרטן היא מחלה המאופיינת על ידי גידול תאים בלתי מבוקרת ועל ריבוי 5. בפרט, neuroblastoma נובעת פיתוח בתאי העצב של מערכת העצבים הסימפתטית מן הרכס העצבי 6. זהו הגידול המוצק השכיח ביותר המתרחשים אצל ילדים צעירים, המהווה כ -9% ממקרי סרטן בילדות 7. למרות ההתקדמות הרבה שנעשתה עד היום, מחלה זו נותרה בעייתיתלשני מדענים ורופאים. מצד שני, סרטן השד הוא הסרטן השכיח ביותר בקרב נשים 8. טמוקסיפן (TAM) נעשה שימוש לעתים קרובות הורמונים תגובה סרטן שד לטיפול כמו קולטן אסטרוגן (ER) אנטגוניסט 9. עם זאת, דיווחים אחרים לספק ראיות של מנגנונים עצמאיים נוספים של אינדוקציה אפופטוזיס תם. בפרט, TAM אינטראקציה עם קומפלקס אני שרשרת הנשימה במיטוכונדריה (MRC) בשעה mononucleotide שלה פלבין (FMN) אתר 10.

PST הוא תרכובת טבעית בודד מצמח Hymenocallis littoralis. בניגוד מ chemotherapeutics רבים כיום בשימוש, הוכח לגרום אפופטוזיס, באופן בלתי genotoxic, סלקטיבי תאים מסוגים שונים סרטן באמצעות המיטוכונדריה מיקוד 11-15. עם זאת, העבודה פרה קליניים התעכבה בשל זמינותו, אלא נוכח כמויות נמוכות מאוד במקור הטבעי complic רביםations נטל סינתזה כימית שלה. יש לנו מסונתז ולא הוקרן אנלוגים סינתטיים של deoxypancratistatin-7 ו נצפתה פעילות דומה נגד סרטן נגזרת C-1 acetoxymethyl, JC-TH-acetate-4 (JCTH-4) 16. עכשיו יש לנו ביד אנלוגי סינתטי PST עם פעילות נוגדת סרטן עוצמה. הסינתזה שלו היה סטנדרטי וניתן לשנותם עד כדי לייצר כמויות מספיקות לעבודה פרה קליניים. מאז PST טבעי TAM הן היעד המיטוכונדריה, זה יהיה מעניין לחקור את ההשפעה המשולבת של באנלוג סינתטי של PST על סרטן השד אנושי בתאי נוירובלסטומה בשילוב עם TAM.

במסמך זה אנו מדווחים cytotoxicity סלקטיבית של JCTH-4 ב neuroblastoma האנושי (SH-SY5Y) ו אדנוקרצינומה של השד (MCF7) תאים. JCTH-4 הצליח לגרום אפופטוזיס בשתי שורות תאים על ידי מיקוד המיטוכונדריה; JCTH-4 נגרם בזבוז של MMP וגידול מינים החמצן מגיב (ROS) ייצור מבודד mitochondria אלה תאים סרטניים. יתר על כן, autophagy היה המושרה על ידי JCTH-4 ב MCF7 תאים. מעניין לציין, כי תוספת של TAM לפגיעה-4 JCTH לשפר את ההשפעות הנ"ל של JCTH-4 ב SH-SY5Y ו MCF7 תאים. שינויים מורפולוגיים הנגרמת על ידי JCTH-4 ו TAM לבד או ביחד ב MCF7 תאים נוטרו באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות של ניגוד שלב או תמונות שדה בהירים. רגיל fibroblasts העובר אדם (NFF) הציג ירידה ניכרת רגישות JCTH-4 הן לבד והן בשילוב עם TAM. לכן, מקרים אלה מצביעים על JCTH-4, לבד, עם TAM, להיות סוכן כימותרפיות בטוח ויעיל מפני סרטן השד נוירובלסטומה.

חומרים ושיטות

1. תא תרבות

  1. לגדול תרבות SH-SY5Y neuroblastoma תאים אנושיים (ATCC, חתול. ארה"ב לא CRL-2266, Manassas, VA,) עם המדיום שינוי הנשרים של Dulbecco F-12 HAM (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, קנדה) בתוספת 2 מ"מ L-glutaminאלקטרוני, 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו - 10 מ"ג / מ"ל ​​גנטמיצין (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, קנדה). לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. לגדול בתרבות MCF7 אדם אדנוקרצינומה בשד תאים (ATCC, חתול. לא HTB-22, Manassas, וירג 'יניה, ארה"ב) בשנת 1640 RPMI בינוני (Sigma-Aldrich קנדה, Mississauga, ON, קנדה) בתוספת 10% FBS סטנדרטי (Thermo מדעי, Waltham, MA) ו 10 מ"ג / מ"ל ​​גנטמיצין (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, קנדה). לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. לגדול בתרבות פיברובלסטים נורמליים ככל הנראה העובר האנושי (NFF) שורת תאים (Coriell המכון למחקר רפואי, חתול. לא AG04431B, קמדן, ניו ג'רזי, ארה"ב) ב בינוני שינוי Dulbecco של הנשרים, גלוקוז גבוהות (Thermo Scientific, Waltham, MA, ארצות הברית ) השלימו עם 15% FBS ו 10 מ"ג / מ"ל ​​גנטמיצין (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, קנדה). לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.

2. התרופה הכנה

  1. לשקול את טמוקסיפן (TAM) מלח ציטרט (Sigma-Aldrich, חתול. לא T9262, Mississauga, ON, קנדה) לפזר אותו DMSO להכין פתרון המניה 10 מ"מ. במלאי החנות פתרון ב -20 ° C עד השימוש. הרכב כל הפקדים השתמשו במחקר זה הכיל DMSO על פחות מ -0.5%.
  2. חזור על שלב 2.1 להכין פתרון המניה 1 mM מומס DMSO של JC-TH-acetate-4 (JCTH-4), המיוצר על ידי סינתזה chemoenzymatic מ bromobenzene כפי שתואר קודם לכן 16. במלאי החנות פתרון ב -20 ° C עד השימוש. הרכב כל הפקדים השתמשו במחקר זה הכיל DMSO על פחות מ -0.5%.

3. זמן לשגות מיקרוסקופית

  1. צלחת כ 2.0 x 10 5 MCF7 תאים 35 מ"מ זכוכית התחתונה הכלים תרבות (MatTek Corporation, חתול. לא P35G-014-C, אשלנד, מסצ'וסטס, ארה"ב) בתנאים סטריליים של הממשלה השנייה biosafety בכיתה ולאפשר להם לגדול 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. כאשר התאים מגיעים מפגש 60-70%, להתייחס אליהם עם 1 מיקרומטר JCTH-4 באמצעות 1 מ"מהמניות פתרון מומס DMSO ו TAM 10 מיקרומטר באמצעות פתרון המניה 10 mM מומס DMSO, לבד או ביחד השנייה בכיתה ב biosafety הממשלה.
  3. לאחר הטיפול התאים למשך 48 שעות, תאים מקום בתא מחומם על 37 מעלות צלזיוס עם CO 5% 2 על הבמה של מיקרוסקופ הלייקה DMI6000 ניאון (Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה).
  4. שימוש LAS AF6000 תוכנה, להגדיר את המיקרוסקופ לקחת בניגוד שלב או micrographs שדה בהירים בהגדלה 400x כל 5 דקות במשך 18 שעות.

4. הגרעין מכתים

  1. צלחת כ 2.0 x 10 5 MCF7 או SH-SY5Y התאים של כל אחד 6 ברור גם צלחת רקמת התרבות התחתונה השנייה בכיתה biosafety הממשלה ולאפשר להם לגדול ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. כאשר התאים מגיעים מפגש 60-70%, להתייחס אליהם עם 1 מיקרומטר JCTH-4 באמצעות פתרון המניה 1 mM מומס DMSO ו TAM 10 מיקרומטר באמצעות פתרון המניה 10 mM מומס DMSO, הןלבד או ביחד ב ב בכיתה biosafety הממשלה.
  3. דגירה תאים עם הטיפולים הנ"ל ב 37 ° C ו - 5% CO 2 למשך 48 שעות (SH-SY5Y תאים) או 72 שעות (MCF7 תאים).
  4. לאחר טיפול הדגירה של תאים עם תרופות, להוסיף ישירות Hoechst 33342 צבע (בדיקות מולקולריות, יוג'ין, או, ארה"ב) לתקשורת של תאים שטופלו לריכוז סופי של 10 מיקרומטר להכתים גרעינים.
  5. דגירה של תאים עם צבע Hoechst במשך 5 עד 10 דקות מוגנים מפני אור.
  6. מניחים את הצלחת על במת המיקרוסקופ DM Leica IRB הפוך הקרינה (Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה).
  7. קח micrographs הניאון בשלב בהגדלה 400x.

5. Annexin V Assay עקידת

  1. צלחת כ 5.0 x 10 5 MCF7, SH-SY5Y או תאים NFF ב 10 מ"ל רקמות צלחות תרבות ב II בכיתה biosafety הממשלה ולאפשר להם לגדול ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. Wתאים תרנגולת להגיע מפגש 60-70%, להתייחס אליהם עם 1 מיקרומטר JCTH-4 באמצעות פתרון המניה 1 mM מומס DMSO ו TAM 10 מיקרומטר באמצעות 10 המניות mM פתרון מומס DMSO, הן לבד והן בשילוב של הכיתה השנייה biosafety הקבינט.
  3. דגירה תאים עם הטיפולים הנ"ל ב 37 ° C ו - 5% CO 2 למשך 48 שעות (SH-SY5Y תאים) או 72 שעות (MCF7 ותאי NFF).
  4. הכן Annexin חיץ V מחייב DDH 2 O עם 10 HEPES מ"מ, 10 mM NaOH, 140 מ"מ NaCl, ו 1 mM CaCl 2 ב-pH 7.6 וחנות ב 4 ° C עד השימוש.
  5. לאחר טיפול הדגירה של תאים עם סמים, להסיר את מדיה לוחות המכילים תאים המרחפים ולמקם אותו לתוך צינור נפרד מ"ל 15 חרוטי לכל קבוצת טיפול שונה שכותרתו עם הטיפול הנכון.
  6. ניתוק תאים חסיד מהצלחות באמצעות טריפסין.
  7. אחרי התאים הרים מהצלחת כתוצאה טריפסין, לשאוב התקשורת להציב 15 מ"ל חרוטיצינור אל בשלב 5.4 ולמקם אותו בחזרה צלחות המקוריים עם התאים המרחפים טריפסין.
  8. עם מילוי פיפטה אלקטרונית סרולוגיות בטפי להחדרת נוזלים, לערבב את התקשורת עם פתרון התא טריפסין ומניחים את התערובת בחזרה -15 צינורות המתאימים חרוטי מ"ל.
  9. בצנטריפוגה תאים ב XG 600 במשך 5 דקות על 4 ° C, להסיר את supernatant מהצינור זה, ותאי resuspend ב PBS.
  10. בצנטריפוגה תאים ב XG 600 במשך 5 דקות, להסיר את supernatant מהצינור זה, ותאי resuspend בשפופרות microfuge תווית עם μL על 50-70 של המאגר V Annexin מחייב.
  11. הוסף Annexin V AlexaFluor-488 (1:50) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, קנדה) Hoechst צבע לריכוז סופי של 10 מיקרומטר ו דגירה במשך 15 דקות מוגנים מפני אור.
  12. הדגירה הבאה, מערבולת אחד הצינורות microfuge, להוסיף 7-10 μL של התערובת בתא לשקופית מיקרוסקופ, מקם מעליהן coverslip תערובת תאים על microscopשקופיות דואר ולקחת micrographs ניאון, הן וולט Annexin ו Hoechst תמונות עבור כל תצוגה, בהגדלה 400x על IRB Leica DM הפוך מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה). חזור על הפעולה עבור כל דגימה הניסוי בכל אחד הצינורות microfuge הנותרים.

6. Tetrazolium מסיס במים מלח (WST-1) Assay על כדאיות התא

  1. Trypsinize בקבוק confluent T75 או 10 ס"מ רקמות תרבות צלחת MCF7, SH-SY5Y או תאים NFF ב II בכיתה biosafety הממשלה.
  2. אחרי התאים הוסרו, מוסיפים 5-10 מ"ל של התקשורת טריפסין ומניחים ההשעיה תא התקשורת בצינור מ"ל 15 חרוטי.
  3. בצנטריפוגה תאים ב XG 600 במשך 5 דקות, מניחים את הצינור לתוך ארון בטיחות ביולוגית, הסר supernatant מהצינור כל אחד, resuspend התאים מ"ל בערך 1 עד 3 מתוך התקשורת בהתאם לגודל התא גלולה.
  4. מקום 10 μL ההשעיה תא צינור microfuge, להוסיף 10 μL של Trypan צבע כחול (Sigma אולדריץ, Mississauga, ON, קנדה), ומערבבים עם micropipette.
  5. טען 10 μL של תאים Trypan כחול מושעה על haemocytometer (האוסר מדעי, ארה"ב), לספור את התאים, ולחשב את ריכוז התאים של השעיה תא הצינור המקורי חרוטי 15 מ"ל.
  6. השתמש ריכוז כדי לקבוע את עוצמת הקול של ההשעיה התא המקורי צורך ליצור השעיות סלולריים מדולל בריכוז של 1.5 x 10 5 תאים למ"ל עבור MCF7 ו SH-SY5Y ו 5.0 x 10 4 עבור תאים NFF הדרושים ציפוי.
  7. השתמש השעיות סלולריים מדולל לצלחת 15 x 10 3 MCF7 או SH-SY5Y תאים / טוב או 5.0 x 10 3 תאים NFF / גם על ידי הוספת 100 μL של המתלים סלולריים מדולל היטב כל אחד 96 גם רקמות ברור הצלחת התחתונה התרבות. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך הלילה.
  8. פנקו את התאים עם 1 מיקרומטר JCTH-4 ו 10 מיקרומטר תם הן לבדן או ביחד השנייה בכיתה ב biosafety ארון שעה 72s עבור MCF7 ותאי NFF, ובמשך 48 שעות SH-SY5Y תאים.
  9. לאחר טיפול הדגירה של תרופות, להוסיף 10 μL של WST-1 מגיב (Roche Applied Science, אינדיאנפוליס, אינדיאנה, ארה"ב) זה טוב דגירה הצלחת במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  10. קח קריאות ספיגת ב 450 ננומטר על ויקטור Wallac 3 1420 Multilabel מונה (PerkinElmer, וודברידג', על, קנדה) ולהביע בהם אחוז בקבוצת הביקורת ממס.

7. Tetramethylrhodamine מתיל אסתר (TMRM) מכתים

  1. מניחים coverslip לבאר כל אחד 6 ברור גם צלחת רקמת התרבות התחתונה צלחת MCF7 התאים של כל אחד צלחת 6 התרבות גם רקמות ארון בכיתה biosafety השנייה. לאפשר להם לגדול ב 37 ° C ו-CO 5% 2.
  2. כאשר התאים מגיעים מפגש 60-70%, להתייחס אליהם עם 1 מיקרומטר JCTH-4 באמצעות פתרון המניה 1 mM מומס DMSO ו TAM 10 מיקרומטר באמצעות פתרון המניה 10 mM מומס DMSO,הן לבד והן בשילוב של Class II biosafety הממשלה.
  3. דגירה תאים עם הטיפולים הנ"ל ב 37 ° C ו - 5% CO 2 למשך 72 שעות.
  4. לאחר טיפול הדגירה של תאים עם תרופות, להוסיף ישירות Hoechst 33342 צבע (בדיקות מולקולריות, יוג'ין, או, ארה"ב) לתקשורת של תאים שטופלו לריכוז סופי של 10 מיקרומטר להכתים גרעינים כמו גם tetramethylrhodamine מתיל אסתר (TMRM ) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, קנדה) בריכוז הסופי של 200 ננומטר.
  5. דגירה של תאים עם צבעים ב 5% CO 2 ו - 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות מוגנים מפני אור.
  6. פיפטה 8 μL של התקשורת או PBS לשקופית מיקרוסקופ ולקחת coverslip מהצלחת 6 היטב ומניחים אותו על גבי מדיה או PBS בשקופית מיקרוסקופ עם התאים פונה כלפי מטה עם פינצטה.
  7. קח micrographs ניאון, הן Hoechst ו micrographs TMRM עבור כל תצוגה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי IRB DM Leica הפוכה (Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה) בהגדלה 400x.

8. מיטוכונדריאלי בידוד

  1. הכן על 10 מ"ל של חיץ hypotonic (1 mM EDTA, 5 מ"מ טריס-HCl, 210 מ"מ מניטול, סוכרוז 70 מ"מ, 10 מיקרומטר Leu-PEP, 10 מיקרומטר פפ-A, ו 100 מיקרומטר PMSF) ו - חיץ התגובה לשמור על שני פתרונות על קרח.
  2. עם כ 8-10 confluent T75 תרבות צלוחיות של רקמות SH-SY5Y תאים, trypsinize את התאים, להוסיף מדיה לנטרל את טריפסין, לאסוף את המתלים סלולריים ב -50 צינורות חרוטי מ"ל, ו בצנטריפוגה צינורות ב XG 600 במשך 5 דקות על 4 ° ג
  3. מוציאים את כדורי סלולריים supernatant ו resuspend מ"ל כ -10 עד 20 מתוך קר PBS, בצנטריפוגה צינורות ב XG 600 במשך 5 דקות על 4 ° C, לחזור על תהליך זה לשטוף פעם אחת.
  4. הסר את supernatant ו resuspend התאים במאגר hypotonic קר. Homogenize התאים באופן ידני עם מטחנת רקמת זכוכית בצנטריפוגה lysate התא XG 600 במשך 5 דקות על 4 ° C.
    5. בצנטריפוגה supernatant כתוצאה בשעה XG 15,000 במשך 15 דקות 4 ° C. הסר את supernatant cytosolic ו resuspend גלולה המיטוכונדריה במאגר התגובה קר.

9. Amplex Assay האדום

  1. אחרי בידוד המיטוכונדריה מהתאים, להעריך את הריכוז של חלבון המדגם של המיטוכונדריה מבודד באמצעות עקומת תקן של ריכוזים ידועים של BSA (1mg/mL שור אלבומין סרום) עם assay חלבון BioRad (Bio-Rad Laboratories, הרקולס, קליפורניה ארה"ב) .
  2. באמצעות ריכוז מוערך של חלבון הפתרון המיטוכונדריה מבודד, לחשב את עוצמת הקול של פתרון זה לתת 20 מיקרוגרם של חלבון. פיפטה זה נפח לבאר כל צלחת 96-גם אטום כדי לטעון 20 מיקרוגרם של חלבון / טוב.
  3. ממלאים כל טוב בצלחת לנפח כולל של 100 μL עם חיץ התגובה, טיפול תרופתי (עם הריכוז הסופי של 1 מיקרומטר JCTH-4, ו / או TAM 10 מיקרומטר, או 250 מיקרומטר PQ (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON , גanada) משמש כביקורת חיובית), מגיב Amplex האדום בריכוז סופי של 50 מיקרומטר, ואת חזרת peroxidase (HRP) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, קנדה) ביחס של μL U/200 6.
  4. לאחר דגירה 2 שעה, לקחת קריאות הקרינה על אקס. 560 ננומטר ו אם. 590 ננומטר על spectrofluorometer (SpectraMax XPS ג'מיני, התקנים מולקולריים, Sunnyvale, קליפורניה, ארה"ב).

10. הכנה נייד lysate

  1. לגדול MCF7 התאים מפגש 60-70% ב -10 רקמות צלחות ס"מ תרבות.
  2. פנקו את התאים עם 1 מיקרומטר JCTH-4 ו 10 מיקרומטר תם לבד או ביחד במשך 72 שעות עם כ 10-15 צלחות בכל קבוצת טיפול.
  3. הכן תמוגה חיץ התא (10 mM Tris HCl ב-pH 7.2, 5 מ"מ KCl, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100, 10 מיקרומטר Leu-PEP, 10 מיקרומטר פפ-A, ו - 100 מיקרומטר PMSF ) ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש.
  4. מכנית לסלק תאים משטחי צלחת עם מגרד תא ולאסוף תאים 50 שכותרתומ"ל צינורות דמויי קונוס.
  5. בצנטריפוגה צינורות ב XG 600 במשך 5 דקות על 4 ° C, להסיר את כדורי סלולריים supernatant ו resuspend מ"ל כ -10 עד 20 מתוך קר PBS, צנטריפוגה צינורות ב XG 600 במשך 5 דקות 4 ° C, לחזור על תהליך הכביסה פעם אחת.
  6. הסר את supernatant ו resuspend התאים במאגר תא קר תמוגה. Homogenize התאים באופן ידני עם מטחנת רקמת זכוכית בצנטריפוגה lysate התא XG 600 במשך 5 דקות על 4 ° C.
  7. מחק את כדורי ולאחסן את lysates סלולריים ב -20 ° C עד השימוש.

11. מחי ניתוח המערב

  1. לקבוע את ריכוז החלבון של lysates סלולריים באמצעות assay חלבון BioRad (Bio-Rad Laboratories, הרקולס, קליפורניה ארה"ב). להכפיף את דגימות חלבון עמוד SDS וחלבון העברה קרום nitrocellulose.
  2. לאחר ההעברה, ממברנות לחסום עם 5% w / v חלב TBST (טריס שנאגרו מלוחים Tween-20) פתרון לשעה 1.
  3. בדיקה ממברנות עם נמלהi-LC3 נוגדנים וגדל ארנב (1:500) (נובוס ביולוגיות, חתול. לא NB100-2220, ליטלטון, CO, ארה"ב), או נוגדנים נגד β-אקטין וגדל העכבר (1:1000) (סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, Inc, חתול. לא SC-81178, פאסו רובלס, קליפורניה, ארה"ב) לילה ב 4 ° C.
  4. ממברנות נושא עד דקה 15 1 ושני 5 שוטף דקה TBST ו דגירה עם העכבר נגד (1:2000) או ארנבת אנטי (1:2000) חזרת peroxidase-מצומדות נוגדנים משני (Abcam, חתול. לא ab6728 & ab6802, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"ב) במשך שעה 1 ב 4 ° C.
  5. ממברנות נושא שלושה שוטף 5 דקות רצופות TBST ולדמיין להקות חלבון מגיב chemiluminescence משופרת (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, קנדה).
  6. בביצוע ניתוחים צפיפות באמצעות ImageJ התוכנה.

12. Monodansylcadaverine (MDC) מכתים

  1. מניחים coverslip לבאר כל אחד 6 ברור גם צלחת רקמת התרבות התחתונה צלחת MCF7 התאים של כל אחד 6גם התחתונה ברורה רקמת התרבות הצלחת השנייה בכיתה biosafety הממשלה. לאפשר להם לגדול ב 37 ° C ו-CO 5% 2.
  2. כאשר התאים מגיעים מפגש 60-70%, להתייחס אליהם עם 1 מיקרומטר JCTH-4 באמצעות פתרון המניה 1 mM מומס DMSO ו TAM 10 מיקרומטר באמצעות 10 המניות mM פתרון מומס DMSO, הן לבד והן בשילוב של הכיתה השנייה biosafety הקבינט.
  3. דגירה תאים עם הטיפולים הנ"ל ב 37 ° C ו - 5% CO 2 למשך 72 שעות.
  4. לאחר טיפול הדגירה של תאים עם סמים, להוסיף ישירות Monodansylcadaverine (MDC) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, קנדה) לריכוז סופי של 0.1 מ"מ היטב כל 15 דקות.
  5. דגירה תאים עם צבע 5% CO 2 ו - 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות מוגנים מפני אור.
  6. פיפטה 30 μL של התקשורת או PBS לשקופית מיקרוסקופ ולקחת coverslip מהצלחת 6 היטב ומניחים אותו על גבי מדיה או PBS בשקופית מיקרוסקופ עם תאים faciמטה נג עם פינצטה.
  7. קח ניאון MDC ו micrographs שלב, עבור כל תצוגה, עם IRB DM Leica הפוך מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה) בהגדלה 400x.

13. נציג תוצאות

אינדוקציה סלקטיבית של אפופטוזיס אדנוקרצינומה השד האדם תאים neuroblastoma ידי JCTH-4: שיפור של פעילות על ידי TAM

אינדוקציה סלקטיבית של אפופטוזיס הוצגה על ידי תאים סרטניים שונים טבעית PST (איור 1 א) 11-13. בשל זמינות נמוכה של PST, יש לנו מסונתז אנלוגים של 7-deoxypancratistatin (JCTH-4, איור. 1B) ו הוקרן אותם לפעילות נגד סרטן השד דומה אדנוקרצינומה האנושי (MCF7) ותאי נוירובלסטומה (SH-SY5Y). בשלב הראשון של ניסויים, רצינו לעקוב אחר שינויים מורפולוגיים לאורך זמן לאחר טיפול JCTH-4 ו TAM לבד או ביחד בתא MCF7s. MCF7 התאים היו במעקב במשך 18 שעות, כפי שניתן לראות וידאו 1 מיוצר על ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות עם תמונות בניגוד שלב, עם טיפול ממס (שליטה) על 48 שעות; תאים אלה הציג שום שינויים משמעותיים המורפולוגיה. לעומת זאת, לאחר 48 שעות של טיפול 1 מיקרומטר JCTH-4, תאים אלו הוצגו שינויים מורפולוגיים הקשורים אפופטוזיס כגון התכווצות, blebbing, במבנה הגוף אפופטוטיים כמו לראות וידאו 2. מצד שני, טיפול TAM לבד MCF7 תאים המיוצרים המורפולוגיה שונה מאוד כולל תכלילים punctate המעידים על autophagosomes הקשורים autophagy (Video 3). מורפולוגיה אפופטוטיים מאוד מינימלי נצפתה ותאים בריאים בדרך כלל בתערוכות מורפולוגיה דומה לשליטה ממס טיפול MCF7 תאים. מעניין, בנוכחותו של TAM, אינדוקציה אפופטוטיים ידי JCTH-4 היה משופר בצורה דרסטית כפי שצוין על ידי המורפולוגיה אפופטוטיים מוגברת MCF7 תאים לאחר 48 שעות, כמו illustratאד וידאו 4.

בשלב השני של הניסויים השתמשנו צבעי ניאון כדי להעריך את אינדוקציה של אפופטוזיס. לאחר 72 שעות ו 48 שעות של טיפול 1 מיקרומטר JCTH-4 ב MCF7 ו SH-SY5Y תאים בהתאמה, Hoechst צבע היה בשימוש, כדי לפקח על מורפולוגיה גרעינית. התוצאות הצביעו על גרעין מרוכז, מוכתם בהיר מלווה גופים אפופטוטיים ב MCF7 ו SH-SY5Y תאים, המעידים על אינדוקציה אפופטוטיים (איור 2 א ', ב). טיפול TAM לבדו הניב מינימלית מורפולוגיה גרעינית אפופטוטיים ב MCF7 ו SH-SY5Y תאים, גרעינים גדולים, עגולים, ומוכתם במעומעם עם Hoechst להשוות את קבוצת הביקורת ממס (איור 2 א ', ב). בהסכם עם 4 וידאו, גרעינים של MCF7 ו SH-SY5Y תאים מוצגים עלייה ניכרת מורפולוגיה אפופטוטיים עם טיפול משולב לאחר 72 שעות (איור 2 א ', ב).

כדי לוודא אינדוקציה אפופטוטיים, תאים הוערכו על עמ 'החצנה hosphatidylserine, סמן אפופטוזיס, באמצעות assay Annexin V מחייב 17. תאים MCF7 ו SH-SY5Y טיפול 72 ו 48 שעות בהתאמה עם 1 מיקרומטר JCTH-4 לבד או ביחד עם TAM 10 מיקרומטר נמצאו חיוביות Annexin V מחייב, שמסומן על ידי פלואורסצנטי ירוק, המאשר אינדוקציה של אפופטוזיס (איור 3 א ', ב' ). החצנה לא ברור של Phosphatidylserine נצפתה MCF7 ו SH-SY5Y תאים שטופלו TAM לבד, כמו גם בתאים שטופלו NFF כל הקבוצות הנ"ל טיפולים לאחר 72 שעות (איור 3 ג). לכן, JCTH-4 לבד או ביחד עם TAM סלקטיבי גורם אפופטוזיס MCF7 ו SH-SY5Y תאים.

כדי לכמת את ההשפעה של JCTH-4 לבד או ביחד עם TAM, WST-1 assay colorimetric מבוסס על כדאיות התא, המשקפת את חילוף החומרים בתא פעיל, בוצעה על MCF7 ותאי NFF טיפול במשך 72 שעות ו SH-SY5Y תאים מטופלים במשך 48 שעות.לעומת קבוצות הביקורת ממס, 1 מיקרומטר JCTH-4 ירידה במטבוליזם התא הפעיל על ידי% מעל 50, בעוד 10 מיקרומטר TAM לבד הציג הבדל משמעותי הן MCF7 ו SH-SY5Y התאים (איור 4 א, ​​ב). מעניין לציין כי ב MCF7 ו SH-SY5Y תאים, תוספת של TAM לפגיעה JCTH-4 לירידה סינרגיסטי בחילוף החומרים בתא. תאים NFF היו באופן דרסטי פחות רגישים גם-4 JCTH לבד JCTH-4 עם TAM (איור 4C). לפיכך, JCTH-4 מראה פעילות סינרגטית סלקטיבית עם TAM ב MCF7 ו SH-SY5Y תאים.

מיטוכונדריאלי הכוונת של JCTH-4

כדי לראות אם JCTH-4 הוא מיקוד המיטוכונדריה לגרום פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה אפופטוזיס בתאים שלמים הדור ROS במיטוכונדריה מבודד היה פיקוח. MCF7 התאים טופלו במשך 72 שעות ו מוכתם TMRM. 1 מיקרומטר JCTH-4 ירד MMP, שמסומן על ידי אובדן של אדום פלואורסצנטי (איור 5 א). עם זאת, עם הבנוסף הדואר של TAM 10 מיקרומטר, פיזור גדול יותר של MMP נצפתה, בעוד 10 TAM מיקרומטר בלבד לא הייתה השפעה ניכרת על MMP.

עם העלייה הדור ROS נקשרו כדי permeabilization קרום המיטוכונדריה ואינדוקציה אפופטוזיס, ייצור של ROS הוערך עם צבע Amplex האדום המיטוכונדריה מבודד SH-SY5Y תאים שטופלו 1 מיקרומטר JCTH-4 ו 10 TAM מיקרומטר, לבד או ביחד 18 -20. קריאות הקרינה באו לידי ביטוי גם יחידות הקרינה יחסית (RFU). עליות ROS הדור נצפו עם JCTH-4 תם בלבד (איור 5 ב '). מעניין לציין, כי הטיפול המשולב הניב עלייה גדולה בייצור ROS. Inducer ידוע של ייצור ROS במיטוכונדריה, PQ, נוצל כביקורת חיובית.

אינדוקציה של autophagy ידי JCTH-4 ו TAM

אינדוקציה Autophagic קשור לפגיעה כימותרפיות על ידי תרכובות שונות 3. כדי להעריך את הגיוס של autophagy, מכתים MDC בוצעה על MCF7 תאים שטופלו 1 מיקרומטר JCTH-4 ו 10 מיקרומטר תם לבד או ביחד במשך 72 שעות. הקרינה punctate כחול, מעיד על autophagosomes, היה נוכח MCF7 תאים שטופלו JCTH-4 ו TAM לבד או ביחד (איור 6 א). יש לציין כי עוצמת מכתים MDC היה הגדול ביותר בטיפול משולב, ואחריו TAM לבד, JCTH-4 לבד.

במהלך autophagy, microtubule הקשורים 1 חלבון לאור שרשרת 3 (LC3) הנמצאים בדרך כלל cytosol (LC3-I), היא lipidated עם phosphatidylethanolamine ואת מקומי לאחר מכן את הקרומים autophagosomal (LC3-II) 2. כדי לוודא את הגיוס של autophagy, רמות LC3-II נבדקו ב MCF7 תאים שטופלו במשך 72 שעות באמצעות ניתוח כתם המערבי. 1 מיקרומטר JCTH-4 המושרה מעט את ההמרה של LC3-I ל-II LC3 תוך 10 מיקרומטר TAM המיוצר בתגובה autophagic יותר (איור6 ב). מעניין לציין, כי הטיפול המשולב הביא הגיוס הגדול ביותר של autophagy, מניב LC3-II יחס LC3, אני עולה על 3. על כן, תוצאות אלו מראות אינדוקציה autophagic ב MCF7 תאים על ידי JCTH-4 ו TAM לבד או ביחד, עם התגובה הגדולה ביותר בתאים עם טיפול משולב.

משלימה וידאו 1. מורפולוגיה נייד של MCF7 תאים שטופלו עם שליטה ממס. MCF7 התאים נוטרו בין 48 ו - 66 שעות שלאחר הטיפול השליטה ממס (DMSO) באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ עם תמונות בניגוד שלב. תאים נשמרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תמונות נתפסו בהגדלה 400x. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .

משלימה וידאו 2. אינדוקציה של מורפולוגיה הסלולר אפופטוטיים ב MCF7 תאים שטופלו JCTH-4. MCF7 התאים נוטרו בין 48 לבין 66 שעות טיפול שנינות בהודעהח 1 מיקרומטר JCTH-4 באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ עם תמונות בניגוד שלב. תאים נשמרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תמונות נתפסו בהגדלה 400x. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .

משלימה וידאו 3. אינדוקציה של מורפולוגיה הסלולר autophagic ב MCF7 תאים שטופלו TAM. MCF7 התאים נוטרו בין 48 לבין 66 שעות טיפול תגובה עם TAM 10 מיקרומטר באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ עם תמונות בניגוד שלב. תאים נשמרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תמונות נתפסו בהגדלה 400x. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .

משלימה וידאו 4. מורפולוגיה אפופטוטיים משופרת על ידי JCTH-4 עם TAM ב MCF7 תאים. MCF7 התאים נוטרו בין 48 ו - 66 שעות טיפול תגובה עם מיקרומטר 1 הן JCTH-4 ו 10 TAM מיקרומטר באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ עם שלב המשךRAST תמונות. תאים נשמרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תמונות נתפסו בהגדלה 400x. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .

figure-protocol-1
באיור 1. השוואה מבנית של PST כדי אנלוגי 7-deoxy סינתטי. (א) המבנה הכימי של pancratistatin (PST). (ב) המבנה הכימי של JC-TH-acetate-4 (JCTH-4).

figure-protocol-2
איור 2. JCTH-4 גורם מורפולוגיה אפופטוטיים הגרעין עם פעילות משופרת עם TAM. המורפולוגיה של הגרעין (א) MCF7 ו (ב) SH-SY5Y תאים מטופלים במשך 72 ו - 48 שעות בהתאמה עם ריכוזים המצוין של TAM ו JCTH-4 צבעונית עם Hoechst צבע. בקבוצת הביקורת טופלו ממס (ד 'MSO). התמונות צולמו בהגדלה 400x על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר.

figure-protocol-3
איור 3. JCTH-4 גורם Phosphatidylserine החצנה לבד או ביחד עם TAM סלקטיבי בתאים סרטניים. Annexin V מחייב Phosphatidylserine מוחצן הוערך לאמת אינדוקציה אינדוקציה של אפופטוזיס (א) MCF7 (72 שעות), (ב) SH-SY5Y (48 שעות), ו (ג) NFF (72 שעות) תאים שטופלו JCTH-4 תם על ריכוזי הצביע. בקבוצת הביקורת טופלו ממס (DMSO). התמונות צולמו בהגדלה 400x על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר.

figure-protocol-4
TAM איור 4. משפר את יכולת הקיום של ירידה JCTH-4 סלקטיבי בתאים סרטניים. לוחות 96-Wi גם היו seededה (א) MCF7, (ב) SH-SY5Y, ו (ג) תאים NFF ומטופל עם JCTH-4 ו TAM על ריכוזי הצביע. MCF7 ותאי NFF טופלו במשך 72 שעות ו - SH-SY5Y טופלו במשך 48 שעות. הודעה טיפול תרופתי ו הדגירה, WST-1 מגיב נוספה כל טוב, קריאות ספיגת צולמו 450 ננומטר מבוטא באחוזים מכלל שליטה (DMSO). סטטיסטיקה בוצעו באמצעות הגרסה GraphPad פריזמה 5.0. ערכים באים לידי ביטוי כמו ממוצע ± סטיית תקן של 3 מ quadruplicates ניסויים בלתי תלויים. MCF7: * p <.001, ** p <0.0001 מול הביקורת, # p <0.05 לעומת 1 מיקרומטר JCTH-4; † p <0.0001 לעומת 10 מיקרומטר TAM. SH-SY5Y: * p <0.0005 מול הביקורת, # p <0.005 לעומת 1 מיקרומטר JCTH-4; † p <0.005 לעומת 10 TAM מיקרומטר. NFF: * p <0.005 לעומת 10 TAM מיקרומטר + ​​1 מיקרומטר JCTH-4 ב MCF7 תאים; # p <0.01 לעומת 10 TAM מיקרומטר + ​​1 מיקרומטר JCTH-4 ב SH-SY5Y תאים.

figure-protocol-5
איור 5. JCTH-4 ולפעול TAM על המיטוכונדריה. (א) MCF7 התאים גדלו ב coverslips ומטופל עם ריכוזים המצוין של תרופות במשך 72 שעות ו מוכתם TMRM להעריך MMP. התאים של קבוצת הביקורת טופלו ממס (DMSO). תמונות נתפסו בהגדלה 400x על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר. (ב) מבודדים המיטוכונדריה מ SH-SY5Y התאים טופלו JCTH-4 ו TAM על ריכוזי הצביע ייצור ROS הוערך עם המצע Amplex האדום נוכחות של peroxidase חזרת (HRP). קבוצת התאים שליטה טופלו ממס (DMSO). Paraquat (PQ) נעשה שימוש בריכוז של 250 מיקרומטר כביקורת חיובית. קריאות הקרינה התקבלו לאחר 2 שעות של טיפול אקס. 560 ננומטר ו אם. 590 ננומטר ו לידי ביטוי fluorescenc יחסיתיחידות דואר (RFU). סטטיסטיקה התקבלו באמצעות הגרסה GraphPad פריזמה 5.0. הנתונים הוא נציג של 3 ניסויים בלתי תלויים עם מגמות דומות. ערכים באים לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן של quadruplicates של ניסוי 1 עצמאי. * P <0.05, ** p <0.005, *** p <0.001 לעומת שליטה; # p <0.05 לעומת 1 מיקרומטר JCTH-4; † p <0.05 לעומת TAM 10 מיקרומטר; @ p <0.05 לעומת 250 מיקרומטר PQ.

figure-protocol-6
איור 6. TAM משפר אינדוקציה autophagic של JCTH-4. (א) MCF7 התאים גדלו ב coverslips ו נתון עלבון JCTH-4 ו TAM על ריכוזי הצביע עבור 72 שעות. בקבוצה תאים שליטה טופלו ממס (DMSO). נושא הטיפול, MCF7 תאים הוכתמו MDC לזהות vacuoles autophagic. תמונות נתפסו בהגדלה 400x על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר (.ב) ניתוח המערב למחוק בוצעו LC3 ו β-אקטין על lysates התא של MCF7 תאים שטופלו בריכוזים המצוין של תרופות במשך 72 שעות. ניתוחים Densitometric הוצאו להורג באמצעות תוכנת ImageJ. סטטיסטיקה בוצעו באמצעות הגרסה GraphPad פריזמה 5.0. ערכים באים לידי ביטוי כמו ממוצע ± SD. * P <0.05, ** p <0.005, *** p <0.0005 מול הביקורת, # p <0.001 לעומת 1 מיקרומטר JCTH-4; † p <0.001 לעומת 10 TAM מיקרומטר.

רשימת קיצורים.

ER קולטן אסטרוגן
FMN פלבין mononucleotide
JCTH-4 JC-TH-acetate-4
LC3 microtubule הקשורים 1 חלבון לאור שרשרת 3
MDC monodansylcadaverine
MMP mitochondrקרום ial פוטנציאל
MRC שרשרת הנשימה במיטוכונדריה
NFF רגיל פיברובלסטים העובר האנושי
PQ paraquat
PST pancratistatin
RFU יחידות הקרינה יחסית
ROS מינים חמצן תגובתי
TAM טמוקסיפן
TMRM tetramethylrhodamine מתיל אסטר

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תרכובות PST ו דומה הוכחו יש תכונות נוגדות סרטן 11-15,21. דיווחנו בעבר PST טבעי לערער את המיטוכונדריה בתאים סרטניים באופן סלקטיבי, אשר ובכך גורם אפופטוזיס על ידי שחרורו של גורמים apoptogenic 12,14. סביר להניח כי JCTH-4 פועלת באמצעות אותו מנגנון, JCTH-4 איור גרם לקריסת MMP ב MCF7 תאים כפי שהם נראים עם כתמים TMRM (איור 5 א), והגדילה את הדור של ROS במיטוכונדריה מבודד SH-SY5Y תאים ( 5 ב '), מעידים על תפקוד המי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי אבירי קולומבוס פרק 9671 (וינדזור, אונטריו), ו פרדריק בנטינג וצ'רלס CIHR הטוב ביותר בקנדה מלגת בוגר הוענק דניס אמא. תודה הודג' רוברט ואליזבת Fidalgo דה סילבה על עזרתם עם מיקרוסקופיה זמן לשגות. תודה קייטי Facecchia לעריכה על צילום בהילוך מהיר מיקרוסקופית. אנו רוצים גם להודות Sudipa יוני צ'אטרג'י ופיליפ Tremblay לבדיקה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו מוקדשת לזכרו של קווין Couvillon שאיבד את הקרב שלו נגד סרטן בשנת 2010.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם החומר חברה מספר קטלוגי
SH-SY5Y התא קו ATCC CRL-2266
Dulbecco של שינוי הנשרים בינוני F-12 HAM Sigma-Aldrich 51448C
בסרום שור עוברית Gibco BRL 16000-044
MCF7 התא קו ATCC HTB-22
RPMI-1640 בינוני Sigma-Aldrich R 0883
רגיל נראה התא האנושי העובר פיברובלסטים קו (NFF) Coriell המכון למחקר רפואי AG04431B
שינוי Dulbecco של הנשר של המדיום, המדיום גלוקוז גבוהות Thermo Scientific SH30022.01
טמוקסיפן מלח ציטרט Sigma-Aldrich T9262
35 מ"מ בתחתית הזכוכית תרבות מנות MatTek P35G-014-C
לייקה DMI6000 B הפוכה מיקרוסקופ Leica Microsystems N / A
Hoechst 33342 צבע בדיקות מולקולריות H3570
IRB Leica DM הפוך מיקרוסקופ פלואורסצנטי Leica Microsystems N / A
Annexin V AlexaFluor-488 Invitrogen A13201
Trypan פתרון כחול Sigma-Aldrich T8154-20ML
Haemocytometer פישר סיינטיפיק 267110
WST-1 מגיב רוש ומדע יישומי 11644807001
Wallac ויקטור 3 1420 Multilabel מונה PerkinElmer 1420-011
Tetramethylrhodamine מתיל אסתר (TMRM) Gibco BRL T-668
רקמת זכוכית מטחנת פישר סיינטיפיק K8885300-0002
BioRad assay חלבון Bio-Rad Laboratories 500-0001Bottom של טופס
Amplex האדום Invitrogen A12222
חזרת peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8125
SpectraMax תאומים XPS התקנים מולקולריים 3126666
נגד LC3 נוגדנים וגדל ארנב נובוס ביולוגיות NB100-2220
נגד העכבר HRP-מצומדות משני הנוגדנים Abcam ab6728
נגד ארנב HRP-מצומדות משני הנוגדנים Abcam ab6802
Peroxidase chemiluminescence המצע Sigma-Aldrich CPS160
Monodansylcadaverine Sigma-Aldrich 30432

מקורות

  1. Earnshaw, W. C. Apoptosis. A cellular poison cupboard. Nature. 397, 387-389 (1999).
  2. Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol. Cell. 40, 280-293 (2010).
  3. Dalby, K. N., Tekedereli, I., Lopez-Berestein, G., Ozpolat, B. Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer. Autophagy. 6, 322-329 (2010).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Fearon, E. R. Human Cancer Syndromes: Clues to the Origin and Nature of Cancer. Science. 278, 1043-1050 (1997).
  6. Tsokos, M., Scarpa, S., Ross, R. A., Triche, T. J. Differentiation of human neuroblastoma recapitulates neural crest development. Study of morphology, neurotransmitter enzymes, and extracellular matrix proteins. The American Journal of Pathology. 128, 484-496 (1987).
  7. Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., Berthold, F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 4, 472-480 (2003).
  8. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
  9. Howell, A. The endocrine prevention of breast cancer. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 615-623 (2008).
  10. Moreira, P., Custodio, J., Morena, A., Oliveira, C., Santos, M. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J. Biol. Chem. 281, 10143-10152 (2006).
  11. Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin causes early activation of caspase-3 and the flipping of phosphatidyl serine followed by rapid apoptosis specifically in human lymphoma cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 56, 29-38 (2005).
  12. McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin: a natural anti-cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce apoptosis. Apoptosis. 10, 619-630 (2005).
  13. Griffin, C., Hamm, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on noncancerous peripheral blood mononuclear cells. Cancer Cell Int. 10, 6(2010).
  14. Griffin, C., Karnik, A., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin selectively targets cancer cell mitochondria and reduces growth of human colon tumor xenografts. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 57-68 (2011).
  15. Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int. J. Oncol. 38, 1549-1556 (2011).
  16. Collins, J., Rinner, U., Moser, M., Hudlicky, T., Ghiviriga, I., Romero, A. E., Kornienko, A., Ma, D., Griffin, C., Pandey, S. Chemoenzymatic synthesis of Amaryllidaceae constituents and biological evaluation of their C-1 analogues. The next generation synthesis of 7-deoxypancratistatin and trans-dihydrolycoricidine. J. Org. Chem. 75, 3069-3084 (2010).
  17. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 23, 525-531 (1997).
  18. Madesh, M., Hajnóczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
  19. Simon, H. U., Haj-Yehia, A., Levi-Schaffer, F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis. 5, 415-418 (2000).
  20. Batandier, C., Leverve, X., Fontaine, E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. J Biol Chem. 279, 17197-17204 (2004).
  21. Lefranc, F., Sauvage, S., Goietsenoven, G. V. an, Mégalizzi, V., Lamoral-Theys, D., Debeir, O., Spiegl-Kreinecker, S., Berger, W., Mathieu, V., Decaestecker, C., Kiss, R. Narciclasine, a plant growth modulator, activates Rho and stress fibers in glioblastoma cells. Mol. Cancer Ther. 8, 1739-1750 (2009).
  22. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  23. Heerdt, B. G., Houston, M. A., Augenlicht, L. H. Growth properties of colonic tumor cells are a function of the intrinsic mitochondrial membrane potential. Cancer Res. 66, 1591-1596 (2006).
  24. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  25. Casellas, P., Galiegue, S., Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486 (2002).
  26. Mathupala, S. P., Rempel, A., Pedersen, P. L. Aberrant glycolytic metabolism of cancer cells: a remarkable coordination of genetic, transcriptional, post-translational, and mutational events that lead to a critical role for type II hexokinase. J. Bioenerg. Biomembr. 29, 339-343 (1997).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

השראה של אפופטוזהאנלוג של JCTH-4שילוב עם טמוקספןהתמקדמות מיטוכונדריאליתתאי סרטן השדמיקרוסקופיה של צילום רציף (Time-lapse)מיני קיסוגי חמצן (ROS)אנליזת Western Blot
שיפור האינדוקציה אפופטוטיים, Autophagic ידי אנלוגי רומן סינתטי C-1 של deoxypancratistatin-7 ב אדנוקרצינומה השד האדם תאים neuroblastoma עם טמוקסיפן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.