מאמר שיטה

יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין

DOI:

10.3791/3604

⸱

11 במרץ 2012

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים שיטה באמצעות MALDI ספקטרומטריית מסה וכימיה מתילציה רדוקטיבי לכמת שינויים מתילציה ליזין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחרונה, הרגולטורים אפיגנטים המשנים התגלו כשחקנים מרכזיים מחלות רבות ושונות 1-3. כתוצאה מכך, אנזימים אלה הם מטרות הממשלה ללימודי מולקולה קטנה ועל פיתוח 4 תרופות. הרגולטורים אפיגנטים המשנים רבים יש רק לאחרונה התגלה, והם עדיין בתהליך של להיות מסווג. בין אנזימים אלה הם demethylases ליזין אשר הסרת קבוצות מתיל מ lysines על ההיסטונים וחלבונים אחרים. בשל אופיו של הרומן המעמד הזה של אנזימים, מבחני כמה פותחו כדי ללמוד על פעילותם. זה היה מחסום הסיווג והן במחקר קצב העברת נתונים גבוה של demethylases היסטון. נכון לעכשיו, מבחני demethylase מעט מאוד קיים. אלה אכן קיימים נוטים להיות איכותית בטבע ולא ניתן להבחין בו זמנית בין מדינות שונות מתילציה ליזין (האו"ם, מונו, די ו-Tri-). ספקטרומטריית מסה משמש בדרך כלל כדי לקבוע פעילות demethylase אבל הנוכחי מבחני ספקטרומטריה לעשותלא לענות אם פפטידים מפוגל דיפרנציאלי ליינן אחרת. יינון ההפרש של פפטידים מפוגל עושה השוואה בין מדינות מתילציה קשה ובוודאי לא כמותית (איור 1 א). לכן מבחני כניסה אינן מותאמות ניתוח מקיף של פעילות demethylase.

כאן אנו מתארים שיטה הנקראת MassSQUIRM (quantitation ספקטרומטריה באמצעות מתילציה רדוקטיבי איזוטופי) המבוסס על מתילציה רדוקטיבי של קבוצות האמין עם פורמלדהיד deuterated לכפות lysines כל להיות DI-מפוגל, ולכן מה שהופך אותם למעשה המין כימי ולכן ליינן אותו (1B איור). ההבדל הכימי רק לאחר מתילציה רדוקטיבי הוא מימן דאוטריום, אשר אינו משפיע על יעילות MALDI יינון. Assay MassSQUIRM הוא ספציפי עבור תוצרי התגובה demethylase עם lysines האו"ם, מונו או di-מפוגל. Assay גם לגבי methyltransferases ליזין נותן SAלי תוצרי התגובה. כאן, אנו משתמשים בשילוב של כימיה מתילציה רדוקטיבי ו ספקטרומטריית MALDI המונית כדי למדוד את הפעילות של LSD1, demethylase ליזין מסוגלת להסיר DI-וחד-methyl קבוצות, על מצע פפטיד סינתטי 5. Assay זה פשוט נוח בקלות למעבדה כל גישה ספקטרומטר מסה MALDI במעבדה או באמצעות מתקן proteomics. Assay יש ~ 8 פי טווח דינמי והוא ניתן להרחבה בקלות לעצב צלחת 5.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה הוא שונה מן בלייר ואחרים. 6.

1. LSD1 demethylation Assay

  1. בכרך האחרון של μL 20, לשלב 125 LSD1 רקומביננטי ng עם 0.25 di-methyl מיקרוגרם היסטון H3 פפטיד (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-ביוטין) במאגר demethylase (50 מ"מ טריס-Cl-pH 8.5, 50 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl 2, 5% גליצרול). בנוסף, לבצע בקרת לבד הפפטיד עם האנזים לא. השליטה היא על סעיף 3 ואין צורך מתילציה רדוקטיבי.
  2. דגירה של 2 שעות ב 37 ° C.
  3. כדי לאסוף את הפפטידים, להוסיף 8 פורוס μL 20 R2 חרוזים מיקרון למדגם כל להתסיס במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להכין חרוזים פורוס על ידי השעיית 1 נפח של חרוזים עם נפח של 1 מתנול, ולאחר מכן להוסיף 10 כרכים של חומצה פורמית 5% / 0.2% TFA.
  4. מצב 2 ג 18

  1. "
  2. """""
  3. "
  5. &

"




  1. &
  2. &


figure-protocol-1

figure-protocol-2

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MassSQUIRM היא שיטה זולה כמותית לניתוח מקיף של פעילותו של demethylases ליזין המעורבים מונו ו מתילציה-di. MassSQUIRM מציע quantitation לא רק של המוצר התגובה אלא גם את התשומות. Assay זה יכול לשמש ככלי רב עוצמה בחקר מנגנון demethylases היסטון LSD1 אחרים. זה יהיה גם שימושי לסיווג אנזימים רבים שהתגלו לאחרונה demethylase ליזין כגון PHF8 ויכול לשמש methyltransferase אנזימים מסוימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו מה למסור.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים UAMS Proteomics מתקן לתמיכה ספקטרומטריה. המימון לפרויקט זה סופק על ידי NIH מענקים P20RR015569, P20RR016460 ו R01DA025755.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי
LSD1 BPS Biosciences 50100
H3K4me2-ביוטין פפטיד מוכן בתוך הבית אף אחד
פורוס R2 20 חרוזים מיקרון יישומי Biosystems 1-1129-06
C 18 ZipTip Millipore ZTC18M
Trifluoroacetic חומצה (TFA) Thermo 28904
אצטוניטריל דיג A996
2,5-dihydroxybenzoic חומצה סיגמא 85707
Borane dimethylamine סיגמא 180238
כבד isotopically ד 2-פורמלדהיד קיימברידג' איזוטופ מעבדות DLM-805-20
טריס דיג BP154
KCl דיג BP366
MgCl 2 דיג BP214
גליצרול דיג G33
חומצה פורמית Fluka 06440
מתנול דיג A452
Na-phosphate דיג BP329
SpeedVac מרוכז מלומד DNA110
MALDI-prOTOF ספקטרומטר מסה ו TOFworks תוכנה PerkinElmerSciex אף אחד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  3. Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
  4. Cole, P. A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).
  5. Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119, 941-953 (2004).
  6. Blair, L. P. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-499 (2011).
  7. Rayment, I. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science. 261, 50-508 (1993).
  8. Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling. Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).
  9. Gradolatto, A. Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression. Genetics. 179, 291-304 (2008).
  10. Taverna, S. D. Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs. Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MALDI

מאמרים קשורים