$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. בעלי חיים נושאים
1.1. טיפול
- הנהלים כל בעלי החיים יש לבצע באישור בעלי חיים טיפול של מכון המקומית ועדת האתיקה ועל פי שימוש ו ועדת המכונים הלאומיים הנחיות בריאות, עם הצעדים שננקטו כדי למזער את הכאב ואי הנוחות.
- העכברים שלנו שוכנו תחת בקרת טמפרטורה תנאי אור 12 שעות לאחור מחזור כהה, בעוד הפד לעכבר צ ו libitum מים המודעה.
- ללימודים של התחדשות מבוגר, עכברים צריך להיות לפחות 6 שבועות בגיל כאשר למחוץ גיד הנשה מתבצע. בגיל זה הוא מעבר למועד שבו גיזום של צמתים neuromuscular polyneural להתקיים.
- בניסויים אלה, היינו 6-8 בשבוע C57BL בן / 6 עכברים שנרכשו צ'ארלס ריבר. בהשוואת התחדשות לאחר למחוץ גיד הנשה (כלומר: קצב הצמיחה האקסון) זנים העכבר צריך להיות זהה, כמו הבדלים התחדשות axonal כבר לאאד בין זנים טהורים שונים 15,16. אם מניפולציות גנטיות בעכברים הם לשימוש, פקדי להמלטה המתאימים ביותר.
1.2. כירורגי הכנה
- חיות הן בהרדמה עמוקה לניתוח באמצעות קוקטייל של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) באמצעות הזרקת intraperitoneal. כל חיה מקבלת גם זריקה תת עורית של meloxicam (10 מ"ג / ק"ג) כדי למזער את הכאב שלאחר הניתוח.
- חלקו האחורי שניהם מגולח בקפידה באמצעות קוצץ כירורגית (Roboz, RC-5903) ו depilation הושלמה עם קרם שיער הסרת נאיר (נמצא בבית המרקחת המקומי).
- העור הוא נקי באמצעות applicators כותנה סטריליים שקצהו ושיחים בבטאדין כירורגית (פישר סיינטיפיק, 19066452).
- משחת עיניים (פישר סיינטיפיק, 19082795) על העיניים באמצעות applicators כותנה סטריליים שקצהו.
- העכבר מונח על צלחת נקייה פלדה אל חלד, במסגרתה הושם homeot מראש מחוממתשמיכה מערכת hermic (הרווארד Apparatus, 507222F). הטמפרטורה בעלי חיים נשמר ב 37 ° C.
- גפיים כל מוקלטות למטה, עם מטופל למצב הגפיים האחוריות באופן סימטרי, כך מפרק הברך גורם זווית ישרה עם הגוף (תרשים 1, לוח).
- בתחום כירורגית מכוסה וילון סטרילית. כל המכשירים מעוקרים ידי החיטוי או חם עיקור חרוז (כלי מדעי יפות, 18000-45) ו המנתח לובש מסכה, גלימה, וכפפות סטריליות.
2. לשחזור גיד הנשה Crush
- אחרי הכנה, חתך חצי עגול על פני קו האמצע (איור 1) הוא עשה בעור. העור הוא גזור בעדינות השרירים הבסיסית, ושילב מעל להישאר מהדרך במהלך ההליך. הוא כל הזמן לחות באמצעות יישומים של 0.1 מ"ל תמיסת מלח סטרילית (Hospira, 0409-4888-20) במהלך ההליך.
- פתיחת המטוס fascial בין שרירי האגן ואת הראש הקדמי של שריר הזרוע femoriזה חושף את גיד הנשה (איור 1, פאנל). עבור הניתוח, עצב הנשה הנגדי יש לחשוף וגייסה, אך נותר בשלמותו. השרירים gluteal הוא מחדש לעומת ואת איחוי באמצעות משי 6-0 קלוע, ללא תפרים נספגים (Roboz, SUT-1073-1011).
- עצב הנשה הניסוי נחשף אז באותו אופן, עם retractors במקום להקל להדמיה (תרשים 1, לוח ב '). Retractors הם מעוקרים לפני השימוש.
הערה: למרות מערכות מפשק זמינים באופן מסחרי, הם בדרך כלל די יקר. הצלחנו ליצור מערכת מפשק מספקת באמצעות ציוד חומרה יקר וסיכות חרקים (ראה סעיף חומרים). - עצב הנשה לאחר מכן, שחרר בעדינות רקמות החיבור המקיף באמצעות מספריים iridectomy.
- שימוש של 5/45 (כלים מדעיים יפות, 11251-35) מלקחיים עדינים, עצב מושם על הלסת התחתונה של סופר עדין מלקחיים עוצר דמום (מדע טוב מדיls, 13020-12). שלושת fascicles מיושרים ברצף, ולא על גבי זה (איור 1, B הבלעה). מלקחיים את עוצר דמום כבר חרוט עם סימן ב 1.5 מ"מ מקצה שלהם. בחלק החיצוני של הירך ממוקם בקו אחד עם סימן זה לפני למעוך. זה מבטיח מאוהבת של רוחב אחיד, כי העצב לא להרחיב מעבר מלתעותיו של מלקחיים עוצר דמום כאשר שיטחה בשל כוח מוחץ. אם העצב חורג עצה מלקחיים העצב רק להימחץ חלקית.
- למעוך עשוי בניצב העצב על 45 מ"מ מן האצבע השלישית, כפי שהיא נמדדת על חוט השערה, כי הוא אומדן של דרך עצב הנשה. עצב נרמס פעם ב 3 קליקים של מלקחיים עוצר דמום למשך 15 שניות. הטיפול נלקח לא למתוח את העצב. כאשר הם hemostats נפתח מחדש, עצב כולו צריך להיות שקוף באתר מאוהבת.
- זוג נוסף של מלקחיים עוצר דמום (זהה לראשון) כי כבר לפני טבולאבקת פחם (פישר סיינטיפיק, C272-500) משמש כדי לסמן את האתר דלוק. עצב נרמס במקום למחוץ אותו למשך 15 שניות ב 3 קליקים. לא פחמן סימון צריך להרחיב מעבר הגבול של ההתאהבות הראשונית. הדבר חשוב במיוחד אם סימון מדויק של האתר למחוץ נדרש. לפני השימוש, אבקת פחמן מעוקר על ידי חשיפה לאור UV למשך שעתיים, ולאחר מכן מתבצע באמצעות טכניקה סטרילית.
- מראש לטבול את מלקחיים בפחמן אבל ימנע פחמן נרחב באתר כירורגית, את מלקחיים נפתחים בפחמן אבקת וסגר בעדינות (אך לא לוחץ) עצומות, ואת הפחמן על החלק החיצוני של hemostats את הוא ניגב את בעזרת גזה סטרילית . מלקחיים נבדקים תחת הגדלה לפחות פי 3 כדי לוודא ריסוק משטחים מכוסים באופן שווה אבקת פחם. אם יש צורך, הם שוב טבל וניגב.
- השרירים gluteal מחדש התנגדו ו שנתפרה באופן זהה בצד הנגדי.
- לבסוף, החתך בעור נסגר באמצעות קליפים רפלקס 9 מ"מ (מכשירי העולם דיוק, 500346; Applier: 500345). אם 9 קליפים רפלקס מ"מ נמצאים פגיעה בחופש התנועה, קליפים רפלקס קטנים או 6-0 תפרים (Roboz, SUT-1073-1011) יכול לשמש במקום.
3. לאחר הניתוח טיפול
- בעקבות ההליך, חיות מונחות על כרית חימום על 37 מעלות צלזיוס עד שהם מראים סימנים של תנועה.
- הם עברו ואז בחזרה לכלוב ביתם, שם מים ומזון נגישים בקלות על הרצפה בצורה של Hydrogel ומזון wetted.
4. חצי דקה הכנה
- בעקבות מנת יתר של pentobarbital (300 מ"ג / ק"ג) שרירי הרגל מוסר לחשוף * גיד הנשה. עם העצב שנותר באתרו, חלק אחורי שקוע paraformaldehyde 2% ו 2% gluteraldehyde במאגר M 0.1 פוספט על קרח במשך 30 דקות.
* אם סיום הכנת כל שריר הר, השרירים הם הקציראד לפני חשיפת גיד הנשה. - העצב מוסר בזהירות, בזהירות נלקח לטפל רק קצה פרוקסימלי. ואז העצב הוא שלאחר קבוע מקבע אותו במשך שלוש שעות נוספות.
- לאחר קיבוע העצב הוא שטף שלוש פעמים במאגר M 0.1 פוספט.
- העצב הוא שקוע בתוך tetroxide אוסמיום 2% במאגר M 0.1 פוספט למשך שעה אחת.
- העצב הוא אז מיובש על ידי טבילה רציף באתנול מרוכז יותר ויותר (50%, 70%, 80%, 95%, 100%, 100%, 100%). הטבילה היא כל 15 דקות.
- העצב הוא מיובש מודגרות פעמיים שלוש דקות כל אחד ב פרופילן אוקסיד.
- ואז העצב הוא שקוע בתוך תערובת 01:01 של פרופילן אוקסיד ו שבץ 812 לפחות 6 שעות (לילה בדרך כלל).
- ואז העצב הוא שקוע בתוך תערובת 02:01 של פרופילן אוקסיד ו שבץ 812 לילה.
- לבסוף, העצב הוא שקוע בתוך הטבע טהור 812 במשך שש שעות, ולאחר מכן מוטבע בדפוס ראשון מתאיםked על 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
- סעיפים 1.0 מיקרומטר נחתכים מתוך גדם העצב הדיסטלי במרחק להגדיר מאתר למעוך באמצעות uct Ultracut ultramicrotome (לייקה) בסכין זכוכית צבעונית עם toluidine כחול. חלקים דקים עשויים גם להיות מיוצר לבחינת ultrastructure ידי מיקרוסקופית אלקטרונים.
5. הכנת כל הר שריר
- העכברים הראשונים מוקרבים עם מנת יתר של pentobarbital (300 מ"ג / ק"ג) ואת הגפיים האחוריות מוסרים ברכיים.
- ארבעה שרירי הגפיים האחוריות מוסרים לניתוח: tibialis הקדמי (ת"א), extensor digitorum longus (אדי), soleus ו longus peroneus.
- כל השרירים מוסרים באמצעות דיסקציה זהירה והצמיד באמצעות רקמת החיבור שלהם sylgard שחור (פישר סיינטיפיק, NC9492579) צלחת מצופה. הם ושטף PBS, ותיקנו אז paraformaldehyde 4% למשך 30 דקות.
- ת"א היא שטפה אז PBS, מוטבע אוקטובר (פישר סיינטיפיק, 14-373-65), ולהקפיא במהירות באמבט של קרח אצטון ויבש.
- הוא מאוחסן ב -80 ° C עבור חתך דק במקרה כל ההכנות בהר נכשל. באופן כללי, ת"א עבה מדי עבור mounts מלאים מספיקים.
- אדי, soleus ו longus peroneus הם שטפה במשך 3 x 10 דקות PBS, להציב 0.1 מ '* גליצין (פישר סיינטיפיק, AC12007-0010; מדולל PBS) במשך 30 דקות, ושטף 3 x 10 דקות ב PBS שוב. הם הרווה אז מתנול קרח 100% בדיוק 5 דקות ב -20 ° C, שטף 3 x 10 דקות ב PBS, ו רחץ מצומדות fluorescently אלפא bungarotoxin (דילול 1:200 ב PBS) במשך 30 דקות. השרירים שטפה במשך 3 x 10 דקות PBS, ואחריו גוש 1-BSA שעה ב 2% (KPL, 50-61-00) ו 0.2% טריטון X-100 (דוט מדעי Incorporated, 9002-93-1) ב PBS *, ו מודגרות לילה תוך מתנדנד על 4 מעלות צלזיוס קוקטייל של נוגדנים ראשוניים בדילול בבלוק 2% באותו טריטון BSA/0.2%.
* Glycine פתרונות לחסימת נעשים באותו יום כמו קצירת שרירים ובחש עבור 30-60 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש. - לרגל אקסונים וסינפסות neuromuscular, אנו משתמשים בשילוב של סמן העכבר neurofilament חד שבטיים (Covance, SMI-312R, בדילול מלא 1:1000), עכבר חד שבטי סמן שלפוחית סינפטית (SV2 DSHB, בדילול 1:1000), ו אלפא rhodamine מצומדות -bungarotoxin (Sigma-Aldrich, מדולל 1:200). לרגל תגובתי תאים שוואן אנו משתמשים הארנב נגד GAP-43 (נובוס ביולוגיות, NB300-143, בדילול 1/500). את הנוגדנים העיקריים הם דמיינו עם IgG1 תת סוג מסוים נוגדנים fluorescein מצומדות עז נגד העכבר DyLight משני 649 מצומדות חמור נגד ארנב (ImmunoResearch ג'קסון, מדולל 1:200).
- למחרת השרירים ושטף PBS למשך 3 x 10 דקות, מודגרות ב נוגדנים משניים מדולל 1:200 (בפתרון 2% טריטון BSA/0.2% חסימה). הם שטופים אז 2 x 10 דקות ב PBS, הופllowed על ידי טבילה של 5 דקות ב DAPI (Invitrogen, D3571, מדולל ל 300 ננומטר במים deionized), ועוד 10 דקות ולשטוף ב PBS.
- כל שריר הוא גזור ואילך sylgard שחור (פישר סיינטיפיק, NC9492579) מצופה צלחת פטרי. בתחילה הגידים מוסרים בנקודות הכניסה שלהם לתוך השריר, ולאחר מכן את השרירים דליל על ידי קילוף סיבי שריר הפנים (איור 3, לוחות AC). הטיפול נלקח לשמור על פני השטח החיצוני של שריר, כולל להקות endplate (איור 3, לוחות DF). השרירים וכתוצאה מכך הם רכובים על שקופיות ועוד (פישר סיינטיפיק, 12-550-15) עם vectashield (וקטור מעבדות, H-1000) ו - 22 x 40 מ"מ זכוכית coverslips (פישר סיינטיפיק, 12-548-5C) חתומים על ידי ברור לק על שני הצדדים. כאשר מותקן כראוי בשקופית את הלהקה הקשר endplate coverslip.
6. מדידת הדור הבא
- התחדשות ניתן להעריך בכל שלושת השרירים (peroneus, אדי, ו soleus). אנו לעיתים קרובות לשעבראמין התחדשות ארבעה עשר ימים לאחר למחוץ העצב, המועד בו אחוז ניכר של NMJs הם מעוצבבים מחדש. שתי נקודות קודמות וזמן מאוחר יותר מתאימים גם, בהתאם לשאלה המדעית מתבקש. בשריר זה, מחדש העצבוב של הלהקה endplate כל נבחן. רק צמודי קרקע NMJs פנים מקבלים נקודות. באופן זה, לפחות 200 NMJs לכל שריר יכול להיבחן במהירות.
- להבקיע השריר מחדש העצבוב אנו קובעים "מחדש העצבוב יחס". המכנה הוא מספר צמתים neuromuscular denervated כפי שכותרתו של GAP-43-α bungarotoxin תא מחייב שוואן immunoreactivity. המונה הוא מספר מחדש מעוצבבים NMJs שכותרתו כפי immunoreactivity neurofilament/SV2. במידת הצורך, NMJs יכול להיות מסווגת או באופן חלקי (כיסוי חלקי של bungarotoxin-α ידי SV2) או מלא (כיסוי מלא של bungarotoxin-α ידי SV2) מחדש מעוצבבים. לדוגמאות של NMJs מחדש מעוצבבים ו denervated ראה איור 3, לוחות G ו-H.
7. נציג תוצאות
באיור 1. סכמטי של אנטומיה גפה אחורית חשוב למעוך העצב. א חתך חצי עגול העור נעשה חושף השרירים הבסיסית. ב השרירים gluteal כבר נפרדו, גיד הנשה גילה (שלב 2.4 לעיל). החץ מציין את האתר למחוץ המשוער. מיקום מפשק מוצג כמדריך בכלל, מותאם במהלך ניתוח זה כדי להקל על ויזואליזציה של הירך ואת הגישה של מלקחיים עוצר דמום עבור מאוהבת ב '(השיבוץ). המיקום של הירך על הלסת התחתונה של מלקחיים עוצר דמום רק לפני למחוץ (שלב 2.5 לעיל). Fascicles נפרדים מסומנים על מנת להוכיח כי הם סמוכים אופקית, אך לא בצורה אנכית, במהלך הדוחק. למרות 3 fascicles מסומנים בתרשים זה, ניתן גם לראות fascicle 4, סניף במפרק של peroneal. עבור ציור אנטומי מפורט יותר של דפוסי הסתעפות של עצב הנשה fascicles דיסטלי עד כדי למעוך, עיין האנטומיה של גרין של עכברוש, איור 188 17.
איור 2. באתר פחמן מסומן למחוץ באתרו ו toluidine כחול מוכתם, חצי דקה קטעי גיד הנשה כתוש. א למשל של אתר דלוק באתרו (איבר האחורית משמאל). פחמן שחור מציין האתר למעוך. כוכבית מסמנת ענף של העצב הטיביאלי כי innervates שרירי הירך ומהווה ציון דרך שימושי במהלך הניתוח מאוהבת. חטיבת השוקה של עצב השת המתואר כחול, peroneal בירוק, ואת sural בצהוב. ב חצי דקה סעיפים הוכחת דלוקה המלא הופיע עם כוח עוצר דמוםPS. ג חצי דקה סעיפים הוכחת למחוץ שלם הופיע עם מלקחיים בזווית. בתמונות הן המתנוונת פרופילים המיאלין מסומנים ראשי חץ. בלוח החצים ג לסמן דוגמאות של פרופילים המיאלין משומרים ו מצרר של אקסונים בחיים. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר.
איור 3 הר שלם שרירים סכמטי ו NMJs נציג AC:.. תמונות המוצג של אדי (א '), longus peroneus (ב'), ו soleus (C) בניכוי שרירי הגפיים האחוריות מ. שרירי המוצגים הם מענף האחורית הימנית. הברך אנטומי אוריינטציה הקרסול כלולים גם לעיון. הגידים הם בצבע לבן התווה קו שחור מוצק כשהוא מוצב על גבי השרירים. הם מתוארים בקו מקווקו שחור כאשר הם להאריך מתחת לשריר. קיצוצים מוצגים קווים מקווקווים אדומים.השריר הוא התקלף מאתרים חתוכים, כפי שצוין על ידי חיצים כחולים, דליל לאחר מכן. לאחר דילול, שרירים מופרד הסיכות על ידי חיתוך סביב מה שנותר הגידים שתלו: DF. תמונות שניתנו מתאריך השרירים הר שלמים לאחר הסרה של רקמת חיבור ובעקבות דליל. להקות endplate מפורטים על כל שריר GH:. שרירים Soleus כל הר ארבעה עשר ימים לאחר למחוץ גיד הנשה הוכחת מחדש מעוצבבים (G) denervated (ח) צמתים התוקפת. על לוחות אלה, NMJs, אקסונים, תאים שוואן הם דמיינו כמתואר לעיל בסעיף 5.5.1. קולטני אצטילכולין אדומות, אקסונים ירוק, תא שוואן מעבד כחול. בלוח G, החצים מצביעים על תחומי NMJ כי כבר מחדש מעוצבבים על ידי האקסון. בלוח ראשי חץ ח עולה GAP-43 חיוביות סלולריים תהליכים שוואן. הערה העדר אקסונים. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר.