אפיון של T-cell epitopes של פתוגנים הגורמים לזיהומים מקומיים, כגון נגיף הפפילומה האנושי, מהווה אתגר בשל מספרם המוגבל של תאי T במחזור הדם. בשיטה המתוארת, תאי T נדירים בודדו ואופיינו החל ממספר קטן מאוד של תאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השימוש באינטרפרון-γ Assay האנזים המקושר Immunospot לאפיין רומן T-cell אפיטופים של וירוס הפפילומה האנושי
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרוטוקול פותח כדי להתגבר על הקשיים בבידוד ואפיון של תאי T נדירים הספציפיים לפתוגנים, כגון נגיף הפפילומה האנושי (HPV), הגורמים לזיהומים מקומיים. השלבים המעורבים הם זיהוי אזור(ים) בחלבוני HPV המכילים אפיטופ(ים) של תאי T מנבד, ברירה של תאי T ספציפיים לפפטיד על בסיס הפרשת interferon-γ (IFN-γ), וגידול ואפיון של שיבוטי תאי T (Fig. 1). נבד 1 היה מטופל שאובחן לאחרונה בביופסיה עם נגע תוך-אפיתלי של תאי קשקשת בדרגה גבוהה (high-grade squamous intraepithelial lesion) ועבר הליך כריתה חשמלית בלולאה לטיפול ביום שבו נאספו תאי ה-T1. אזור בתוך חלבוני E6 ו-E7 של נגיף הפפילומה האנושי מסוג 16 (HPV 16) שהכיל אפיטופ של תאי T זוהה באמצעות בדיקת IFN-g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) שבוצעה עם פפטידים סינתטיים חופפים (Fig. 2). הנתונים מבדיקה זו שימשו לא רק לזיהוי אזור המכיל אפיטופ של תאי T, אלא גם להערכת מספר תאי ה-T הספציפיים לאפיטופ ולבידודם על בסיס הפרשת IFN-γ באמצעות חרוזי מגנט זמינים מסחרית (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). תאי ה-T שנבחרו המפרישים IFN-γ דוללו וגודלו בנפרד בנוכחות תערובת של תאי מאכילה (feeder cells) שהוקרנו כדי לתמוך בצמיחה של תא T בודד לבאר. שיבוטי תאי T אלו נסרקו באמצעות בדיקת IFN-γ ELISPOT בנוכחות פפטידים המכסים את האזור שזוהה ותאי B-lymphoblastoid תרבויות (LCLs, שהושגו כפי שמתואר על ידי Walls ו-Crawford) שעברו טרנספורמציה על ידי נגיף אפשטיין-באר (autologous Epstein-Barr virus)2, זאת כדי למזער את מספר תאי שיבוט ה-T הדרושים. במקום להשתמש ב-1 x 105 תאים לבאר כפי שנעשה בדרך כלל בבדיקות ELISPOT1,3, נעשה שימוש ב-1,000 תאי שיבוט T בנוכחות של 1 x 105 תאי LCL אוטולוגיים, מה שהפחית באופן דרמטי את מספר תאי שיבוט ה-T הדרושים. תאי ה-LCL האוטולוגיים שימשו לא רק להצגת אנטיגנים פפטידיים לתאי שיבוט ה-T, אלא גם לשמירה על דחיפות תאים גבוהה בבארים, המאפשרת לתאי שיבוט ה-T הספציפיים לאפיטופ להפריש IFN-γ. דבר זה מבטיח ביצוע מוצלח של בדיקת IFN-γ ELISPOT. באופן דומה, בדיקות IFN-γ ELISPOT שימשו לאפיון הרצף המינימלי והאופטימלי של חומצות האמינו באפיטופ של תאי CD8 T (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) ואלמנט הגבלת ה-HLA class I שלו (B58). בדיקת IFN-γ ELISPOT בוצעה גם באמצעות LCLs אוטולוגיים שהודבקו בנגיף vaccinia המבטא חלבון HPV 16 E6 או E7. התוצאה הדגימה כי אפיטופ תאי ה-T של E6 עבר עיבוד אנדוגני. הוכרה זיהוי צולב (cross-recognition) של אפיטופ תאי T הומולוגי של סוגי HPV אחרים בסיכון גבוה. ניתן להשתמש בשיטה זו גם לתיאור אפיטופים של תאי CD4 T4.
פרוטוקול
על ידי ביצוע בדיקת IFN-γ ELISPOT עם קו תאי CD8 T שהוקם מנבדק 1, נקבע כי אזור 46-70 של HPV 16 E6 מכיל epitope לתאי T1 (איור 2), ותאי ה-T הספציפיים ל-epitope נבחרו על בסיס הפרשת IFN-γ לפני תחילת פרוטוקול זה (איור 1).
1. דילול מגביל של תאי T ספציפיים לאפיטופ
- הכינו את תערובת תאי המזינים (feeder cells) על ידי שילוב של תאי דם פריפריים מונונוקליאריים (PBMCs) אלוגניים שהקרינו (4,000 rad) בריכוז של 5 x 105 תאים/ml, תאי LCLs אלוגניים שהקרינו (5,000 rad) בריכוז של 5 x 104 תאים/ml, ופיטוהמוגלוטינין (PHA) בריכוז של 0.1 μg/ml, תוך שימוש במצע Yssel's מלא המכיל 1% סרום אנושי מאוחד. יש לטפל בתאים בתנאים סטריליים לאורך כל הפרוטוקול.
- בצעו דילול סדרתי של תאי T ספציפיים לאפיטופ שבודדו (איור 3>) באמצעות תערובת תאי המזינים עד להגעה לריכוז של 0.5 תא/100 μl או 5 תאים/1 ml. השתמשו בכ-3 x 103 תאי T ספציפיים לאפיטופ.
- העבירו 100 μl/באר של תאי T מדוללים הספציפיים לאפיטופ לתוך סה"כ 30 עד 60 פלטות 96-באר בעלות תחתית עגולה, באמצעות פיפט רב-ערוצי.
- דגרו את הפלטות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2.
- ביום ה-5, הוסיפו 100 μl של מצע Yssel's מלא המכיל 20 u/ml של אינטרלוקין-2 אנושי רקומביננטי (rhIL-2).
- זהו ויזואלית שיבוטי תאי T הצומחים בפלטות 96-באר בעלות התחתית העגולה לפי גודל המשקע הגדול בתחתית.
- בימים 11 עד 14, הכינו תערובת תאי מזינים חדשה על ידי שילוב של PBMCs אלוגניים שהקרינו (4,000 rad) בריכוז של 1 x 106 תאים/ml, LCLs אלוגניים שהקרינו (5,000 rad) בריכוז של 1 x 105 תאים/ml, ו-PHA בריכוז של 0.1 μg/ml, תוך שימוש במצע Yssel's מלא. העבירו תערובת תאי מזינים חדשה זו לפלטה של 24 בארים בריכוז של 1 ml/באר.
- שאבו את שיבוטי תאי ה-T באופן פרטני מכל באר באמצעות מיקרופיפט בעל נפח של כ-200 μl.
- העבירו את שיבוטי תאי ה-T באופן פרטני אל פלטת 24 הבארים המכילה את תערובת תאי המזינים החדשה. חזרו על הפעולה עד להעברת כל שיבוטי תאי ה-T.
2. זיהוי שיבוטים של תאי T ספציפיים לאפיטופ באמצעות בדיקת ELISPOT לסריקה בסביבה של תפוקה גבוהה (מותאם משיטה שתוארה על ידי Larsson et al.5)
- צפו 2 פלטות ELISPOT סטריליות (Multiscreen-HA; Millipore, Bedford, MA) עם 50 μl/well של נוגדן מונוקלונלי ראשוני anti-IFN-γ (clone D1K, Mabtech, Stockholm, Sweden) המדולל ל-5 μg/ml בתוך PBS (phosphate-buffered saline) סטרילי בדרגת תרבית רקמה למשך שעה אחת לפחות ב-4 °C.
- שטפו את הבארות עם 150 עד 200 μl/well של PBS על ידי מזיגה והשלכה. חזרו על הפעולה שלוש פעמים נוספות.
- חסמו קישור לא ספציפי על ידי מזיגת 50 μl/well של סרום אנושי מאוחד המדולל ל-5% באמצעות RPMI 1640 למשך שעה אחת לפחות ב-37 °C, 5% CO2. פוצצו בועות גדולות באמצעות מחט סטרילית.
- פזרו 1 x 105 תאי LCLs2 אוטולוגיים ב-50 μl של RPMI 1640 עם 5% סרום אנושי לכל בארה.
- ערבבו תאים בכל בארה בפלטת 24 הבארות המכילה שיבוטי T-cell באמצעות פיפטה של 1 ml. העבירו 100 μl לכל בארה לשפופרת Eppendorf סטרילית. הוסיפו 500 μl של RPMI 1640 עם 5% סרום אנושי מאוחד לכל שפופרת Eppendorf, וסובבו במיקרופוגה ב-3,000 RPM למשך 5 דקות.
- רוקנו את שפופרות ה-Eppendorf, הוסיפו 110 μl של RPMI 1640 עם 5% סרום אנושי לשפופרת, וסספנדו מחדש את התאים באמצעות וורטקס.
- פזרו 50 μl של מדיה המכילה שיבוטי T-cell ספציפיים, ללא קשר למספר התאים לצורך סריקה מהירה, בבארות במקומות זהים בשתי הפלטות. חזרו על הפעולה עבור כל שיבוטי ה-T-cell. על ידי ביטול שלבי ספירת התאים, ניתן לבדוק מספר רב של שיבוטי T-cell בבת אחת.
- שמרו את שארית המדיה ממספר שפופרות Eppendorf, ופזרו 50 μl לכל אחת מהבארות הבאות במקומות זהים שישמשו כבארות ביקורת חיובית אליהן יתווסף PHA.
- הוסיפו 50 μl של RPMI 1640 עם 5% סרום אנושי מאוחד לכל בארה שתשמש כבארת ביקורת שלילית, שאינה מכילה שיבוטי T-cell.
- הוסיפו פפטידים המצויים באזור החיובי (Table 1) בנפח של 50 μl/well עד לריכוז סופי של 10 μM/peptide. מלאי הפפטידים מומסים בריכוז של 5mM כל אחד ב-5% - 15% dimethyl suphoxide בתוך PBS, בהתאם למסיסות הפפטיד. כל בארה תכיל נפח של 200 μl (50 μl של חסימה, 50μl של LCLs, 50μl של שיבוטי T-cell, ו-50μl של פפטידים).
- הוסיפו 50 μl של PHA (ריכוז סופי 10 μg/ml) לבארות הביקורת החיובית.
- הוסיפו 50 μl של RPMI 1640 עם 5% סרום אנושי מאוחד לבארות הביקורת השלילית.
- דגרו למשך לילה ב-37 °C, 5% CO2.
- שטפו את הבארות עם 150 עד 200 μl/well של PBS עם 0.05% Tween-20 על ידי מזיגה והשלכה. חזרו על הפעולה שלוש פעמים נוספות.
- הוסיפו 50 μl של PBS המכיל 1 μg/ml של נוגדן מונוקלונלי anti-IFN-γ מצומד בביוטין (clone 7B-6, Mabtech), ודגרו ב-37 °C, 5% CO2 למשך שעתיים. פוצצו בועות גדולות באמצעות מחט.
- עשרים דקות לפני סיום הדגירה של שעתיים, הכינו את ה-horseradish peroxidase H הביוטינילי הקשור לאווידין (ערכת Vectastain Elite ABC; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) על ידי הוספת 2 טיפות מכל אחד מתמיסות A ו-B ל-5 ml של PBS המכיל 0.1% Tween-20.
- שטפו את הבארות עם 150 עד 200 μl/well של PBS עם 0.1% Tween-20 על ידי מזיגה והשלכה. חזרו על הפעולה שלוש פעמים נוספות.
- פזרו 50 μl/well של horseradish peroxidase H ביוטינילי, ודגרו ב-37 °C, 5% CO2 למשך שעה אחת. פוצצו בועות גדולות באמצעות מחט.
- שטפו את הבארות עם 150 עד 200 μl/well של PBS עם 0.1% Tween-20 על ידי מזיגה והשלכה. חזרו על הפעולה שלוש פעמים נוספות.
- פזרו 50 μl/well של ריאגנט צביעה הנקרא stable diaminobenzidine (DAB) בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. פוצצו בועות גדולות באמצעות מחט.
- שטפו את הבארות עם 150 עד 200 μl/well של מים דה-יוניים על ידי מזיגה והשלכה. חזרו על הפעולה פעמיים נוספות.
- הניחו לפלטה להתייבש לחלוטין.
- ספרו את הנקודות באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה או קורא ELISPOT אוטומטי (AID ELISPOT Classic Reader; Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Germany).
3. אישור התכונות הספציפיות לאפיטופ של שיבוטי תאי ה-T באמצעות בדיקת ELISPOT (איור 4)
- בחר שיבוטי T-cell הגדלים היטב. בצע בדיקת ELISPOT כפי שמתואר לעיל, למעט העובדה שכל באר תכיל 1 x 105 LCLs אוטולוגים ו-1 x 103 תאי שיבט T-cell, יחד עם כל אחד משלושת הפפטידים המצויים באזור (טבלה 1) בריכוז של 10 μM. הגדר את הבדיקה בשכפולים כפולים או משולשים.
4. קביעה האם האפיטופ מעובד באופן אנדוגני (איור 5)
- בחרו שיבוטים של תאי T הגדלים היטב. בצעו בדיקת ELISPOT כפי שתיארנו לעיל, למעט העובדה שכל באר תכיל 1 x 105 תאי LCL אוטולוגיים שהודבקו בנגיף vaccinia רקומביננטי המבטא את HPV 16 E6, E7 6 (לפני הבדיקה) או ללא ביטוי כזה (סוג בר, זן WR) (ריבוי הדבקה של 5 למשך 1 hr) ו-1 x 103 תאים משיבטון של תאי T.
5. אפיון הרצף המינימלי והאופטימלי של האפיטופ של תאי T (איורים 6a, 6b ו-6c)
- בחרו שיבוטים (clones) של תאי T בעלי צמיחה טובה. בצעו בדיקת ELISPOT כפי שמתואר לעיל, למעט העובדה שכל באר תכיל 1 x 105 תאי LCL אותולוגיים ו-1 x 103 תאים משיבטון תאי T, יחד עם אחד מהסדרות של פפטידים בני 9 חומצות אמינו החופפים זה לזה המכסים את האזור (Table 1) בריכוז של 10 μM (Fig. 6a).
- בצעו בדיקת ELISPOT כפי שמתואר לעיל, למעט העובדה שכל באר תכיל 1 x 105 תאי LCL אותולוגיים ו-1 x 103 תאים משיבטון תאי T, יחד עם אחת מסדרות הפפטידים באורכים משתנים (Table 1) בריכוז של 10 μM (Fig. 6b).
- בצעו בדיקת ELISPOT כפי שמתואר לעיל, למעט העובדה שכל באר תכיל 1 x 105 תאי LCL אותולוגיים ו-1 x 103 תאים משיבטון תאי T, יחד עם מספר פפטידים בעלי הסבירות הגבוהה ביותר להכיל את רצף חומצות האמינו המינימלי והאופטימלי. פפטידים אלו ייבדקו בטווח ריכוזים שבין 10-5 M ל-10-10 M (Fig. 6c).
6. זיהוי אלמנט ההגבלה באמצעות בדיקת ELISPOT (איור 7)
- בחרו שיבוטים של תאי T הצומחים היטב. בצעו בדיקת ELISPOT כפי שתיאור לעיל, למעט בכך שעל כל באר יופרשו 1 x 103 תאים משיבוב תאי T, יחד עם הפפטיד המינימלי והאופטימלי בריכוז של 10 μM. כמו כן, יופרשו לבאר מאה אלף תאי LCL אלוגנאיים החולקים מולקולה אחת או שתיים של HLA class I עם הנבדק הנחקר.
7. בדיקת התגובה הצולבת של שיבוטי תאי T ספציפיים לאפיטופ לרצפי חומצות אמנו מקבילים מסוגי HPV אחרים בסיכון גבוה (איור 8)
- בחרו שיבוטים (clones) של תאי T הצומחים היטב. בצעו בדיקת ELISPOT כפי שמתואר לעיל, למעט העובדה שסך של 1 x 103 תאים משיבוב תאי T לכל באר יוצבו יחד עם פפטידים (10 μM) המכילים רצפי חומצות אמינו הומולוגיות own מזנים אחרים של HPV בסיכון גבוה (טבלה 2). מאה אלף תאי LCL אוטולוגיים לכל באר ותאי LCL אלוגנויים המבטאים את מולקולות ה-HLA class I המגבילות יוצבו אף הם בבארים המתאימות.
8. תוצאות מייצגות
הנבדקת המוצגת כאן הייתה אישה אפרו-אמריקאית בת 22 עם היסטוריה רפואית אחרונה של squamous intraepithelial lesion בדרגה גבוהה שאובחן באמצעות ביופסיה. היא הגיעה לטיפול בשיטת loop electrical excision ביום שבו נאספו תאי ה-T1. בדיקת ELISPOT של קו תאי CD8 T שלה הראתה כי אזור HPV 16 E6 46-70 (כל אזור נבדק באמצעות 3 פפטידים חופפים של 15-mer) הכיל epitope של תאי T (איור 2). מספר תאי ה-T הספציפיים ל-epitope שנבחרו על בסיס הפרשת IFN-γ היה 1.2 x 105. לאחר ביצוע limiting dilution (איור 3) על חמישית מהתאים שנבחרו, נאספו 262 שיבוטים (clones) של תאי T. התאים שנבחרו שנותרו לא נעשה בהם שימוש מכיוון שהניסיון הראשון לשבוט תאי T הצליח. בדיקת ELISPOT לסריקה בהספק גבוה שבוצעו על 94 מהשיבוטים הללו זיהתה 62 שיבוטים חיוביים לסריקה, שניתן לזהותם בקלות בלוח ה-ELISPOT באופן מאקרוסקופי. שאר שיבוטי תאי ה-T לא נבדקו מכיוון שבדיקת ה-ELISPOT הראשונה זיהתה שיבוטי תאי T ספציפיים לפפטיד. שמונה שיבוטים חיוביים לסריקה שגדלו היטב נבדקו שוב עם שלושת הפפטידים מסוג 15-mer המכסים את האזור באופן פרטני (איור 4). כל שיבוטי תאי ה-T היו חיוביים לפפטידים HPV 16 E6 51-65, 6 מתוך 8 שיבוטים היו חיוביים לפפטיד E6 46-60, ואף אחד מהשיבוטים לא היה חיובי לפפטיד E6 56-70. בדיקה עם LCLs אותולוגיים שהודאו בנגיף vaccinia רקומביננטי המבטא חלבון HPV 16 E6 או חלבון E7 הראתה כי שיבוטי תאי ה-T מזהים epitope של E6 שעבר עיבוד אנדוגני (איור 5). בדיקה עם סדרה של פפטידים חופפים מסוג 9-mer המכסים את אזור HPV 16 46-65 (טבלה 1) הראתה את התגובה הטובה ביותר לפפטיד E6 53-61 (איור 6a). נבדקו שני פפטידים מסוג 10-mer המכילים את הפפטיד E6 53-61, שני פפטידים מסוג 8-mer הכלולים בפפטיד E6 53-61, ופפטיד אחד מסוג 11-mer המכיל את שני הפפטידים מסוג 10-mer, והפפטיד E6 52-61 (10-mer) היה הרצף המינימלי והאופטימלי באופן העקבי ביותר (איור 6b). עם זאת, לפפטיד E6 53-61 (9-mer) הייתה תגובה חזקה באותה מידה עם שיבט תאי T מס' 79. שיבט T זה נבדק עם שני פפטידים אלו בטווח ריכוזים רחב יותר, והפפטיד E6 52-61 (10-mer) שמר על חיוביות ביעילות רבה יותר מהפפטיד E6 53-61 (9-mer) בריכוזי פפטיד נמוכים יותר (איור 6c). הפפטיד הארוך יותר E6 52-62 (11-mer) לא נבדק מכיוון שהמטרה הייתה להגדיר את הרצף הקצר ביותר המראה תגובה חסונה. נקבע כי הפפטיד E6 52-61 (10-mer) מכיל את הרצף המינימלי והאופטימלי.
ניתן לבחון את מולקולת ה-HLA class I המגבילה של האפיטופ של תאי CD8 T באמצעות בדיקת ELISPOT המשתמשת ב-LCLs אלוגניות המבטאות מולקולת HLA class I אחת או שתיים הנפוצות אצל הנבדק. עם זאת, התוצאות עבור נבדק 1 היו לא חד-משמעיות עקב רקע גבוה שנראה בבדיקת ה-ELISPOT. מולקולת ה-HLA class I המגבילה עבור נבדק 1 זוהתה לאחר מכן כ-B58 באמצעות בדיקת שחרור כרום (נתונים לא מוצגים). איור 7 מציג דוגמה מנבדק אחר [נבדק A אשר נמצא כי הוא מזהה את הרצף המינימלי והאופטימלי של E6 75-83 (KFYSKISEY) כפי שתיארו Wang et al.]7. חיוביות גבוהה נראית עם LCL המבטאת את המולקולות B62 ו-Cw3, בעוד שחיוביות רקע נראית עם LCL המבטאת Cw3. בדיקת שחרור כרום אישרה כי מולקולת B62 הייתה האלמנט המגביל עבור נבדק A7.
חלק מאזורי הגנום של HPV שמורים היטב, ורצפים הומולוגיים לאזורים 52-61 של HPV 16 E6 נמצאו ב-13 סוגי HPV נוספים בסיכון גבוה (טבלה 2). זיהוי צולב חזק (>50% מיחידות יוצרות כתמים עבור פפטיד HPV 16 E6 52-61) הודגם עבור 8 מתוך 13 סוגי HPV בסיכון גבוה (איור 8).
איור 1. תרשים כללי המתאר את סדרת הניסויים לאפיון אפיתופים חדשים של תאי T. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול החל מהתיבה השלישית מלמעלה.
איור 2. בדיקת ELISPOT שבוצעה לזיהוי אזור(ים) המכילים את האפיטופ של תאי T. מאה אלף תאי CD8 T שעברו סטימולציה in vitro לכל באר הוכנסו יחד עם שלושה פפטידים חופפים בני 15 חומצות אמינו (10 μM כל אחד) המכסים כל אזור בתוך חלבוני HPV 16 E6 ו-E7. דוגמה זו מנבדק 1 הראתה נוכחות של אפיטופ של תאי T באזור E6 46-70. העמודות מייצגות טעויות תקן של הממוצעים.
איור 3. סכימה המראה כיצד לדלל תאי T ספציפיים לאפיטופ באמצעות תערובת תאי מאכיל (feeder cells) לריכוז של 0.5 תאים לבאר.
איור 4. בדיקת ELISPOT שבוצעה לזיהוי תת-אזורים המכילים את האפיטופ של תאי T על ידי בדיקה של שלושת הפפטידים בעלי 15 חומצות אמינו באופן פרטני. דוגמה זו מנבד 1 הראתה נוכחות של האפיטופ בתת-האזורים E6 46-60 ו-E6 51-65. העמודות מייצגות את טעויות התקן של הממוצעים.
איור 5. בדיקת ELISPOT שבוצעה כדי לבחון האם האפיטופ של תאי T מוצג באופן אנדוגני. דוגמה זו מנבדק 1 גילתה כי שיבטוני תאי T זיהו אפיטופ של E6 שעבר עיבוד אנדוגני. העמודות מייצגות טעויות תקניות של הממוצעים.
איור 6. בדיקות ELISPOT שבוצעו לאפיון רצף הפפטיד הקצר והאופטימלי של האפיטופ של תאי T. אותם שיבוטים שימשו לאורך כל התהליך, במידה והיו זמינים. (א) בדיקת ELISPOT שבוצעה באמצעות פפטידים של 9-mer עם חפיפה. דוגמה זו מנבד 1 חשפה כי האפיטופ נמצא בתת-האזור E6 53-61. (ב) בדיקת ELISPOT שבוצעה לזיהוי רצף הפפטיד המינימלי והאופטימלי באמצעות פפטידים באורכים שונים. דוגמה זו חשפה כי רצף הפפטיד הקצר והאופטימלי ביותר באופן עקבי היה הפפטיד E6 52-61, ואחריו הפפטיד E6 53-61. (ג) בדיקת ELISPOT שבוצעה כדי לאשר איזה פפטיד מכיל את הרצף המינימלי והאופטימלי. הפפטיד E6 52-61 שמר על חיוביות בריכוזים נמוכים יותר, ונקבע כרצף הקצר והאופטימלי. הפסים מייצגים שגיאות סטנדרטיות של הממוצע.
איור 7. בדיקת ELISPOT שבוצעה כדי לזהות את מולקולת ה-HLA class I המגבילה. דוגמה זו תמכה בסברה שמולקולת ה-B62 היא אלמנט ההגבלה עבור שיבוט תאי CD8 T של נבדק A המזהים את האפיטופ HPV 16 E6 75-837. דבר זה אושש באמצעות בדיקת שחרור כרום. הסרגים מייצגים שגיאות תקן של הממוצעים.
איור 8. בדיקת ELISPOT שבוצעה להערכת התגובתיות הצולבת של שיבוטי T-cell ספציפיים ל-HPV 16 52-61 לרצפים דומים מסוגי HPV אחרים בסיכון גבוה (טבלה 2). דוגמה זו מנבד 1 הדגימה תגובתיות צולבת משמעותית (>50% חיוביות בהשוואה ל-HPV 16 52-61) ב-8 מתוך 13 סוגי ה-HPV האחרים בסיכון גבוה שנבחנו. העמודות מייצגות שגיאות תקן של הממוצעים.
| סוג HPV | שאריות חומצות אמינו* | רצף |
| 16 | E6 46-60 (15) | RREVYDFAFRDLCIV |
| 16 | E6 51-65 (15) | DFAFRDLCIVYRDGN |
| 16 | E6 56-70 (15) | DLCIVYRDGNPYAVC |
| 16 | E6 52-62 (11) | FAFRDLCIVYR |
| 16 | E6 52-61 (10) | FAFRDLCIVY |
| 16 | E6 53-62 (10) | AFRDLCIVYR |
| 16 | E6 46-54 (9) | RREVYDFAF |
| 16 | E6 47-55 (9) | REVYDFAFR |
| 16 | E6 48-56 (9) | EVYDFAFRD |
| 16 | E6 49-57 (9) | VYDFAFRDL |
| 16 | E6 50-58 (9) | YDFAFRDLC |
| 16 | E6 51-59 (9) | DFAFRDLCI |
| 16 | E6 52-60 (9) | FAFRDLCIV |
| 16 | E6 53-61 (9) | AFRDLCIVY |
| 16 | E6 54-62 (9) | FRDLCIVYR |
| 16 | E6 55-63 (9) | RDLCIVYRD |
| 16 | E6 56-64 (9) | DLCIVYRDG |
| 16 | E6 57-65 (9) | LCIVYRDGN |
| 16 | E6 53-60 (8) | AFRDLCIV |
| 16 | E6 54-61 (8) | נראה כי פנייתך מכילה רצף תווים שאינו טקסט ברור לתרגום (FRDLCIVY). אנא ספק את הטקסט המדעי או הפרוטוקול שברצונך לתרגם מאנגלית לעברית. |
* מספר חומצות האמינו מופיע בסוגריים.
טבלה 1. רצפי חומצות האמינו של פפטידי HPV 16 E6 ששימשו להגדרת הרצף הפפטידי האנטיגני המינימלי והאופטימלי.
| סוג HPV | שאריות A A* | רצף |
| 16 | E6 52-61(10) | FAFRDLCIVY |
| 18 | E6 47-56 (10) | FAFKDLFVVY |
| 31 | E6 45-54 (10) | פלואורסצנציה עצמית (FAF)TDLTקיסוס |
| 33 | E6 45-54 (10) | FAFאDLטלוויזיהVY |
| 35 | E6 45-54 (10) | אנליזה של חומצות שומן (Fatty Acid Analysis)סרטוסיטול (Cytosine)DLCIVY |
| 39 | E6 47-56 (10) | autofluorescenceSDLYVVY |
| 45 | E6 47-56 (10) | FAFסDLYVVY |
| 51 | E6 45-54 (10) | VAFTEIKקיסוס |
| 52 | E6 45-54 (10) | FLFTDLRקיסוס |
| 56 | E6 48-57 (10) | קיבוע פורמלין (Formalin Fixation)CTELKLVY |
| 58 | E6 45-54 (10) | FVנקבהאDLRקיסוס |
| 59 | E6 47-56 (10) | FAFNלמידה עמוקהFקיסוס |
| 68 | E6 47-56 (10) | FAFג'למידה עמוקהNVVY |
| 73 | E6 45-54 (10) | FAFSDLCIVY |
* מספר החומצות האמינו מופיע בסוגריים.
^ שאריות חומצות אמינו השונות מאלו שב-HPV-16 E6 52-61 epitope מופיעות בכתב מודגש.
טבלה 2. רצפי חומצות אמינו של פפטידים, מסוגי HPV בסיכון גבוה ההומולוגיים לאפיטופים של תאי T מסוג CD8 של HPV 16 E6 52-61, אשר נבדקו כדי להעריך זיהוי צולב.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
באופן מסורתי, אימונולוגים ניסו לאפיין אפיתופים חדשים של תאי T על ידי גירוי תאי ה-T הרלוונטיים in vitro, וביצוע ניסוי של דילול מגביל (limiting dilution) כדי לבודד את השיבטורים של תאי ה-T הספציפיים לאפיתופ. לאחר מכן, שיבטורי תאי ה-T אופיינו באמצעות בדיקת שחרור כרום 8,9. עם זאת, ניסיונות רבים לא הצליחו מכיוון ששכיחות תאי ה-T הייתה נמוכה מדי כדי שניתן יהיה לבודדם, או מכיוון שלא היו זמינים מספיק תאים משיבטורי תאי ה-T כדי להשלים את האפיון. השיטה המתוארת כאן מתגברת על מגבלות אלו על ידי (1) הערכה האם קיים מספ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מלגת Scholars Award של איגוד הסרטן האמריקאי (RSG-06-180-01-MBC) ומענקי NIH (R01 CA143130 ו-UL1RR029884).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכה לבידוד תאי CD8 T | Miltenyi Biotec | 130-094-156 | |
| Phytohemagglutinin | Remel, Thermo Fisher Scientific | R-30852801 | 2mg/vial |
| מדיום Yssel’s | Gemini Bio Products | 400-102 | 1% pooled human serum |
| פלטה בעלת 96 בארות עם תחתית עגולה | BD Biosciences | 08-772-17 | |
| IL-2 אנושי רקומביננטי | R&D Systems | 202-IL-050 | 50μg |
| פלטה בעלת 24 בארות | Corning | 07-200-84 | |
| סליין בבפר פוספט (PBS) | Cellgro | MT-21-031-CV | |
| נוגדן מונוקלונלי ראשוני נגד IFN-γ (D1K) | Mabtech | 3420-3-1000 | |
| נוגדן מונוקלונלי נגד IFN-γ מצומד לביוטין (7B-6) | Mabtech | 3420-6-1000 | |
| פלטת Multiscreen HA ELISPOT | EMD Millipore | MAHA S45 10 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | בקבוק 100 ml |
| סרום אנושי מאוחד (Pooled Serum) | Atlanta Biologicals | S40510H | Heat inactivate |
| RPMI 1640 | Cellgro | MT-10-040-CV | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100ml | |
| ערכת Vectastain Elite ABC | Vector Laboratories | NC9313719 | |
| diaminobenzidine יציב | Open Biosystems | MBI 1241 | |
| קורא AID EliSpot Reader Classic | Autoimmun Diagnostika GmbH | ELR06 |
מקורות
- Nakagawa, M. A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results. J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).
- Walls, E., Crawford, L. Lymphocytes: A practical approach. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable. Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).
- Wang, X., Santin, A. D., Bellone, S., Gupta, S., Nakagawa, M. A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells. Cancer Immunol. Immunother. 58, 301-308 (2009).
- Larsson, M. A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals. AIDS. 13, 767-777 (1999).
- Nakagawa, M. Cytotoxic T lymphocyte responses to E6 and E7 proteins of human papillomavirus type 16: relationship to cervical intraepithelial neoplasia. J. Infect. Dis. 175, 927-931 (1997).
- Wang, X., Moscicki, A. B., Tsang, L., Brockman, A., Nakagawa, M. Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable. Clin. Vaccine Immunol. 15, 937-945 (2008).
- Evans, M. Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6. J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).
- Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro. J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).
- Varadarajan, N. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. The Journal of Clinical Investigation. , (2011).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins. Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein. J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).
- Brown, S. A. T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).
- Masemola, A. M. Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa. J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).
- Walker, B. D., Korber, B. T. Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity. Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
