תחזיות סטריאוטיפית של afferents חושי אל חוט השדרה מכרסם להציע מערכת ניסיונית נגיש ללמוד axonal מסתעפת דרך התחקות של אקסונים יחיד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
DiI-תיוג של נוירונים DRG לחקר axonal מסעף בהכנת הר שלם של חוט השדרה עובריים בעכבר
במאמר זה
סיכום
תקציר
כאן אנו מציגים טכניקה התווית מסלולים של קבוצות קטנות של נוירונים DRG לתוך חוט השדרה העובר על ידי מכתים diffusive באמצעות נותב lipophilic 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3 ", 3'-tetramethylindocarbocyanine (DiI) פרכלורט 1 . ההשוואה בין המסלולים axonal של wild-type עם אלה של קווי העכבר אילו גנים שעברו מוטציה המאפשרת בדיקת תפקיד פונקציונלי של חלבונים מועמד בשליטה על הסתעפות axonal המהווה מנגנון חיוני החיווט של מערכת העצבים. הסתעפות axonal מאפשר נוירון יחיד להתחבר עם מטרות מרובות, ובכך לספק את הבסיס הפיזי של עיבוד מקבילי של מידע. השלכות על אזורים יעד ביניים של צמיחה axonal ניתן להבחין בין arborization סופנית. יתר על כן, מצבים שונים של היווצרות ענף axonal ניתן לסווג תלוי אם תוצאות מסתעפת מן הפעילויות של חרוט צמיחה (פיצול או חזייה מתעכבnching) או מפני נביטה של בטחונות מן הפיר האקסון בתהליך הנקרא הסתעפות ביניים 2 (איור 1).
תחזיות המרכזית של נוירונים של DRG להציע מערכת ניסיונית שימושי ללמוד את שני הסוגים של הסתעפות axonal: כאשר האקסונים שלהם מביא להגיע השורש הגבי כניסה לאזור (דח) של חוט השדרה העובר בין ימים 10-13 (E10 - E13) הם התצוגה דפוס סטריאוטיפי של T-Y או בצורת הסתעפות. שני אקסונים הבת וכתוצאה מכן להמשיך בכיוונים מקורי או הזנב, בהתאמה, בשוליים דורסולטרלי של חוט ורק לאחר תקופת המתנה בטחונות צומחים מתוך גזע אקסונים אלה לחדור את החומר האפור (ביניים הסתעפות) ואת פרויקט ספציפי של נוירונים ממסר רבדים של חוט השדרה שם הם עוד arborize (מסוף הסתעפות) 3. העתקים DiI חשפו קונוסים צמיחה בכל אזור הכניסה השורש הגבי של חוט השדרה זה נראה ב-PRocess של פיצול טוען כי הסתעפות נגרמת על ידי פיצול של חרוט הצמיחה עצמה 4 (איור 2), עם זאת, אפשרויות אחרות נדונו גם 5.
וידאו זה מדגים הראשונה איך לנתח את עמוד השדרה של עכברים E12.5 עוזב DRG המצורפת. קיבעון בעקבות הסכומים דגימה קטנה של DiI מוחלים DRG באמצעות מחטים זכוכית משך משפופרות נימי. לאחר שלב דגירה, חוט השדרה שכותרתו מותקן כהכנה פתוח ספר הפוך לנתח אקסונים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
פרוטוקול
1. Dissection ההליך
הערה: שימוש ניסיוני של עכברים צריך לעקוב אושרה רשמית הנחיות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה.
- לפני ההכנה, להגדיר מיקרוסקופ לנתח שלך לפרוס את מכשירי ניתוח הדרוש לנתיחה כולל מספריים גדולים וקטנים, מלקחיים שיניים גדולות, מלקחיים מעוקל ארבעה סטים של דומון No.5 לנתח מלקחיים (שתיים מהן בתוך מלוטשת טיפים) ( לפרטים ראה טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד). מניחים פיסת נייר מסנן צלחת 100 מ"מ פטרי Sylgard מצופה. יוצקים קר PBS בבארות של צלחת 12 באר, צלחת פטרי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
דפוסי הקרנת סטריאוטיפית הכוללת את שני הסוגים של היווצרות ענף axonal יחד עם קלות הכנה בשילוב עם שימוש ברקמת קבוע DiI תיוג הופך את חוט השדרה העובר צמוד עם DRG מודל חיובי ללמוד axonal הסתעפות. היישום של כמויות זעירות של DiI באמצעות מחטים זכוכית מצופה מאפשר - בניגוד תיוג עיקר DRG - להדמיה של קבוצות קטנות של נוירונים DRG ובכך ניתוח של אקסונים הפרט דפוסי הסתעפות שלהם. השיטה המתוארת אפשר לשפר עוד יותר על ידי הזרקת iontophoretic של נותב lipophilic אשר מקטין עוד יותר את מספר הנוירונים שכות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים מבקשים להודות לד"ר אליסטר Garratt (מקס Delbrück מרכז ברלין) על הערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי מרכז מחקר שיתופי (SFB665) של מועצת המחקר הגרמנית (DFG).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
| Stereomicroscope STEMI DRC | Zeiss | ||
| פוספט שנאגרו פתרון (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | מרק | 8.18715.1000 | |
| מספריים כירורגית רגילה | המדע כלים פיין | 14001-13 | |
| מלקחיים תקן שיניים | המדע כלים פיין | 11021-14 | |
| תוספת קנס איריס מספריים | המדע כלים פיין | 14088-10 | |
| Curved מלקחיים | המדע כלים פיין | 11003-13 | |
| דומון No.5 בסדר טיפים מלקחיים | המדע כלים פיין | 11254-20 | |
| דומון No.5 המראה לסיים מלקחיים | המדע כלים פיין | 11252-23 | |
| Vannas-טובינגן באביב מספריים | המדע כלים פיין | 15008-08 | |
| מסנן נייר | פישר סיינטיפיק | FB59041 | |
| Sylgard 184 | Precission העולם מכשירים | SYLG184 | |
| 100 מ"מ צלחות פטרי | גריינר | 663102 | |
| 12 מ"ל צינור פוליפרופילן | קרל רוט GmbH | ECO3.1 | |
| 12 גם תרבות צלחת | בקטון דיקינסון | 35-3043 | |
| אתנול | מרק | 1.00983.2500 | |
| Flaming / בראון micropipette חולץ P-97 | סאטר Instrument ושות | ||
| בורוסיליקט זכוכית נימי | הרווארד Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3 ", 3'-tetramethyl - indocarbocyanine פרכלורט) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| מיקרוסקופ שקופיות SuperFrost פלוס | קרל רוט GmbH | H867.1 | |
| כיסוי זכוכית תלושי | קרל רוט GmbH | 1870.2 |
מקורות
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Ne....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
