איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך Cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה

סיכום

בדו"ח זה, אנו מתארים כיצד plasmon משטח תהודה משמש כדי לזהות כניסה רעלן לתוך cytosol המארח. שיטה זו רגישה מאוד יכול לספק נתונים כמותיים על כמות הרעלן cytosolic, וזה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של רעלים.

תקציר

רעלים AB מורכב האנזימטית למקטע ו למקטע תא מחייב B ^1. רעלנים אלה מופרשים אל הסביבה תאיים, אבל הם פועלים על מטרות בתוך cytosol האיקריוטים. יש רעלים א.ב. לנסוע נושאות שלפוחית ​​מפני השטח של התא אל reticulum endoplasmic (ER) לפני הכניסה cytosol ^2-4. ב ER, קטליטי שרשרת מנתק משאר הרעלן ועובר דרך ערוץ חלבון מנהלת להגיע ליעד cytosolic שלה ^5. Translocated, cytosolic שרשרת קשה לזהות כי סחר רעלן לחדר המיון הוא תהליך יעיל ביותר: רעלן הפנימו ביותר מנותבת אל lysosomes של השפלה, ולכן רק חלק קטן של רעלן פני הנכנס מגיע מנגנון Golgi ו - ER ^{6 -12.}

כדי לפקח על טרנסלוקציה רעלן מ ER כדי cytosol של תאים בתרבית, ששילבנו פרוטוקול חלוקה subcellular עם highly שיטה לגילוי רגיש של plasmon משטח תהודה (SPR) ^13-15. קרום הפלזמה של תאים שטופלו הוא רעלן permeabilized סלקטיבי עם digitonin, המאפשר איסוף של שבריר cytosolic אשר perfused לאחר מכן על החיישן SPR מצופה רעלן אנטי נוגדנים שרשרת. החיישן נוגדן מצופה יכולים ללכוד לזהות pg / mL כמויות של רעלן cytosolic. באמצעות פרוטוקול זה, אפשר לעקוב אחר קינטיקה של כניסה רעלן לתוך cytosol ו לאפיין תופעות מעכבות על האירוע טרנסלוקציה. ריכוז של טוקסין cytosolic ניתן גם לחשב עקומת סטנדרט שנוצר עם כמויות ידוע של סטנדרטים בשרשרת כי כבר perfused על החיישן. השיטה שלנו מייצג מערכת מהירה, זיהוי רגיש, כמותי שאינו מחייב radiolabeling או שינויים אחרים רעלן היעד.

פרוטוקול

1. הכנת digitonin

1. הוספת 500 μL של אתנול 100% צינור microcentrifuge ולמקם אותו בתוך גוש חום נקבע על 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
2. ממיסים 2.5 מ"ג digitonin ב 250 μL של אתנול המחומם לייצר פתרון המניה 1% digitonin.
3. כדי ליצור פתרון העבודה של digitonin 0.04%, להוסיף 40 μL הפתרון מניות digitonin כדי μL 960 של HCN חיץ (50 mM Hepes pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 מ"מ CaCl _2, 10 mM N-ethylmaleimide, וכן מעכבי פרוטאז קוקטייל).

2. תא שיכרון ו permeabilization

Assay טרנסלוקציה שלנו יכול להיות מיושם על מגוון רחב של רעלנים שורות תאים. להלן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לצורך זיהוי של רעלן הכולרה (CT). סקירה של ההליך ניתן באיור 1.

1. תאים הלה הם זורעים ב 6 גם צלחות המכילות 1 מ"ל DMEM בתוספת 10% עוברית שור בסרום לאנטיביוטיקה antimycoticכדי להשיג את 1x10 ⁶ תאים / גם לאחר דגירה לילה בשעה 37 ° C. כדי לייצר רעלן cytosolic מספיק לגילוי לשחזור, בארות בשלושה עותקים נדרשים עבור כל תנאי.
2. לאחר דגירה של לילה, להחליף את התרבות בינוני עם 1 מ"ל DMEM המכיל 100 ng / mL של ganglioside GM1. זה מגדיל את מספר אתרי קישור ה-CT, כאשר הקולטן של GM1 CT יהיה intercalate לתוך קרום הפלזמה של תאים חשופים פתרון של GM1.
3. לאחר דגירה 1 שעה בשעה 37 ° C, להסיר את המדיום GM1 המכילים לשטוף את התאים פעמיים עם DMEM. ואז, במקום תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב 1 מ"ל DMEM המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ה-CT.
4. הסר את בינוני המכיל רעלן, לשטוף את התאים פעמיים עם DMEM ו דגירה התאים 1 מ"ל DMEM על 37 מעלות צלזיוס למשך פרק הזמן הרצוי (ים).
5. בסוף כל תקופה מרדף, לשטוף את התאים עם PBS ו דגירה כל טוב עם 250 μL של 0.5 mM EDTA ב PBS. בואו התאים לשבת 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להסיר אותם מהצלחת 6-היטב על ידי טחינה דקה נמרצת עם pipetman p1000. אחרי אחד טוב של תאים נאסף, לשלב את זה עם השני והשלישי אז גם מאותו מצב. מגרדים תאים יכול לשמש גם כדי לאסוף את התאים.
6. מניחים את ההשעיה תא משולב משלוש בארות לשכפל (750 הנפח הכולל μL) בצינור microcentrifuge אחת, לסובב אותו microcentrifuge השולחן במשך 5 דקות ב 5000 x ז כדורי נייד בגודל שווה בערך יש לקבל את כל התנאים.
7. בטל supernatant ו resuspend התא גלולה ב 100 μL של הפתרון עובד 0.04% digitonin. מניחים את ההשעיה התא על קרח דק 10.
8. ספין התאים digitonin permeabilized ב-XG 16,000 עבור 10 דקות ב microcentrifuge השולחן. העברת חלק cytosol המכילים supernatant לצינור microcentrifuge טריים, לשמור על חלק אברון המכיל גלולה.

הכותרת "> 3. מדגם הכנה

1. Cytosol המכילים שברים supernatant הם מדולל במאגר HCN לנפח סופי של 1 מ"ל. כרכים מדגם של 1 מ"ל לפחות נחוצים כדי להבטיח אוויר מטוהר מן לולאה 500 המדגם μL לפני ההזרקה.
2. אברון המכיל שברים גלולה הם resuspended ב 1 מ"ל של חיץ HCN המכיל 1% טריטון X-100. תוספת של חומר ניקוי יש צורך לשחרר את הבריכה עטוף קרום של הרעלן.
3. סטנדרטים רעלן בריכוזים של 100, 10, 1, 0.1 ng / mL ערוכים חיץ HCN.
4. סטים מקבילים של שברים cytosolic ו אברון מוכנים לניסוי בקרה כדי לאשר את אמינות ההליך חלוקה. שברים שנוצרו כמתואר בסעיף 2 הם resuspended ב 20 μL של חיץ מדגם 4x (חלק cytosolic) או 120 μL של חיץ 1x המדגם (חלק אברון). כרכים שווה כל שבריר של נפתרות על ידי אלקטרופורזה dodecyl נתרן סולפט polyacrylamide ג'ל נחקר בy ניתוח המערבי כתם כדי להדגים את מחיצות של חלבון cytosolic בשבריר supernatant ו מסיסים, תושב חלבון ER בשבריר גלולה ^16-19.

4. SPR הכנת שקופית

1. SR7000 רייכרט SPR Refractometer משמש ניסויים SPR.
2. סט שקופיות זכוכית מצופה זהב עם monolayer עצמית התאספו במכשיר SPR. כדי להפעיל את השקופית חיישן, perfuse (v: v) 01:01 פתרון של 0.4 M ו EDC 0.1 NHS M על המגלשה במשך 10 דקות בקצב זרימת μL 41 / min. כל perfusions הבאות ישתמשו את קצב הזרימה אותו.
3. כדי להסיר את EDC: מאגר NHS ההפעלה, לשטוף את הצלחת 5 דקות עם PBS המכיל 0.05% Tween 20 (PBST). צלחת כרגע מכיל רצועות אמיד תגובתי עקב פתחה את המיכסה על ידי EDC: פתרון NHS.
4. Perfuse נוגדן אנטי CTA מעל להחליק את חיישן מופעל על דילול של 1:20,000 ב 20 מ"מ נתרן אצטט (pH 5.5) במשך 15 דקות. ירידה ראשונית השבירה בדקס יחידה (Riu) יראו עקב שינוי ה-pH. זה יהיה ואחריו עלייה Riu כמו הנוגדן הוא נתפס על ידי אמיד-reactive רצועות בשקופית חיישן.
5. הסר נוגדן מאוגד משקופית החיישן עם לשטוף PBST 5 דקות. האות Riu המיוצר על ידי הנוגדן שנתפסו הרמה ולייצב, יהיה מתן אות ההתחלה החדשה.
6. Perfuse 1 M ethanolamine (pH 8.5) על המגלשה חיישן 5 דקות. זה כובעים inactivates כל רצועות מאוגד שמאל בשקופית חיישן.

5. SPR ניתוח של דגימות

1. כדי ליצור קריאת המחקר, PBST perfuse על חיישן נוגדן מצופה דקות 5.
2. Perfuse מדגם ניסיוני או תקן הרעלן על החיישן עבור 300 שניות. הסר את ליגנד מתוך המאגר ואת PBST perfuse מעל החיישן למשך 200 שניות.
3. בעקבות כל זלוף, רעלן מחויב יוסר החיישן על ידי לשטוף שנייה עם 100 PBST ב-pH 5.0. זה יחזיר את האותלקריאת המחקר הראשוני שלה, ובכך מאפשר דוגמה נוספת להיות מעובד על חיישן זהה.
4. לפני טעינת מדגם חדש, לדחוף כמות קטנה של אוויר דרך הלולאה מדגם לגרש כל נוזל שיורי מן המדגם מראש. באמצעות ההליך המתואר 5.2-5.4, יש לנו להפעיל עד 12 דגימות בשקופית אחד ללא איבוד משמעותי של אות הבסיס.
5. ניתוח הנתונים מבוצע עם התוכנה המטהר 2, ואת תוכנת איגור משמש להכנת דמות.

6. נציג תוצאות

רעלן שעלת (PT) הוא רעלן א.ב. שזז מתא השטח למיון לפני שרשרת (PTS1) שלה נכנס cytosol ^{3, 12.} כפי שניתן לראות בתרשים 2, assay SPR מבוססי שלנו יכולה לזהות טרנסלוקציה PTS1 ב cytosol של תאים CHO שיכורים. האות לא נוצר מתוך cytosol של תאים unintoxicated, אשר אישרו את הנוגדן אנטי PTS1 לא חוצה להגיב עם מרכיב של cytosol המארח.חלק מתאי cytosolic שיכורים בנוכחות brefeldin (BFA) גם הצליחו לייצר איתות חיובי. BFA מונע תחבורה רעלן לאתר טרנסלוקציה ER ^{6-8, 12, 20-25,} ולכן אספקת שרשרת cytosol. בסוף כל סיבוב, מחויב הוא רעלן הפשיטו משקופית החיישן. זה מספר דגימות מותר להיות מוקרן בשקופית חיישן יחיד ובכך סיפק השוואה ישירה בין התוצאות המתקבלות עם תנאי הניסוי השונים.

CT הוא עוד סוג AB, ER-translocating רעלן ^4. בשנת איור 3A, CTA1 זוהה השבר cytosolic מ CT שטופלו בתאים הלה. זה הדגיש כי המתודולוגיה שלנו עובדת עם סוגי תאים מרובים יכול להיות מיושם על כל רעלן עבורו אנטי נוגדנים שרשרת זמין. האות לא זוהה כאשר חלק מן ה-CT cytosolic שטופלו בתאים היה perfused על חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי CTB (איור 3B), ובכך הוכחת כי CTA1למקטע אך לא את תא מחייב CTB pentamer נכנס cytosol. איור 3C מראה את האות השבר אברון כבוי בקנה מידה בהשוואה האות החלש מתוך השבר cytosolic. זה עולה בקנה אחד עם היעילות הידועה של CT התחבורה לאתר טרנסלוקציה ER ^{6, 7,} אשר בתורו מגביל את כמות הרעלן שיכולים להגיע cytosol. יתר על כן, חלק אברון מכיל holotoxin CT וכן ER-CTA1 מקומי, כך האות וכתוצאה מכך SPR לשבריר אברון הוא מנופח על ידי המסה נוספת של holotoxin הקשורים CTB pentamer. לפיכך, אין זה מעשי העלילה נתוני שברים אברון ו cytosolic על sensorgram זהה.

Assay שלנו יכולים לעקוב אחר הצטברות תלוי זמן של הרעלן, translocated cytosolic (איור 4). תאים שנחשפו CT ב 4 מעלות צלזיוס, טמפרטורה המאפשרת רעלן מחייב קרום הפלזמה אבל מונע הפנמה של הרעלן לתא הקשורים. לאחר רמוval של הרעלן מאוגד, התאים היו חימם עד 37 ° C. שתי תחבורה רעלן לחדר המיון ו טרנסלוקציה שרשרת cytosol יכול להתרחש בטמפרטורה זו. הרעלן לא זוהה ב 15 הדקות cytosol אחרי ההתחממות על 37 ° C. זה שיקף את זמן השהיה נדרש סחר (i) holotoxin לחדר המיון (ii) ניתוק / B למקטע בחדר המיון, וכן (iii) לייצא שרשרת cytosol. בריכת קטין של הרעלן cytosolic זוהה לאחר 30 דקות 37 ° C, וכמויות גדולות של הרעלן בהדרגה cytosolic התגלו לאחר 45 ו - 60 דקות intervals מרדף. רמות אפילו גדול יותר של הרעלן cytosolic התגלו לאחר הפסקה מרדף 5 שעה ^17, ובכך הוכחת מתמשך, לטווח ארוך משלוח של הרעלן לתא הקשורים ל cytosol המארח.

Assay שלנו יכול גם לזהות את עיכוב טרנסלוקציה רעלן את cytosol (איור 5). תאים שטופלו sulfoxide דימתיל 10% (DMSO), המלווה כימי המונע disord תרמיתering של למקטע CTA1 מבודדים (ט 'ו ק' Teter בנרג'י, תצפיות לא פורסם), הפגינו רמות נמוכות של CTA1 cytosolic בהשוואה לתאי קבוצת הביקורת. התגלגלות של הרעלן השרשרת היא תנאי הכרחי טרנסלוקציה את cytosol ^16-18, כך ייצוב DMSO-Induced של CTA1 בהתאם מנעו תנועה שלה ER כדי cytosol.

שיעור העמותה קבוע (k) מחושבת מניסויים SPR עומד ביחס ישר לריכוז של ליגנד במאגר זלוף ^{14, 15, 26.} לפיכך, ניתן לקבוע את ריכוז הרעלן cytosolic מן הגרף כי המגרשים k _ערכים סטנדרטים רעלן כפונקציה של ריכוז הרעלן. הליך זה נעשה שימוש כדי לכמת את גוש DMSO-Induced של טרנסלוקציה רעלן שהוצגו איור 5: עקומת סטנדרט שנוצר בריכוזים ידועים של הרעלן היה בשימוש כדי לחשב cytosolic CTA1 concentratיון של 0.3 ng / mL עבור בתאים שלא טופלו ו 0.1 ng / mL עבור DMSO שטופלו בתאים (איור 6). עיכוב של התגלגלות CTA1 ידי DMSO ובכך יצר הפחתה של פי 3 טרנסלוקציה ל-ER cytosol של CTA1.

1. איור פרוטוקול סקירה. (א) תאים מודגרת עם הרעלן AB ב 4 מעלות צלזיוס, טמפרטורה המאפשרת רעלן מחייב פני התא, אך מונע אנדוציטוזה הרעלן. תת יחידות A ו-B של הרעלן מיוצגים על ידי עיגולים אדומים וכחולים, בהתאמה. (ב) רעלן מאוגד יוסר המדיום, ותאי הם חיממו על 37 מעלות צלזיוס על מנת לקדם את התחבורה ואת מדרדר אנדוציטוזה של holotoxin למיון. Holotoxin דיסוציאציה מתרחשת בחדר המיון, אשר מאפשר בשרשרת מבודדת להיכנס cytosol על ידי עובר דרך ערוץ חלבונים ביצוע (ים) בקרום ER. (ג) תאים מטופלים עם digitonin כדי סלקטיבי permeabilize פלזמהקרום. (ד) צנטריפוגה משמש לחלוקת תאים לתוך שברים cytosolic ו אברון נפרד. Cytosol הוא סחט של התא דרך digitonin שנוצר הנקבוביות והוא ממוקם supernatant. שלם, קרום הנכנס אברונים נמצאים השבר גלולה. (ה) כדי לזהות את הבריכה translocated שרשרת רעלן בתוך cytosol המארח, השבר הוא supernatant perfused על חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי-A שרשרת.

באיור 2. איתור של טרנסלוקציה PTS1 לתוך cytosol המארח. בתאי CHO היו הדופק שכותרתו ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של PT. התאים היו רדפו אז עבור 37 שעות 3 מעלות צלזיוס רעלן ללא בינוני המכיל אין תוספות (שיכורים) או 5 מיקרוגרם BFA / mL (+ BFA שיכורים). Permeabilization של קרום הפלזמה עם digitonin שימש מחיצה בתוך התא תמציות אברון נפרד cytosolic fractiתוספות. חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי PTS1 נעשה שימוש כדי לאתר את הבריכה cytosolic של PTS1 מ בתאים שלא טופלו או שטופלו BFA. PTS1 הסטנדרטים היו perfused מעל החיישן כפקדי חיובי, בעוד חלק מן התאים cytosolic unintoxicated היה perfused על המגלשה חיישן כביקורת שלילית. בסוף כל סיבוב, מדגם מחויב הופשט משקופית החיישן.

באיור 3. איתור של טרנסלוקציה CTA1 לתוך cytosol המארח. תאים הלה הדופק שכותרתו ב 4 ° C עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של CT נרדפו במשך שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס רעלן ללא בינוני המכיל אין תוספות (שיכורים) או 5 מיקרוגרם BFA / mL (+ BFA שיכורים). Permeabilization של קרום הפלזמה עם digitonin שימש מחיצה בתוך התא תמציות אברון נפרד שברים cytosolic. (א) שברים cytosolic היו perfused על חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי CTA. ידועכמויות של CTA שימשו שולטת חיובי, בעוד cytosol מתאי unintoxicated שימשה כביקורת שלילית. (ב) חלק cytosolic מתאי שיכורים בהעדר BFA היה perfused על חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי CTB. CTB מטוהרים pentamer היה perfused על המגלשה כביקורת חיובית. (ג) חלק אברון היה solubilized עם 1% טריטון X-100 לפני זלוף על חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי CTA. לצורך ההשוואה, השבר cytosolic (1 מ"ל נפח סופי) מ לחלץ את אותו התא ורמת CTA היו perfused גם על החיישן. עבור כל לוחות, מדגם מחויב הופשט מחיישן בסוף כל סיבוב.

איור 4. קינטיקה של כניסה לתוך CTA1 cytosol. הלה תאים הדופק שכותרתו ב 4 ° C עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של CT נרדפו במשך 15, 30, 45 או 60 דקות ב 37 מעלות ללא הרעלן mediuמ ' כדי לזהות את הבריכה translocated של הרעלן, שברים cytosolic מ digitonin-permeabilized התאים היו perfused על חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי CTA. סטנדרטים CTA היו perfused על החיישן גם. בסוף כל סיבוב, מדגם מחויב הופשט משקופית החיישן.

איור 5. עיכוב של טרנסלוקציה CTA1 ידי DMSO. תאים הלה הדופק שכותרתו ב 4 ° C עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של CT נרדפו במשך שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס רעלן ללא בינוני המכיל אין תוספות (שיכורים) או DMSO 10% (+ DMSO שיכורים). כדי לזהות את הבריכה translocated של הרעלן, שברים cytosolic מ digitonin-permeabilized התאים היו perfused על חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי CTA. CTA סטנדרטים (100, 10, 1, ו - 0.1 נ"ג / מ"ל) היו perfused מעל החיישן כפקדי חיובי, רק 1 ו - 0.1 ng / mL סטנדרטים מוצגות למטרות דרוג. Cytosol מ unintoxicateתאים ד שימשה כביקורת שלילית. בסוף כל סיבוב, מדגם מחויב הופשט משקופית החיישן.

איור 6. חישוב CTA1 cytosolic. K ערכים עבור סטנדרטים CTA מ איור 5 היו זממו כפונקציה של ריכוז הרעלן. עקומת תקן וכתוצאה מכך נעשה שימוש כדי לקבוע, על סמך k _ערכים של דגימות מן הניסוי איור 5, ריכוז CTA1 cytosolic בתאים שלא טופלו ו DMSO שטופלו. סטנדרטים רעלן מוצגים כעיגולים מלא; cytosol מטופל מוצג מרובע פתוח, ואת cytosol DMSO שטופלו מוצג מעגל פתוח. ממוצעים ± טווחים של שני ניסויים בלתי תלויים מוצגים.

דיון

השוואה המתודולוגיה הקיימת

Assay SPR מבוססי שלנו טרנסלוקציה מייצג שיטה מהירה, רגיש, כמותי כדי לזהות משלוח רעלן לתוך cytosol המארח. הטכניקה אינה דורשת radiolabeling או שינויים אחרים הרעלן, וזה יכול להיות מיושם על כל רעלן עבורו אנטי רעלן נוגדנים שרשרת זמין. השיטות הקיימות כדי לפקח על המעבר רעלן לתוך cytosol גם לסמוך על פרוטוקול חלוקה subcellular לתא תמציות לתוך cytosol מחיצה נפרדת שברים קרום ^{11, 23, 27, 28.}...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
Digitonin	סיגמא	D141
אתנול	Acros	61509-0010
DMEM	Invitrogen	11995065
סרום שור עוברית	אטלנטה הביולוגיים	S11550
Ganglioside GM1	סיגמא	G7641
CTA	סיגמא	C2398
PTS1	רשימה	182
NHS (N-Hydroxysuccinimide)	לנקב	24500
EDC (1-אתיל-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)	Thermo Scientific	22981
Ethanolamine	סיGMA	E0135
PBST	Medicago	09-8903-100
Anti-CTA נוגדן	סנטה קרוז ביוטק	SC-80747
נוגדן Anti-CTB	Calbiochem	227040
Anti-PTS1 נוגדן	סנטה קרוז ביוטק	SC-57639
Refractometer	רייכרט	SR7000, SR7000DC
SPR חיישן שקופיות	רייכרט	13206060
מזרק משאבה	קול פאלמר	780200C