טכניקות אנליטיות עבור assaying bioactivity תחמוצת החנקן

סיכום

ייצור אנדוגני של תחמוצת החנקן (NO) מסדיר מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים. מתברר יותר ויותר כי שיבוש או dysregulation של איתות NO מבוסס מעורב מחלות אנושיות רבות. שיטות לכמת רלוונטי מטבוליטים אינו רשאי לספק סמנים ביולוגיים מנבא אבחון או הרומן של מחלות אנושיות.

תקציר

תחמוצת החנקן (NO) הוא חינם diatomic הרדיקלי כי הוא קצר ביותר חיו במערכות ביולוגיות (פחות מ 1 השני במחזור הדם) ^1. אין לעשות שנחשב לאחד את מולקולות האיתות החשוב ביותר המיוצר בגופנו, ויסות הפונקציות החיוניות, כולל אך לא רק ויסות לחץ הדם, תגובה חיסונית ותקשורת עצבית. לכן זיהוי מדויק שלה וכימות של מטריצות ביולוגיות הוא קריטי כדי להבין את התפקיד של NO מחלה ובריאות. חיים כגון 1/2 קצר הפיזיולוגי של NO, אסטרטגיות חלופיות עבור זיהוי של תוצרי התגובה של הביוכימיה NO פותחו. כימות של מטבוליטים אין הרלוונטיים תאים ביולוגיים רבים מספק מידע רב ערך לגבי in vivo לא, הייצור הזמינות הביולוגית ואת חילוף החומרים. כל שעליך לעשות הוא דגימה תא יחיד, כגון דם או פלסמה לא תמיד לספק הערכה מדויקת של כל בוdy חסרי מעמד, בעיקר ברקמות. היכולת להשוות עם דם ברקמות נבחרים חיות הניסוי יסייע לגשר על הפער בין המדע הבסיסי לבין הרפואה הקלינית ככל כלי אבחון פרוגנוסטית של אין סמנים ביולוגיים בריאות ומחלות. לכן, אקסטרפולציה של מצב NO פלזמה או דם לרקמות ספציפיות של עניין היא כבר לא הגישה חוקי. כתוצאה מכך, שיטות להמשיך להתפתח ומאומתים המאפשרים זיהוי וכימות של מוצרים לא ולא הקשורה / מטבוליטים של תאים רבים של חיות הניסוי in vivo. הפרדיגמה הוקמה לביוכימיה NO מייצור ידי אין synthases על הפעלת מסיסים guanylyl cyclase (SGC) לחמצון בסופו של דבר אל ניטריט (NO ₂ ^-) ו - ניטראט (NO ₃ ^-) יכול לייצג רק חלק מתופעות של אין in vivo. האינטראקציה של מטבוליטים לא ולא הנגזרות עם thiols חלבון, אמינים משניים, ומתכות להקים S-nitrosothiOLS (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), ו-heme nitrosyl בהתאמה מייצגים-cGMP עצמאיים ההשפעות של NO וסביר לא פחות חשובים מבחינה פיזיולוגית כמו הפעלת SGC בשום. הבנה אמיתית של NO בפיזיולוגיה נגזר בניסויים ב vivo הדגימה תאים מרובים בו זמנית. המתודולוגיה החנקן (NO) תחמוצת היא מדע מורכב ומבלבל לעיתים קרובות מוקד ויכוחים רבים ודיון בנוגע NO ביוכימיה. הבהרה מנגנונים חדשים במעברי האותות שאין בה דבר תלוי ביכולת שלנו באופן ספציפי, סלקטיבי וברגישות לזהות ולכמת NO וכל רלוונטי אין מוצרים מטבוליטים של מטריצות ביולוגיות מורכבות. כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח מהיר ורגיש של הניטריט ו חנקתי על ידי HPLC, כמו גם זיהוי של NO חופשית דגימות ביולוגיות באמצעות ב chemiluminescence האוזון חוץ גופית מבוסס עם derivitazation הכימית כדי לקבוע את המקור המולקולרי של NO כמו גם vivo לשעבר עםאמבטיה איבר myography.

פרוטוקול

1. דם מלא אוסף

1. איסוף דם ורידי מבני אדם או בחיות מעבדה ב Nem / EDTA מבחנות המכילות.
2. מיד לסובב את הדם בצנטריפוגה benchtop על 14,300 RCF (כוח צנטריפוגלי יחסית) במשך 7 דקות להכין פלזמה תא דם אדום גלולה.
3. הכינו דגימות פלסמה של כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים (HPLC) וזיהוי chemiluminescence (CLD) ניתוח.
   HPLC: הוסף 01:01 היקף מתנול קר פלזמה, מערבולת ו צנטריפוגות בסל"ד 13,200 במשך 10 דקות חלבונים פלזמה לשקוע. איסוף supernatant לניתוח HPLC.
   CLD: aliquot מדגם preincubate עם sulfanilamide ו כלוריד כספיתי באופן ספציפי nitrosothiols assay.
4. הכן אדום תא גלולה עבור HPLC וניתוח CLD.
   HPLC: הוסף 01:04 אדום תא גלולה לפתרון תמוגה hypotonic המכיל 10 Nem מ"מ, 2.5 מ"מ ו - 10 mM EDTA ferricyanide. מערבולת ביסודיות ולאחר מכן להוסיף 01:01 מתנול, מערבולת centrifuge בסל"ד 13,200 במשך 10 דקות לחלבון המשקע. איסוף supernatant לניתוח HPLC.
   CLD. הוסף 01:04 אדום תא גלולה לפתרון תמוגה hypotonic המכיל 10 mM EDTA, 2.5 מ"מ ו - 10 mM EDTA Ferricyanide. Aliquot דוגמאות לצינורות המכילים כלוריד כספיתי ו sulfanilamide לגילוי ספציפי של nitrosothiols.

2. רקמת כריה הכנה

1. כדי לקבוע רמות של מטבוליטים ברקמות לא, זה הכרחי 1 למסוק רקמת הדם בחינם עבור הכנת המדגם כפי שתואר לעיל. החלפת דם מלאה יתקיימו על ידי יציקת חיץ פיזיולוגית באמצעות איפקס של החדר השמאלי. לאחר כל הדם מוסר, רקמות של עניין לאחר מכן ניתן לקצור.
2. Homogenize דגימות רקמה והכנת דגימות כפי שתואר למעלה HPLC וניתוח CLD.

3. בידוד טבעות אבי העורקים על תפקוד האנדותל

איברים רקמות אמבטיה

1. עכברים יהיה anesthetized עם האתר diethyl עד תגובה לא ליישר קורט, ועוברים פריקה צוואר הרחם לפני הניתוח. פתיחת בית החזה מתבצע כדי לחשוף את אבי העורקים החזי ואת הבטן. מזרק 25 מד מוכנס לתוך איפקס של החדר השמאלי ו perfused חופשית של דם מחומצן עם חיץ Henseleit קרבס.
2. אטריום ימין נחתך לספק היציאה לדם. אבי העורקים בבטן יוסר וניקה של adventitia.
3. טבעות יהיה חתוך 2 קטעים ארוכים מ"מ רכוב על אמבטיה ערוץ ארבע רקמות איבר (DMT 720MO, מכשירים לספירה) שטוף פתרון חיץ פיזיולוגית.
4. טבעות כלי השיט נשמרות ל -10 מ"ל אמבטיות איברים עם מחומצן קרבס חיץ (95% O ₂ ו - 5% CO ₂₎ ב 37 ° C. אחד יומרה גרם מושם על כל טבעת אבי העורקים (מתח המוצא המתאים לתפקוד אופטימלי vasomotor כפי שנקבע בניסויים קודמים). 8 ערוצים אוקטלי הגשר (Powerlab) ונתונים רכישה התוכנה (גירסה 5.2.2 תרשים)שוב נהג להקליט את כל מדידות כוח.
5. טבעות מותר לאזן על 80 דקות עם למאגר באמבטיה כל איבר שונה בכל 20 דקות. לאחר איזון 80 דקות, 1 phenylephrine מיקרומטר מתווסף כל טבעת על התכווצות submaximal.
6. לאחר ייצוב, אגוניסט האנדותל כגון אצטילכולין יתווספו לקבוע NO הייצור ומידת הרפיה כלי. לאחר שסיימת לענות של מינון כדי אצטילכולין, אמבטיות תהיה שטופה recontracted וטופלו לאחר מכן עם מקור אקסוגני של תחמוצת החנקן, nitroprusside נתרן כדי לקבוע התגובה של השריר החלק וכדי לקבל ערך עבור הרפיה 100%.
7. אוכלי נבלות אין ניתן להוסיף לאמבטיה כדי להמחיש באופן ברור שחרורו של עיכוב NO ושל רוגע כלי.

4. נציג תוצאות

השימוש ENO-20 ייעודי HPLC מספק קל לשימוש שיטת תפוקה גבוהה לגילוי ספציפי ורגיש של הניטריט ו חנקתי במטריצות ביולוגיות. העיקרון של איתור הכרומתוגרמה המקורי מוצג באיור 1. שיטה זו יכולה לשמש עבור כל דגימה ביולוגית לקביעת הניטריט ו חנקתי. זיהוי מבוסס CLD של מטבוליטים לא דורש derivitization כימיים צעד כדי לקבוע את המקור המולקולרי של NO. התקנה ניסיונית denitrosation חמצוני בו זמנית denitrosation רדוקטיבי עבור גלאי chemiluminescence מוצג באיור 2. כלי התגובה בצד ימין מלא ferricyanide 800mm ב PBS pH 7.4 ואת כלי התגובה בצד שמאל מלא בתערובת יודיד / יוד אשלגן חומצה אצטית על denitrosation ירידה (איור 2 א). ההתקנה כולה מוצג באיור 2 ב. איור 3 מדגים ספציפיים הקבוצה denitrosation מבחני ניתן לזהות ולכמת הניטריט, nitrosothiols nitrosamines, כמו גם מוצרים heme nitrosyl. שיטה זו הייתה בעבר descriהמיטה ומאומתים ^4,5. ניתוחים אלה ביוכימיים חשובים יכול בקלות להיות מתואם עם מחקרים תפקודית על טבעות אבי העורקים בודדים כדי לקבוע האנדותל NO ייצור בחיות מעבדה. זה ניסוי תרופתי קלאסית יכול בקלות ובאופן מדויק להערכת תפקוד האנדותל NO והפקה. מדידת תגובתיות כלי כדי אגוניסטים אנדותל כגון אצטילכולין יכולה ישירות לקבוע ייצור האנדותל NO אז מה שיכול להיות בקורלציה עם סמנים ביוכימיים שהתגלו בדם ורקמות של חיות הניסוי. ייצוג אופייני בתגובה המינון כדי אצטילכולין מוצגת באיור 4. עכברים שליטה בריאים עם תפקוד האנדותל תקין להגיב אצטילכולין על ידי הרפיית. עכברים עם תפקוד לקוי של האנדותל (עכברים כולסטרול) הצג הרפיה מופחתת עקב ירידה בייצור NO לגירוי זהה.

תאנהיור 1. עקרון זיהוי של הניטריט ו חנקתי על ידי ENO-20 ו הכרומתוגרמה המדגם. (למעלה) סכמטי של שיטת-20 ENO של גילוי הניטריט ו חנקתי. (למטה) chromotogram רמת הניטריט pmol 10 ו חנקתי מוזרק ENO-20 (100 μl של 100 ננומטר הפתרון של הניטריט ו חנקתי). הרגישות של 1 ננומטר עבור כל אניון עם נפח הזרקה 100 μl. לא הפרעה חלבון או מינים צבעוניים.

2. איור CLD התקנה ניסיונית הן באמצעות denitrosation חמצוני על ידי denitrosation ferricyanide ו רדוקטיבי באמצעות יודיד / יוד assay עם גילוי הגז שלב מטוהר גז תחמוצת החנקן.

איור 3. (לוח) איתור chemiluminescence של הניטריט, RSNO, RNNO ב assay denitrosation רדוקטיבי ידי preincubation המדגם עם קבוצה ספציפית chemicאל חומרים כימיים. הפחתה של אזורים השיא לאפשר זיהוי של הניטריט ו RSNOs. (לוח ב ') גילוי chemiluminescent המינים heme nitrosyl באמצעות פתרון denitrosation חמצוני של ferricyanide. שיטה זו היא ספציפית עבור NO-heme מוצרים עם תגובתיות לא צלב עם RSNOs (GSNO או sno-אלבומין), או RNNO (NO-pyrrolidine ו N-nitroso-אלבומין).

איור 4. איבר Ex vivo אמבטיה על טבעות אבי העורקים מבודדות מספק מדד ישירה של ייצור NO האנדותל כי אז יכול להיות מתואם עם סמנים ביוכימיים שזוהו על ידי HPLC ו CLD. נתון זה ממחיש הרפיה מופחת בעכברים עם תפקוד לקוי של האנדותל בגלל ירידה בייצור NO.

דיון

בשיטות שתוארו כאן כימות של מטבוליטים אין הרלוונטיים תאים ביולוגיים רבים תאפשר טביעת אצבע של הביולוגיה NO בבריאות ומחלות שיכולים להיות מתואם עם מדידות פונקציונליות של NO על ידי האנדותל. שיטות אלו דורשים הכנה מדגם פשוט עם פוטנציאל להתאים את קצב העברת נתונים גבוה. הכמות היחסית של שתי המולקולות האלה מסוגלות לעזור להבין את הייצור של NO וגורלו חילוף החומרים שלה במספר מודלים ניסויים של המחלה, ואפילו דגימות מחולים סדרתיים אדם. ישנם מכשולים רבים אין גילוי סמנים ביולוגיים המבוססים על שיטות ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
N-ethylmaleimide	Thermo Scientific	23030
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
אשלגן Ferricyanide	Fluka	60299
HPLC	Eicom קורפ	ENO-20
Autosampler	אלקוט
DMT Myograph	אלצהיימר מכשירים
PowerLab	אלצהיימר מכשירים
Chemiluminescent	EcoPhysics	CLD 88Y
סרכזת	Eppendorf	5415D
אצטילכולין	Sigma-Aldrich	A6625
R-(-) Phenylephrine	Sigma-Aldrich	P6126