העיתון מתאר שיטה פשוטה כדי הקרנית בלו וכדי להוציא את העקר רקמות רשתית העין מן העולם של תורמים גווייה אדם. הטכניקה המתוארת כאן יעזור ובלו רקמות באיכות טובה כדי לשמש להשתלה, למטרות מחקר או ניתוח מבלי לפגוע ברקמות אחרות של הגלובוס העין.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אנוקלציה (Enucleation) היא התהליך של הוצאת גלגל העין מתורם גופה תוך השארת שאר חלקי גלגל העין ללא הפרעה. כריתה (Excision) מתייחסת להוצאת רקמות עיניות, ובמיוחד הקרנייה, על ידי חיתוכה והפרדתה מגלגל העין. אוויסקרציה (Evisceration) היא התהליך של הסרת האיברים הפנימיים, המתייחסים כאן לרשתית. גלגל העין מורכב מהקרנייה, הלובנה (Sclera), הגוף הזגוגית, העדשה, הקשתית, הרשתית, הכורואיד, שרירים וכדומה (תוספת איור 1). כאשר מטופל סובל מנזק לקרנייה, יש להסיר את הקרנייה ולהשתיל קרנייה בריאה באמצעות ניתוחי קרנייה (keratoplastic surgeries). הפרעות גנטיות או פגמים בתפקוד הרשתית עלולים לפגוע בראייה. ניתן להשתמש בגלגלי עיניים אנושיים להליכים כירורגיים שונים, כגון בנק עיניים, השתלת קרנייה או לובנה אנושית ומחקר של רקמות עיניות. עם זאת, קיים מידע מועט על כריתת קרנייה ורשתית אנושית, ככל הנראה בשל הנגישות המוגבלת לרקמות אנושיות. מרבית המחקרים המתארים הליכים דומים בוצעו במודלים של בעלי חיים. מדעים נסמכים על זמינותן של רקמות עיניות שחולקו כהלכה ונשמרו היטב כדי להרחיב את הידע על התפתחות העין האנושית, ההומאוסטזיס ותפקודה. מכיוון שאנו מקבלים כמות גדולה של גלגלי עיניים, שמרביתם (כ-40%, טבלה 1) משמשים למטרות מחקר, אנו מסוגלים לבצע מספר רב של ניסויים ברקמות אלו, ולהגדיר טכניקות לכריתתן ולשימורן באופן קבוע.
הקרנית היא רקמה חסרת כלי דם המאפשרת את העברת האור אל הרשתית, ולצורך כך עליה לשמור תמיד על דרגה טובה של שקיפות. בתוך הקרנית, אזור הלימבוס, המהווה מאגר של תאי גזע, מסייע לשחזור תאי אפיתל ומגביל את גדילת היתר של הלחמית כדי לשמור על שקיפות ובהירות הקרנית. הגודל והעובי של הקרנית הם קריטיים לראייה צלולה, שכן שינויים בכל אחד מהם עלולים להוביל לראייה מטושטשת ולא ברורה. הקרנית מורכבת מ-5 שכבות: א) אפיתליום, ב) שכבת בומן (Bowman's layer), ג) סטרומה, ד) קרום דסמט (Descemet's membrane) ו-ה) אנדותליום. כל השכבות חייבות לתפקד כראוי כדי להבטיח ראייה צלולה4,5,6. הכורויה היא השכבה הביניים שבין הלובן לרשתית, הגבולה מפנים על ידי קרום ברוך (Bruch's membrane), והיא האחראית על זרימת הדם בעין. הכורויה מסייעת גם בוויסות הטמפרטורה ומספקת הזנה לשכבות החיצוניות של הרשתית5,6. הרשתית היא שכבת רקמה עצבית המכסה את החלק האחורי של גלגל העין (נספח איור 1) והיא מורכבת משני חלקים: חלק פוטו-רצפטיבי וחלק שאינו רצפטיבי. הרשתית מסייעת בקליטת האור מהקרנית ומהעדשה וממירה אותו לאנרגיה כימית המועברת בסופו של דבר למוח בעזרת העצב האופטי5,6.
מטרתו של מאמר זה היא לספק פרוטוקול לדיסקציה של רקמות קרנית ורשתית מגלובוסים עיניים אנושיים. מניעת זיהום צולב עם רקמות סמוכות ושמירה על שלמות ה-RNA הן בעלות חשיבות מכרעת, שכן רקמות אלו חיוניות למטרות מחקר השואפות ל-(i) אפיון הטרנסקריפטום של רקמות העין, (ii) בידוד תאי גזע עבור פרויקטים של רפואה רגנרטיבית, ו-(iii) הערכת הבדלים היסטולוגיים בין רקמות מנבדקים בריאים/חולים. במאמר זה אנו מתארים את הטכניקה שבה אנו משתמשים כיום להסרת הקרנית, הכורואיד ורקמות הרשתית מגלובוס עין. להלן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לדיסקציה של גלובוס העין האנושי ולהוצאת רקמות הקרנית והרשתית. הסרטון המצורף יעזור לחוקרים ללמוד טכניקה מתאימה להשגת רקמות אנושיות יקרות שקשה למצוא באופן שוטף.
פרוטוקול
1. כריתת באתרו של הקרנית מן גלובס העינים
- הפעל את ארון האוויר זרימה למינרית כ 15 דקות לפני השימוש. לנקות את מכסה המנוע באמצעות זרימה למינרית איזופרופיל אלכוהול 70%. ללבוש ביגוד מגן אישי, כגון שווי המסכה כירורגית. לשפשף את הידיים והאמות ומייבשים בעזרת מגבת סטרילית. ללבוש כפפות סטריליות ועל שמלת שרוולים או באמצעות טכניקה מזוהם.
- הגדר את השדה הסטרילי על ידי הצבת מכשיר מגש סטרילי בסביבה נקייה מחיידקים. לוודא כי המכשירים הם סטריליים. פתח את חבילת כלי סטרילי להפוך למגרש סטרילי להימנע מכל זיהום.
- מקם את כל החומרים והכלים סטריליים (טבלה 2) יחד עם בקבוקים צנצנות (עיניים) המכילים גלובס עיניים, כך שהם הסמוכים קצה השדה הסטרילי עבור קלות שימוש.
- תוויות הבקבוקים עם שימור שהוכן קודם לכן / בינוני אחסון כמצוין בטבלה 3 ואת המקוםמ 'על פני השטח של מכסה המנוע באוויר זרימה למינרית יחד עם I-PVP (יוד polyvinylpyrrolidone), thiosulphate נתרן תמיסת מלח סטרילית PBS (פוספט מלוחים למאגר).
- אפשר הרקמות עינית ופתרונות להגיע לטמפרטורת החדר הרגיל כפי שהם נשמרים במקררים ב 4 ° C. למנוע הופעה חוזרת של ההתחממות / קירור מחזורים. לשמור את המכסים של פתרון ואת צנצנות עין עם הצד הפנימי כלפי מעלה ליד צנצנות של כל אחד מהם.
- הסר gauzes וספוגים מצנצנת את העין באמצעות מלקחיים סטריליות. לטבול את כדור הארץ ב 0.5% סטרילי I-PVP 2 דקות כדי לטהר את גלובס עיניים. מניחים את שני מלקחיים על מכסה מגש סטרילי, מחוץ לשדה סטרילית. מעבירים את כדור הארץ thiosulphate% 0.1 סודיום דקה 1 באמצעות זוג נוסף של מלקחיים סטריליות. באמצעות מלקחיים אותם, להעביר את כדור הארץ כדי בקבוק המכיל תמיסת מלח סטרילית (PBS) ולהשאיר אותה עד שזה מופעל. חזור על אותו תהליך של העולם עיניים והשני לאהוא תורם אותו.
- עבודה מתחת למכסה המנוע אוויר למינרית זרימה, עוטפים את כדור הארץ בעזרת גזה סטרילית (תחבושות) עוזב את הקרנית וכ 5 בלובן העין מ"מ מהקרנית חשף. הנורה העין יכול להתקיים רק ביד שמירה על לחץ מספיק. רקמת צריך להישמר לחה במהלך הניתוח כולו.
- מלקחיים המשמשים יחד עם מספריים כדי להסיר את כל שרידי הסופי של הלחמית. לשמור את המכשירים המשמשים לניתוח מעל נפרד ממכשירים אחרים. השתמש בלהב סכין המנתחים לבצע חתך scleral של 3-4 מ"מ מאזור לימבוס, ואז להרחיב את החתך של ° 360, הימנעות לחדור אל הרקמה uveal הבסיסית או לגרום לכל עיוות של עקמומיות הרגיל של הקרנית. חותכים ארבעה חתכים גדולים עוזבים ארבעה פערים קטנים הימנעות הפרשת הגוף הזגוגי. כל ארבעת הפערים נחתכים להבטיח שום הסרה של רקמה אחרת.
- נוכחות של פלאק scleral קטנים עשויים לעכב את החיתוך, כדי לוודא complete כריתה scleral במספריים microsurgery. פעולה זו יש לבצע מבלי לפגוע בגוף, דמית העין הרשתית הזגוגית.
- בדוק את החתך, כדי להבטיח שהיא תושלם. אם החתך שבוצעה כהלכה corneo-scleral שומרת השפה אל הגופים ריסי רק בשלב בתכתובת עם הקרנית.
- הגדר את העולם עיניים עטופה ליד מרכז שדה סטרילי. להשלים את הסרת הקרנית באמצעות מלקחיים להחזיק את שפת scleral נייח יד המשמש כריתה למשוך את ריסי הגוף דמית העין כלפי מטה, הרחק כפתור corneo-scleral.
- להפריד בעדינות את כל הידבקויות הנותרים מלחצן corneo-scleral. לא למשוך את שפת corneo-scleral בצורה שעלולה לגרום בין הקרנית המתח ולא לאפשר לו לרדת חזרה למטה, אל החדר הקדמי.
- צפיפות תא האנדותל של הקרנית נבדק באמצעות פתרון hypotonic ואת התמותה התא נבדק באמצעות Trypכתמים כחולים דקות סביב 1 והתאים נספרים מכן תחת מיקרוסקופ אופטי כפי שהיא נמדדת על תאים / מ"מ 2. החדר הקדמי צריך להתמודד עם המכסה האחורי תוך צריך להתמודד עם החלק התחתון של צלחת פטרי. צפיפות תא האנדותל אפשר לסמוך באופן ידני באמצעות רשת ב המטרה בהגדלה 100x. מספר מינימלי התא קיבל להשתלה באיטליה הוא 2200 לתאי אנדותל / 2 מ"מ.
- מעבירים את שפת corneo-scleral באמצעות טופר הקרנית עד בינוני מוכן בעבר אחסון הקרנית נשמר ב RT (בטמפרטורת החדר) כפי שניתן לראות בלוח 3.
- בדוק את החדר האחורי של העדשה גבישי טבעי. אם בלובן העין מוכן, להסיר את כל שאריות של ענביה והומור הזגוגית מן העולם. לגולל בזהירות ולחזור קטע האחורי שנותר כדי צנצנת העין שלו בהתאמה, תוך שימוש בטכניקה האספטי. לחזור על התהליך עבור העולם השנייה באמצעות מכשירים חדשים. תקן שנינות הקרניתH טופר הקרנית ולשמר תחת אמצעי אחסון (תרבות איבר) בשעה 31 ° C. הקרנית נכרת, כפי שמוצג באיור 1 א ', לאחר מכן ניתן להשתמש עבור keratoplasty או מחקר.
- השליכו חומרים מיותרים ביו מסוכנים פסולת לתוך פחי אשפה המתאימים. לנקות את שטח עבודה אחת את העבודה הושלמה באמצעות 70% ספריי אלכוהול איזופרופיל.
- אם לאחר 28 יום הקרנית שומרת על כל הפרמטרים ההערכה [כגון מורפולוגיה, ספירת תאים, שקיפות, עובי בדיקות מיקרוביולוגיה - חיידקים פטריות באמצעות מכשיר Bactec 9240 (בקטון דיקינסון, מילאנו, איטליה)], הוא יכול להיות מועבר אל בתי החולים באמצעות המדיום התחבורה מוצגים בלוח 4. הקרנית יש להסיר והניח מ אחסון להובלת בינוני מתחת לארון זרימה למינרית האוויר.
- כתוצאה, במהלך האחסון, הקרנית מקבלת עבה יותר בגודל הרגיל הנדרש להשתלה, הבנקים עיניים להשתמש דה נפיחות סוכני להפחית עובי. אנו6% משתמשים dextran T500 כדי לקבל את הקרנית חזרה לגודל הרגיל שלו במדיום התחבורה. אם כי 4-8% dextran T500 יכול לשמש, 6% שימש הטוב ביותר עבורנו. זה מקל על המנתחים להשתיל קרנית ברגע שהם מקבלים את זה.
2. הוצאת הקרביים של הרשתית מן גלוב Ocular לאחר מבתקת הקרנית
- לאחר כריתה, הקרנית נבחרה להשתלה או מחקר מבוסס על המורפולוגיה שלה צפיפות התאים האנדותל ממוקם אחסון או בינוני שימור על 31 ° C. הנותרים של כדור העין מעובד מכן לשימוש נוסף כגון בידוד בלובן העין לצורך ניתוח, הרשתית למחקר וכו '
- לפני כריתה ברשתית, לוודא כי העולם עינית שלם ורק הקרנית עם החלק של בלובן העין מוסר. אם הגוף הזגוגי דביקות הוא מפריש החוצה הוא הופך להיות קשה להסיר רקמת הרשתית.
- אם התורם הוא מתחת גיל 65, בלובן העין הואנשמר תחת PBS סטרילי לצורך ניתוח לאחר בדיקה סרולוגית. במקרה זה, בלובן העין לא לחתוך, רק את הגוף הזגוגי יוסר בלובן העין כולה נשמר.
- עבור כריתה ברשתית, להתחיל לחתוך חתך קטן או מהצד של הקרנית בלובן העין נעה לכיוון עצב הראייה באמצעות מלקחיים סטריליות ומספריים. להחזיק חלק בלובן העין באמצעות מלקחיים ולחתוך עם מספריים ישר כלפי עצב הראייה חיתוך בין השאר על ידי הימנעות חלק נזק הגוף הזגוגי.
- לוחות כורוידאלית יש להפריד בלובן העין כפי שהם תקועים יחד. חותכים את בלובן העין כולה לחשוף את הרקמה דמית העין. לאחר בלובן העין נחתך לגמרי, להפריד בלובן העין עם הנותרים של הגוף הזגוגי על ידי חיתוך זה ליד עצב הראייה. כדור שלם של הגוף הזגוגי מכוסה דמית העין יהיה גלוי כפי שמוצג באיור 2 א.
- באמצעות שני מלקחיים סטריליות להסיר את השכבה דמית העין בעדינות על ידי מרים אותו עם 1זוג מלקחיים והסרה אותו עם האחר. לחלופין, שכבה דמית העין ניתן להסיר באמצעות מספריים אך רצוי להימנע מכיוון שהוא עלול לגרום נזקים ברשתית. להסיר את השכבה דמית העין באופן חלקי ופצע אותו כדי להקל על ההסרה.
- ברגע שכבה דמית העין מוסר, שכבה שקופה של הרשתית שנראה בבירור כפי שמוצג באיור 2 ב. שכבה דמית העין יש קרום ברוך הפנים אשר יכול גם להסיר אך קשה לזהות אותה בעין בלתי מזוינת.
- כמו כן, משתמשים בשני מלקחיים כדי להסיר את שכבת הרשתית כפי שמוצג באיור 2 ג. קל לבודד כמות גבוהה של הרשתית אם נכרת ליד עצב הראייה. כל השכבות של העין ניתן לראות כעת כפי שמוצג באיור 2.
- לאחר רקמת הרשתית הוסר, הוא יכול לשמש למטרות שונות, ולכן הצעדים הבאים ותנאים המשמשים לשימור עשויה להיות שונה בהתאם. למשל,רקמת הרשתית ניתן להציב צינורות המכילים RNA ייצוב חומרים כימיים (כמו RNAlater) או בולם תמוגה (להפקת RNA או DNA), dispase / טריפסין (עבור בידוד של תאים), פתרונות תיקון (לפני להטביע הרקמות פרפין או אוקטובר על אימונוהיסטוכימיה).
- לנקות את כל שטח עבודה ולנקות את האזור באמצעות ספריי 70% אלכוהול איזופרופיל.
3. נציג תוצאות
שפת corneo-scleral כפי שניתן לראות באיור 1 א הוא הקרנית נכרת כראוי עם הסכום הנדרש של שפת scleral ומורפולוגיה האנדותל, זה סוג של הקרנית משמש בדרך כלל עבור keratoplasty חודר. אם stroma הקדמי של הקרנית נכרת פגום עם נוכחות של אטימות, הקרנית יכול לשמש keratoplasty האנדותל / keratoplasty lamellar האחורי (האנדותל עם חלק stroma). לעומת זאת, אם שכבת האנדותל ניזוק או אם צפיפות תא האנדותל הוא <2200 תאים / מ"מ 2 (הואעליאן רגילה), הקרנית יכול לשמש keratoplasty lamellar הקדמי (אפיתל עם החלק הקדמי של stroma). אם ספירת תא האנדותל הוא פחות הנדרש, הקרנית יכול לשמש keratoplasty lamellar מחקר הקדמי או בעוד, אם הקרנית ניזוקה לחלוטין, יכול לשמש למחקר, כפי שמוצג באיור 1 ב, 3 ב ו 3 ג או מושלך. הנזק יכול להיות הגורם טיפולו הכושל רקמות, ניתוחי קטרקט לפני המובילים צלקות אנדותל סטרומה או descemet, פיתוח של פגיעה פיזית וכו 'במהלך חייו של החולה לכן, יהיה צורך לבדוק כל רקמה עם מנורת סדק ולאחר מכן תחת מיקרוסקופ אופטי צלקות עדינים / קפלים / ופלוגות. הקרנית נשמרת בדרך כלל תחת שני תנאים שונים כגון תרבות איבר (כ -31 ° C) משמש בדרך כלל במדינות אירופה או תנאים היפותרמיה (כ 4 ° C) משמש בדרך כלל בארצות הברית. אנו משתמשים בתרבות איבר כמו זה עוזר לחדש את הסכרבתאי אפיתל בגיל, כדי לבדוק מחדש להחיות תא האנדותל עם הזמן שלאחר מות, תקופת אחסון של 4 שבועות אשר נותן חלון מספיק לתכנון ניתוח, נותן מספיק זמן לבדיקות מיקרוביולוגיות (חיידקים פטריות) ו סרולוגית וכו הקרנית ניתן לשמר גם במדיום התחבורה למשך 7 ימים.
בלובן העין אפשר לחתוך חלק אחר חלק להבטיח הסרה עדינה של כל לוחות כורוידאלית. נוזל זגוגי יכול להפריש כאשר עצב הראייה, דמית העין או ברשתית נחתך בחדות כפי שמוצג באיור 4. הרשתיות אם הכרותות לניתוח RNA צריך להישמר RNAlater ברגע רקמות נכרת. בדרך כלל 1x1 ס"מ דמית העין שכבת הרשתית הוא נכרת ואחרי שמירה על אותה ב RNAlater במשך 24 שעות ב 4 ° C נשמר תחת -80 עד ° C ב טריים צינורות Eppendorf (בטוח נעילת צינורות, 2 מ"ל), או להשתמש המצורף יבש קרח. רקמת הרשתית יש נכרת באמצעות שני מלקחיים ליד עצב הראייה מן איריסאו שולי ריסי כדי למנוע זיהום פיגמנט עם מבנים אחרים יש להעביר למיכל שמירה מיד RNA נעשה לא יציב בעת אחזור הרשתית.
תרשים 1 השוואה בין טוב הקרנית באיכות ירודה.) הקרנית נכרת כראוי. כך הקרנית נשמרת בדרך כלל למשך 4 שבועות תחת התרבות איברים. מיקרוביולוגית (באמצעות מכשיר Bactec 9240) ו מורפולוגי (מכתים את התאים עם trypan כחול לקביעת המוות התא התבוננות תאים תחת מיקרוסקופ אופטי עם הגדלה 100x) בדיקה מתבצעת לפני העברת אותו לבית החולים (איור 3 א) ב) הקרנית מכופף , אשר מוביל בסופו של דבר דחיית השתל בשל קפלי descemet העליון של התא גבוהה נזק האנדותל לבחון באמצעות מיקרוסקופ מנורת סדק. כך הקרנית משמש בדרך כלל מילearch או נמחק.
איור 2. שיטת להבטיח כריתה מדויקת של רקמת הרשתית.) הביתור בלובן העין מן העולם עיניים באמצעות להב 24 מ"מ עם 95 מ"מ מעוגלת או מספריים הקצה הקהה סטריליים ו 100 11X2 מ"מ הנשלט על ידי מלקחיים שיניים 0.70 מ"מ סטריליים. בלובן העין יש לצמצם על ידי החזקת צד אחד עם מלקחיים את חיתוך ישר לכיוון עצב הראייה באמצעות מספריים. שכבה דמית העין עכשיו יהיה לראות בקלות, ב) באמצעות שני 100 11X2 מ"מ הנשלט על ידי השיניים 0.70 מ"מ מלקחיים סטריליות, דמית העין מוסר, והרסנו אותו לגזרים, אשר חושף את השכבה הבסיסית רשתית שקוף, ג) ברשתית שכבת שקוף הוא נכרת בזהירות ליד עצב הראייה ללא הפרשת נוזל הזגוגית באמצעות מלקחיים אותם. שני מלקחיים את צריכה להחזיק בכל צד של הרשתית רקמה יש להסיר בעדינות ומתחילהגר ליד עצב הראייה נע לכיוון הקרנית, כדי לקבל כמות טובה של רקמת הרשתית. רקמת ניתן לחתוך בגדלים שונים המשמשים בניסויים ניתוח, ד) שכבות שונות של העין לאחר הסרת הקרנית ניתן לראות בנתון זה. הגוף דמית העין יוסר בעקבות לראשונה על ידי הרשתית מבלי לפגוע בחלקים אחרים של העין.
איור 3. השוואה בין סוגים שונים של צפיפות התאים ומורפולוגיה הנצפים בהגדלה 100x של מיקרוסקופ אופטי.) תא טוב צפיפות האנדותל (> 2200 תאים / מ"מ 2) ומורפולוגיה (פולימורפיזם פחות, ניוון נמוכה, ללא ניוון ו 0% תמותה) ב הקרנית אשר מתאים להשתלה, ב) התא המסכן צפיפות האנדותל (כ 1200 - 1400 תאים / מ"מ 2) ומורפולוגיה (פולימורפיזם גבוהה מאוד degeneration של תאים) עם 30-40% בתמותה הכוללת כ נצפות לאחר צביעה בכחול trypan, ג) חלק לתאי אנדותל ניזוקו עקב ניתוק של גיליון אנדותל תוך אחזור הקרנית מן העולם עינית. זה אושר על ידי התבוננות התמותה של התאים צבעונית באזור על ידי trypan כחול; ד) קפלים של descemet נוצרות בשל טיפולו הכושל של הקרנית על ידי כיפוף, יצירת מתח הקרנית צלב, תוך שימוש בכלים מאוד וכו 'בזמן של כריתה. האיור מציג את קפלי עבים רפואיות המפותחות שנמצאו בין הפריפריה לאזור הראייה של הקרנית.
באיור 4. נזקי דמית העין ורקמות רשתית תוך מבתקת הקרנית מוביל בסופו של דבר הפרשה של נוזל זגוגי. הרשתית מקבלת מעורב הגוף הזגוגי ולכן קשה בלו רקמה באיכות טובה Without זיהום.
טבלה 1. סיכום של מגוון של פעילויות המבוצעות באמצעות גלובס עינית אדם במהלך 2009 ו -2010 ב Fondazione Bancà דגלי Occhi (ונציה, איטליה). כ -60% רקמות שימשו להשתלה, ובכך להשאיר מספר גבוה של גלובס עינית (סביב 40%) למחקר המדעי והרפואי.
משלים באיור 1. אנטומיה של העין האנושית 5. בחלקים שונים של העין האנושית מצוינים בנתון זה, נהג לעקוב אחר המיקום המדויק של הרקמות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שניהם, כריתה נכונה ושמירה נכונה של רקמות הקרנית הרשתית הם קריטיים כמו פגמים קלים כגון נזק האנדותל או מספר גבוה של קפלים של descemet יכול להוביל לכישלון השתל של הקרנית ואילו שינויים בטמפרטורה או טיפולו הכושל יכול להתפשר על שלמות רקמות הרשתית. מטרת מאמר זה היא להראות כיצד רקמות הקרנית ברשתית יכול להיות מבודד באופן אופטימלי, ללא גרימת נזקים או שינויים, אשר עלול לסכן את השימוש בהם להשתלה או למטרות מחקר. המינימום הנדרש תא צפיפות (<2200 תאים / מ"מ 2), מורפולוגיה טובה ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין ניגוד עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה בחלקה באמצעות מענקים של ונטו Regione (Ricerca Sanitaria Finalizzata n.292/2008 ו Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009). המחברים מודים לד"ר ג Griffoni עבור הנתונים 2009/2010 סיכום על השימוש גלובס עיניים אנושיות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
חומרים כריתה של הקרנית ואת הרשתית.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תאור המוצר | מידות | החברה / המוסד | |
| שמרו הפנויה אזמל | Blade בגודל 15 | סוואן, מורטון | |
| תחבושות סטריליות | 5 ס"מ על 5 ס"מ, 8 שכבות, 5 יח' | Artsana | |
| מגבת סטרילית רפואי חד פעמי | 35 X 50 ס"מ | U.Jet | |
| עקרות מספריים | להבים 24 מ"מ / אורכו הכולל. 95 מ"מ מעוגלת, בוטה | e.janach | |
| סטרילית מלקחיים | נירוסטה -100 מ"מ 11 X 2 הנשלט על ידי השיניים 0.70 מ"מ | e.janach | |
| טופר הקרנית - מכשיר רפואי חד פעמי | NIIOS (Hippocratech) | ||
| ההכנות | |||
| PBS | 100 מ"ל PBS [10x] ב 900 (מים מזוקקים) מ"ל ד / ל | Sigma-Aldrich | |
| Na-thiosulphate | 1 גרם Na-thiosulphate ב 1 ליטר של PBS [1x] | Sigma-Aldrich | |
| I-PVP | 5 גרם I-PvP ב 1 ליטר ד / ל | Sigma-Aldrich |
טבלה 2. הטבלה מתארת את החומרים המשמשים כריתה של הקרנית ואת הרשתית לבין החברה הם מתקבלים.
חומרים עבור אמצעי אחסון (2000 מ"ל).
| רכיבי | ספק | מספר קטלוגי | ריכוז | כמות |
|---|---|---|---|---|
| MEM(1X) נוזלי | Invitrogen | 32360-034 | 1900 מ"ל | |
| נתרן פירובט | Invitrogen | 11360-039 | 1 מ"מ (10 מ"ל / ל ') | 20 מ"ל |
| L-גלוטמין | Invitrogen | 25030-032 | 2 מ"מ (10 מ"ל / ל ') | 20 מ"ל |
| אנטיביוטיקה / antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955-20ML | 10 מ"ל / ליטר | 20 מ"ל |
| סובך של יילוד בסרום | Invitrogen | 26010-74 | 2% (20 מ"ל / ל ') | 40 מ"ל |
לוח 3. חומרים בינוני האחסון.
הכנת אמצעי אחסון
להוסיף את כל החומרים באמצעות ריכוזים ספציפיים שניתנו לעיל בצנצנת ומערבבים היטב. לסנן אותםבאמצעות גודל הנקבוביות של 0.2 מיקרון המסנן (Millipore, מילאנו, איטליה) עם עזרה של המשאבה peristaltic. לשמר את המדיום בבקבוקים ב RT.
חומרים בינוני הובלה (2000 מ"ל).
| רכיבי | ספק | מספר קטלוגי | ריכוז | כמות |
|---|---|---|---|---|
| MEM (1X) נוזלי | Invitrogen | 32360-034 | 1800 מ"ל | |
| נתרן פירובט | Invitrogen | 11360-039 | 1 מ"מ (10 מ"ל / ל ') | 20ml |
| L-גלוטמין | Invitrogen | 25030-032 | 2 מ"מ (10 מ"ל / ל ') | 20ml |
| סובך של יילוד בסרום | Invitrogen | 26010-74 | 2% (20 מ"ל / ל ') | 40 מ"ל |
| Dextran T500 | Pharmacosmos | 551005004007 | 6% (60 גרם / ליטר) | 120 גר '/ ל |
לוח 4. חומר בינוני התחבורה.
הכנת אמצעי התחבורה
הוסף dextran 6% ב 1.5 ליטר ~ של MEM ולהשאיר אותה בן לילה. מוסיפים את יתר החומרים בכלי התקשורת ולסנן באמצעות 0.2 מיקרון המסנן (Millipore, מילאנו, איטליה) באמצעות משאבת ואקום. לשמר את המדיום בבקבוקים ב RT.
מקורות
- Fay, A. Diseases of the visual system. Cecil Medicine. Goldman, L., Ausiello, D. , 23rd ed, Saunders Elsevier. Philadelphia, Pa. (2007).
- Parekh, M., Megaw, R., Ray-Chaudhuri, A., Ahmad, S. Patents in Limbal Stem Cell Biology. Recent patents on Regenerative Medicine. 1, 207-212 (2011).
- Pharm, U. S. The Eye: The physiology of human perception. Britannica educational publishing. 36, 19-27 (2011).
- Lang, G. Ophthalmology: A pocket textbook atlas. , 2nd Edition, 115-117 Forthcoming.
- Liesbeth, P. els Organ Culture: The method of choice for preservation of human donor corneas. Br. J. Ophthalmol. 81, 523-525 (1997).
- Meyer, J. S., Howden, S. E., Wallace, K. A., Verhoeven, A. D., Wright, L. S., Capowski, E. E., Pinilla, I., Martin, J. M., Tian, S., Stewart, R., Pattnaik, B., Thomson, J., Gamm, D. M. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. , (2011).
- Trifunovic, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 2330-2336 (2008).
- Mora, P., Montanini, L., Ferrari, S. Retina. 30, 1555(2010).
- Claybon, A., Bishop, A. J. R. Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (48), e2563(2011).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses. J. Vis. Exp. (50), e2795(2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה