העיתון מתאר שיטה פשוטה כדי הקרנית בלו וכדי להוציא את העקר רקמות רשתית העין מן העולם של תורמים גווייה אדם. הטכניקה המתוארת כאן יעזור ובלו רקמות באיכות טובה כדי לשמש להשתלה, למטרות מחקר או ניתוח מבלי לפגוע ברקמות אחרות של הגלובוס העין.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אנוקלציה (Enucleation) היא התהליך של הוצאת גלגל העין מתורם גופה תוך השארת שאר חלקי גלגל העין ללא הפרעה. כריתה (Excision) מתייחסת להוצאת רקמות עיניות, ובמיוחד הקרנייה, על ידי חיתוכה והפרדתה מגלגל העין. אוויסקרציה (Evisceration) היא התהליך של הסרת האיברים הפנימיים, המתייחסים כאן לרשתית. גלגל העין מורכב מהקרנייה, הלובנה (Sclera), הגוף הזגוגית, העדשה, הקשתית, הרשתית, הכורואיד, שרירים וכדומה (תוספת איור 1). כאשר מטופל סובל מנזק לקרנייה, יש להסיר את הקרנייה ולהשתיל קרנייה בריאה באמצעות ניתוחי קרנייה (keratoplastic surgeries). הפרעות גנטיות או פגמים בתפקוד הרשתית עלולים לפגוע בראייה. ניתן להשתמש בגלגלי עיניים אנושיים להליכים כירורגיים שונים, כגון בנק עיניים, השתלת קרנייה או לובנה אנושית ומחקר של רקמות עיניות. עם זאת, קיים מידע מועט על כריתת קרנייה ורשתית אנושית, ככל הנראה בשל הנגישות המוגבלת לרקמות אנושיות. מרבית המחקרים המתארים הליכים דומים בוצעו במודלים של בעלי חיים. מדעים נסמכים על זמינותן של רקמות עיניות שחולקו כהלכה ונשמרו היטב כדי להרחיב את הידע על התפתחות העין האנושית, ההומאוסטזיס ותפקודה. מכיוון שאנו מקבלים כמות גדולה של גלגלי עיניים, שמרביתם (כ-40%, טבלה 1) משמשים למטרות מחקר, אנו מסוגלים לבצע מספר רב של ניסויים ברקמות אלו, ולהגדיר טכניקות לכריתתן ולשימורן באופן קבוע.
הקרנית היא רקמה חסרת כלי דם המאפשרת את העברת האור אל הרשתית, ולצורך כך עליה לשמור תמיד על דרגה טובה של שקיפות. בתוך הקרנית, אזור הלימבוס, המהווה מאגר של תאי גזע, מסייע לשחזור תאי אפיתל ומגביל את גדילת היתר של הלחמית כדי לשמור על שקיפות ובהירות הקרנית. הגודל והעובי של הקרנית הם קריטיים לראייה צלולה, שכן שינויים בכל אחד מהם עלולים להוביל לראייה מטושטשת ולא ברורה. הקרנית מורכבת מ-5 שכבות: א) אפיתליום, ב) שכבת בומן (Bowman's layer), ג) סטרומה, ד) קרום דסמט (Descemet's membrane) ו-ה) אנדותליום. כל השכבות חייבות לתפקד כראוי כדי להבטיח ראייה צלולה4,5,6. הכורויה היא השכבה הביניים שבין הלובן לרשתית, הגבולה מפנים על ידי קרום ברוך (Bruch's membrane), והיא האחראית על זרימת הדם בעין. הכורויה מסייעת גם בוויסות הטמפרטורה ומספקת הזנה לשכבות החיצוניות של הרשתית5,6. הרשתית היא שכבת רקמה עצבית המכסה את החלק האחורי של גלגל העין (נספח איור 1) והיא מורכבת משני חלקים: חלק פוטו-רצפטיבי וחלק שאינו רצפטיבי. הרשתית מסייעת בקליטת האור מהקרנית ומהעדשה וממירה אותו לאנרגיה כימית המועברת בסופו של דבר למוח בעזרת העצב האופטי5,6.
מטרתו של מאמר זה היא לספק פרוטוקול לדיסקציה של רקמות קרנית ורשתית מגלובוסים עיניים אנושיים. מניעת זיהום צולב עם רקמות סמוכות ושמירה על שלמות ה-RNA הן בעלות חשיבות מכרעת, שכן רקמות אלו חיוניות למטרות מחקר השואפות ל-(i) אפיון הטרנסקריפטום של רקמות העין, (ii) בידוד תאי גזע עבור פרויקטים של רפואה רגנרטיבית, ו-(iii) הערכת הבדלים היסטולוגיים בין רקמות מנבדקים בריאים/חולים. במאמר זה אנו מתארים את הטכניקה שבה אנו משתמשים כיום להסרת הקרנית, הכורואיד ורקמות הרשתית מגלובוס עין. להלן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לדיסקציה של גלובוס העין האנושי ולהוצאת רקמות הקרנית והרשתית. הסרטון המצורף יעזור לחוקרים ללמוד טכניקה מתאימה להשגת רקמות אנושיות יקרות שקשה למצוא באופן שוטף.
פרוטוקול
1. כריתת באתרו של הקרנית מן גלובס העינים
- הפעל את ארון האוויר זרימה למינרית כ 15 דקות לפני השימוש. לנקות את מכסה המנוע באמצעות זרימה למינרית איזופרופיל אלכוהול 70%. ללבוש ביגוד מגן אישי, כגון שווי המסכה כירורגית. לשפשף את הידיים והאמות ומייבשים בעזרת מגבת סטרילית. ללבוש כפפות סטריליות ועל שמלת שרוולים או באמצעות טכניקה מזוהם.
- הגדר את השדה הסטרילי על ידי הצבת מכשיר מגש סטרילי בסביבה נקייה מחיידקים. לוודא כי המכשירים הם סטריליים. פתח את חבילת כלי סטרילי להפוך למגרש סטרילי לה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שניהם, כריתה נכונה ושמירה נכונה של רקמות הקרנית הרשתית הם קריטיים כמו פגמים קלים כגון נזק האנדותל או מספר גבוה של קפלים של descemet יכול להוביל לכישלון השתל של הקרנית ואילו שינויים בטמפרטורה או טיפולו הכושל יכול להתפשר על שלמות רקמות הרשתית. מטרת מאמר זה היא להראות כיצד רקמות הקרנית ברשתית יכול להיות מבודד באופן אופטימלי, ללא גרימת נזקים או שינויים, אשר עלול לסכן את השימוש בהם להשתלה או למטרות מחקר. המינימום הנדרש תא צפיפות (<2200 תאים / מ"מ 2), מורפולוגיה טובה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין ניגוד עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה בחלקה באמצעות מענקים של ונטו Regione (Ricerca Sanitaria Finalizzata n.292/2008 ו Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009). המחברים מודים לד"ר ג Griffoni עבור הנתונים 2009/2010 סיכום על השימוש גלובס עיניים אנושיות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
חומרים כריתה של הקרנית ואת הרשתית.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תאור המוצר | מידות | החברה / המוסד | |
| שמרו הפנויה אזמל | Blade בגודל 15 | סוואן, מורטון | |
| תחבושות סטריליות | 5 ס"מ על 5 ס"מ, 8 שכבות, 5 יח' | Artsana | |
| מגבת סטרילית רפואי חד פעמי | 35 X 50 ס"מ | U.Jet | |
| עקרות מספריים | להבים 24 מ"מ / אורכו הכולל. 95 מ"מ מעוגלת, בוטה | e.janach | |
| סטרילית מלקחיים | נירוסטה -100 מ"מ 11 X 2 הנשלט על ידי השיניים 0.70 מ"מ | e.janach | |
| טופר הקרנית - מכשיר רפואי חד פעמי | NIIOS (Hippocratech) | ||
| ההכנות | |||
| PBS | 100 מ"ל PBS [10x] ב 900 (מים מזוקקים) מ"ל ד / ל | Sigma-Aldrich | |
| Na-thiosulphate | 1 גרם Na-thiosulphate ב 1 ליטר של PBS [1x] | Sigma-Aldrich | |
| I-PVP | 5 גרם I-PvP ב 1 ליטר ד / ל | Sigma-Aldrich |
טבלה 2. הטבלה מתארת את החומרים המשמשים כריתה של הקרנית ואת הרשתית לבין החברה הם מתקבלים.
חומרים עבור אמצעי אחסון (2000 מ"ל).
| רכיבי | ספק | מספר קטלוגי | ריכוז | כמות |
|---|---|---|---|---|
| MEM(1X) נוזלי | Invitrogen | 32360-034 | 1900 מ"ל | |
| נתרן פירובט | Invitrogen | 11360-039 | 1 מ"מ (10 מ"ל / ל ') | 20 מ"ל |
| L-גלוטמין | Invitrogen | 25030-032 | 2 מ"מ (10 מ"ל / ל ') | 20 מ"ל |
| אנטיביוטיקה / antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955-20ML | 10 מ"ל / ליטר | 20 מ"ל |
| סובך של יילוד בסרום | Invitrogen | 26010-74 | 2% (20 מ"ל / ל ') | 40 מ"ל |
לוח 3. חומרים בינוני האחסון.
הכנת אמצעי אחסון
להוסיף את כל החומרים באמצעות ריכוזים ספציפיים שניתנו לעיל בצנצנת ומערבבים היטב. לסנן אותםבאמצעות גודל הנקבוביות של 0.2 מיקרון המסנן (Millipore, מילאנו, איטליה) עם עזרה של המשאבה peristaltic. לשמר את המדיום בבקבוקים ב RT.
חומרים בינוני הובלה (2000 מ"ל).
| רכיבי | ספק | מספר קטלוגי | ריכוז | כמות |
|---|---|---|---|---|
| MEM (1X) נוזלי | Invitrogen | 32360-034 | 1800 מ"ל | |
| נתרן פירובט | Invitrogen | 11360-039 | 1 מ"מ (10 מ"ל / ל ') | 20ml |
| L-גלוטמין | Invitrogen | 25030-032 | 2 מ"מ (10 מ"ל / ל ') | 20ml |
| סובך של יילוד בסרום | Invitrogen | 26010-74 | 2% (20 מ"ל / ל ') | 40 מ"ל |
| Dextran T500 | Pharmacosmos | 551005004007 | 6% (60 גרם / ליטר) | 120 גר '/ ל |
לוח 4. חומר בינוני התחבורה.
הכנת אמצעי התחבורה
הוסף dextran 6% ב 1.5 ליטר ~ של MEM ולהשאיר אותה בן לילה. מוסיפים את יתר החומרים בכלי התקשורת ולסנן באמצעות 0.2 מיקרון המסנן (Millipore, מילאנו, איטליה) באמצעות משאבת ואקום. לשמר את המדיום בבקבוקים ב RT.
מקורות
- Fay, A. Diseases of the visual system. Cecil Medicine. Goldman, L., Ausiello, D. , 23rd ed, Saunders Elsevier. Philadelphia, Pa. (2007).
- Parekh, M., Megaw, R., Ray-Chaudhuri, A., Ahmad, S. Patents in Limbal Stem Cell Biology. Recent patents on Regenerative Medicine. 1, 207-212 (2011).
- Pharm, U. S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
