אנו מתארים את שיטת פרוטוקול ניתוח GC מבוסס על אצטט נגזרים aldonitrile של גלוקוזאמין וחומצה muramic שחולצו מן הקרקע. עבור הבהרה של מנגנון כימי, יש לנו גם להציג את האסטרטגיה כדי לאשר את המבנה של נגזרת ואת שברי יון שנוצרו על יינון אלקטרונים.
מאמר שיטה
אנו מתארים את שיטת פרוטוקול ניתוח GC מבוסס על אצטט נגזרים aldonitrile של גלוקוזאמין וחומצה muramic שחולצו מן הקרקע. עבור הבהרה של מנגנון כימי, יש לנו גם להציג את האסטרטגיה כדי לאשר את המבנה של נגזרת ואת שברי יון שנוצרו על יינון אלקטרונים.
גישות כמותית מיקרואורגניזמים המאפיינים הם בעלי חשיבות קריטית להבנה רחבה יותר של מצב תפקוד מיקרוביאלי ובתוך מערכות אקולוגיות. האסטרטגיות הקיימות כיום עבור ניתוח חיידקים כוללים הן מסורתיות תרבות תלויי מעבדה טכניקות אלה המבוססים על מיצוי ישיר וקביעת סמנים מסוימים 1, 2. מעטים בקרב מגוון של מינים של חיידקים המאכלסים אדמה יכול להיות מתורבת, כך תלויי תרבות שיטות להציג הטיות משמעותיות, מגבלה נעדר בניתוח סמן ביולוגי.
חומצה גלוקוזאמין, mannosamine, galactosamine ו muramic כבר שימש גם אמצעי של החיים וגם המוני חיידקים מתים, חומצה גלוקוזאמין (הנפוץ ביותר) ו muramic אלה (ייחודי של תא החיידק) הם המרכיבים החשובים ביותר במערכות אדמה 3 , 4. עם זאת, חוסר ידע על ניתוח מגביל פופולריזציה רחב בקרב בני גילם מדעיים. בין כל exiהעוקץ שיטות אנליטיות, derivatization כדי aldononitrile acetates ואחריו ניתוח GC מבוסס התפתחה אפשרות טובה מבחינת איזון אופטימלי דיוק, רגישות, פשטות, ההפרדה chromatographic טובה, יציבות על אחסון מדגם 5.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לניתוח אמין ופשוט יחסית של גלוקוזאמין וחומצה muramic מהקרקע לאחר ההמרה שלהם acetates aldononitrile. פרוטוקול בעיקר כוללת ארבעה שלבים: חומצה העיכול, טיהור המדגם, derivatization ונחישות GC. הליך צעד אחר צעד הוא שונה על פי פרסומים בעבר 6, 7. בנוסף, אנו מציגים אסטרטגיה מבנית לאמת את יון המולקולרי של נגזרת ושברים יון שלה נוצר על יינון אלקטרונים. אנחנו מוחלים GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS ו ריאגנטים שכותרתו isotopically כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של אצטט aldononitrile גלוקוזאמין derivatized ו מורחומצה amic, היינו שינוי המסה של איזוטופ, שכותרתו נגזרים בספקטרום יון לחקור שברי יון של כל אחד נגזרים 8. בנוסף להבהרה תיאורטית, אימות של יון המולקולרי של נגזרת ושברים יון שלה יהיה שימושי לחוקרים באמצעות δ 13 C או שברי יון של סמנים אלה במחקרים biogeochemical 9, 10.
1. לדוגמא הכנת והפקת חומצה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הציג GC מבוססת השיטה לניתוח אצטט חומצה aldononitrile גלוקוזאמין muramic derivatized מספק שיטה מהירה יחסית לכמת אלה אמינו, סוכרים המופקים אדמה. הנגזרים הם יציבים מבחינה כימית, וכן ניתן לקבוע בניתוח אחד. השיטה אינה מצטמצמת אך דגימות קרקע, והוא יכול להיות פשוט יותר עבור דגימות של מטריקס אי - אדמה.
משאבת ואקום להשתמש בשיטה זו בנויה להיות עמידים לחומצה. בנוסף, אנו מציעים להקים מלכודת בסיס כדי להגן על משאבות כאשר מתאדי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
אין לנו מה למסור.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים DOE הימות הגדולות Bioenergy מרכז המחקר (DOE BER משרד המדע DE-FC02-07ER64494). אנו מודים לד"ר Xudong זאנג חברי הקבוצה שלו לדיונים טכניים מועילות והערות שלא יסולא בפז על השלמת פרוטוקול.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | |
| Muramic חומצה | Sigma-Aldrich | M2503-25mg | |
| D-(+), גלוקוזאמין הידרוכלוריד | Sigma-Aldrich | G1514-100 גרם | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500 גרם | |
| מיו, אינוסיטול | פישר סיינטיפיק | A307003G025 | |
| מתנול (יבש) | Acros אורגניים | AC326950010 | |
| 4-dimethylamino-פירידין | Acros אורגניים | AC148270050 | |
| אתיל אצטט | VWR הבינלאומי | BJGC100-4 | |
| Hydroxlamine hydrochloride | פישר סיינטיפיק | H330-100 | |
| פירידין | פישר סיינטיפיק | P368-500 | |
| אצטית אנהידריד | פישר סיינטיפיק | A10-100 | |
| Dichloromethane (מתילן כלוריד) | פישר סיינטיפיק | D37-500 | |
| הקסאן | פישר סיינטיפיק | H303-4 | |
| חומצה הידרוכלורית (6M) | פישר סיינטיפיק | S456-4 | |
| Hydroxylamine hydrochloride -15 N | הסמל שירותי | IN5280 | |
| אצטית -2 אנהידריד H (D 6 C 4 O 3) | Acros אורגניים | AC174670050 | |
| D-glucose-U -13 C | קיימברידג' איזוטופ במעבדה | CLM-1396-1 | |
| אמוניום sufate -15 N | קיימברידג' איזוטופ במעבדה | NLM-713-1 | |
| שם הציוד | חברה | סוג | |
| Rapid-VAP | LabConco | 790002 | |
| Vacum משאבת | KNF נויברגר | D-79112 | |
| הידרוליזה הבקבוק | פישר סיינטיפיק | 06 423A | |
| Derivatization microvial | פישר סיינטיפיק | 06-100E | |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 | |
| טרשת נפוצה | Hewlett-Packard | 5972 | |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent | 1200 Agilent מערכת סדרת HPLC מצמידים את LC Agilent / MSD-TOF |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה