בידוד של oligomers PRP המסיס ובלתי מסיס במוח האנושי הרגיל

סיכום

זן חדש של חלבון פריון תאי (PRP ^C) לאחרונה זוהה במוחות האנושיים נגועים באמצעות שיטות שתוארו כאן. שיטות אלה יכולים לשמש לבודד מיני PRP שונים, וחלק מהם שימושי גם בבידוד אגרגטים חלבון misfolded אחרים ממוחות אנושיים.

תקציר

האירוע המרכזי בפתוגנזה של מחלות Prion כרוך המרה של חלבון הפריון התאי PRP ^C מארח בקידוד לפתוגניים איזופורם PRP ^{1 Sc.} PRP ^C היא מסיסה בחומרי ניקוי ורגיש לproteinase K (קי)-עיכול, ואילו PRP ^Sc יוצר אגרגטים חומרי ניקוי מסיסים ובחלקה עמידה לקי ^2-6. המרה של PRP ^C כדי PRP ^Sc ידוע כרוכה מעבר קונפורמציה של סליל α למבני β מאזניות של החלבון. עם זאת, במסלול vivo הוא עדיין ממעטים להבין. אנדוגני PRP ^Sc מהוסס, * ביניים PRP או "פריונים שקטים", טרם זוהה במוח הנגוע ^7.

באמצעות שילוב של גישות biophysical וביוכימיים, זיהו אגרגטים ^C מסיסים PRP (המיועד iPrP ^C) ממוח יונקים נגועים ותרבית עצביתתאים ^{8, 9.} כאן, אנו מתארים את תהליכים מפורטים של שיטות אלה, כוללים ultracentrifugation במאגר חומרי ניקוי, שקיעה הדרגתית צעד סוכרוז, כרומטוגרפיה הדרת גודל, העשרת iPrP ב 5 חלבון הגן (g5p) כי דווקא להיקשר לצורות מבניות שינו PRP ¹⁰ ו-PK טיפול. שילוב של גישות אלה מבודד לא רק PRP PRP אגרגטים ^C oligomers ^C המסיס PRP מהמוח האנושי הרגיל ^Sc המסיס וגם. מאז את הפרוטוקולים מתוארים כאן שמשו לבודד שני PRP ^Sc ממוחות נגועים וiPrP ^C ממוחה נגוע, הם מספקים לנו הזדמנות להשוות הבדלים בתכונות physicochemical, רעילות עצבית, וinfectivity בין שני isoforms. מחקר כזה ישפר מאוד את ההבנה של פתוגנים חלבוניים זיהומיות שלנו. הפיסיולוגיה ופתופיזיולוגיה של iPrP ^C אינם ברורים כרגע. יש לציין, שבזה עתה idמחלות פריונים אנושיות entified כינו variably פרוטאז הרגיש prionopathy, מצא PRP ^Sc חדש שהוא בעל ההתנהגות ופיצול immunoreactive עם iPrP ^{11 ג, 12.} יתר על כן, לאחרונה הראה כי iPrP ^C היא המינים העיקריים המקיימים אינטראקציה עם חלבון עמילואיד-β באלצהיימר ^13. באותו המחקר, שיטות אלה שמשו לבודד אגרגטים וoligomers Abeta במחלת אלצהיימר ^13, המצביע על היישום שלהם לאגרגטים חלבון אינם פריונים המעורבים בהפרעות ניווניות אחרות.

פרוטוקול

1. הכנת Homogenate המוח ושברים מסיסים דטרגנט-(S2) ובלתי מסיסים (P2)

1. קח 100 מ"ג רקמה קפוא מוח אנושית ולהוסיף חיץ תמוגה 100 μl (10 mM טריס, 150 mM NaCl, 0.5% Nonidet P-40 (NP-40), 0.5% EDTA, 7.4 pH).
2. הומוגני זה על קרח באמצעות עלי מונע על ידי מנוע אלחוטי, להקפיא אותו בקרח יבש למשך 5 דקות והומוגני שוב באמצעות עלי מונע על ידי ידות ראשונות ולאחר מכן על ידי מנוע, ולהוסיף 300 μl או בולם תמוגה 800 μl (זה או הוא או 20 Homogenate% או 10% מסך מוח, בהתאמה).
3. צנטריפוגה homogenate מוח הסך 20% או 10% ב1000 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף supernatant (S1) באמצעות צנטריפוגות benchtop.
4. Ultracentrifuge S1 10% בגובה 35,000 סל"ד (100,000 XG) בSW55 הרוטור (Beckman Coulter, פולרטון, קליפורניה) לשעה 1 ב 4 ° C. העבר את supernatants (S2) המכיל חומר ניקוי שבריר המסיס לתוך צינור נקי. Resuspend את הכדורים המכילים חומר ניקוי מסיסשבריר (P2) ב 100 או μl μl חיץ 200 תמוגה לבצע 10 - או הכנה מרוכזת 5-קיפול.
5. לPK-עיכול, דגירת המדגם באותן כמויות של קי ב 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עבור שני שברי S2 ו P2. הוסף פלואוריד phenylmethylsulfonyl בריכוז הסופי של 5 מ"מ ונפחים שווים של חיץ מדגם SDS (3% SDS, EDTA 2 מ"מ, 4% β-mercaptoethanol, גליצרול 10%, 50 mM טריס, 6.8 pH) כדי לסיים את עיכול PK. מרתיח את הדגימות למשך 10 דקות ולקרר אותם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הם מוכנים למערב סופג.

2. שקיעה במהירות Gradients השלב סוכרוז

1. דגירת 450 S1 μl 20% עם נפח שווה של 2% בsarkosyl H ₂ O למשך 30 דקות על קרח.
2. הוסף 0.5 מ"ל כל אחד 60%, 30%, 25%, 20%, 15%, ו 10% סוכרוז לתוך צינור קמן עם קיבולת מקסימלי מ"ל 5.
3. טען 0.4 מ"ל של S1 על גבי החלק העליון של גרדיאנטים צעד סוכרוז 10-60%.
4. צנטריפוגה ב 48000 סל"ד (200,000 XG, SW55 הרוטור) לשעה 1, בשעת 4 ° C.
5. איסוף שבריר μl 283 מכל חלק עליון של הצינור ולקבל 12 שברים בסך הכל.
6. קח 20 μl של כל חלק לצינור אפנדורף חדש, להוסיף 20 חיץ μl מדגם, ומרתיח במשך 10 דקות.
7. דוגמאות מגניבות ל4 דקות במכסת מנוע, צנטריפוגה XG ב 1000 דקות 1 ולמערבולת אותם. טען דגימות על הג'ל טרומי.

3. גודל הרחקת כרומטוגרפיה

1. השתמש 200 חרוזי HR Superdex (Pharmacia, אופסלה, שבדיה) בעמודת 1 סנטימטר x 30 כדי לקבוע את מצב oligomeric של מולקולות PRP.
2. שבעה סמנים מולקולריים המוניים (Sigma, סנט לואיס, מישיגן) כולל dextran כחול (2000 KDA), thyroglobulin (669 KDA), apoferritin (443 KDA), β-עמילז (200 KDA), האלכוהול דהידרוגנז (150 KDA), אלבומין ( 66 KDA), ופחמתית anhydrase (29 KDA) נטענים באופן עצמאי בריכוזים המומלצים על ידי סיגמא ב200 כרכי מדגם μl.
3. נפח elution של הכחול dextרן משמש כדי לקבוע את נפח החלל (V ₀ = 8.45 מ"ל) ונפח הכולל (V _t = 24 מ"ל) מספק הדרכת המוצר. כרכי elution השיא (V _ה) מחושבים מהכרומתוגרמה וretentions החלקי. K _av, מקדם המחיצה (הגדרת התנהגות מדגם), מחושב באמצעות משוואה: K _av = (V _דואר - V ₀₎ / (V _t - V _0). עקומת הכיול נקבעה על ידי זומם K _av של סטנדרטי החלבון נגד MW היומן של הסטנדרטים ^8.
4. המשקל המולקולרי (MW) של המינים השונים PRP התאוששו בשברי FPLC שונים נבחן על פי עקומת כיול שנוצרה עם סינון ג'ל של תקנים שונים.
5. להזריק 200 S1 μl במאגר המכיל תמוגה sarkosyl 1% לעמודה עבור כל טווח.
6. כרומטוגרפיה מתבצעת במערכת FPLC (GE Healthcare) בקצב זרימה של 0.25 מ"ל / דקה ושברירשל של 0.25 מ"ל כל אחת נאסף באמצעות אספן שבריר (Amersham Biosciences, RediFrac).
7. דגירת 0.125 מ"ל כל שבריר של 0.5 מתנול מראש מצונן מ"ל ב -20 ° C עבור 2 שעות.
8. צנטריפוגה דגימות ב13000 XG למשך 30 דקות ב 4 ° C בmicrocentrifuge benchtop. בטל supernatant ו resuspend הגלולה במאגר 20 μl SDS מדגם כאמור לעיל, רותח במשך 10 דקות, מצנן לטמפרטורת חדר, מניח אותם על ג'ל טרומי.

4. לכידה של PRP ידי g5p

1. מולקולת g5p (100 מיקרוגרם) (סופק באדיבות על ידי בני זוג. ג'ף ניל וג'ון McGeehan מאוניברסיטת פורטסמות', אנגליה) היא מצומדת ל7 x 10 ⁸ tosyl הופעל חרוזים מגנטיים ידי דוגר g5p מיקרוגרם 100 ו 350 חרוזי g5p μl ב1 מ"ל פוספט שנאגר מלוח (PBS) על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות. למשוך g5p חרוזים לsidewall של צינורות Eppendorf בכוח מגנטי חיצוני והסר את כל הפתרון. שטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של PBS המכיל0.1% בסרום השור אלבומין (BSA) לשלוש פעמים.
2. דגירת חרוזי g5p-מצומדות ב1 מ"ל של 0.2 מ 'טריס-HCl, 7.4 pH המכיל BSA% 0.1 על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות כדי לחסום מחייב אינם ספציפי ולאחר מכן לשטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של PBS המכיל BSA 0.1% ל שלוש פעמים כאמורות לעיל. הסר את הפתרון ולהוסיף 1 מ"ל של PBS לחרוזים. חרוזי g5p המוכנים הם יציבים במשך לפחות 3 חודשים ב 4 ° C.
3. לכידתו של PRP ידי g5p מבוצעת על ידי דוגר 100 שברי S1 μl או P2 עם 60 חרוזי μl g5p מצומדות (10 מיקרוגרם חלבון / 6 X 10 ⁷ חרוזים) ב1 מ"ל של חיץ מחייב (-NP Tween-20, 3% 3% 40 ב PBS, 7.5 pH).
4. לאחר הדגרה עם רוטציה קבועה 3 שעות בטמפרטורת חדר, חרוזי g5p PRP המכילים נמשכים לsidewall של צינורות Eppendorf בכוח מגנטי חיצוני, המאפשרים הסרה קלה של כל המולקולות לא הכרוכות בפתרון.
5. לאחר שלוש כביסות בחיץ לשטוף (2% Tween-20 ו 2% NP-40 ב PBS, 7 pH0.5), חרוזי g5p נאספים ומחוממים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בחיץ מדגם SDS (3% SDS, 2 המ"מ EDTA, גליצרול 10%, 50 mM טריס-HCl, pH 6.8).
6. לאחר קירור דגימות למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, את דגימות centrifuged ב1000 XG למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. את supernatants מוכן למערב סופג.

5. מערבי הסופג

1. דגימות טענו הורתחו בחיץ מדגם SDS על 15% ג'ל טריס-HCl הקריטריון הטרומי (Bio-Rad) ב 150 V עבור ~ 80 דקות.
2. חלבונים על ג'ל מועברים לPVDF עבור 2 שעות ב70V.
3. לאחר חסימת קרומים בחלב 5% בטריס-נאגר מלוח המכיל 0.01% Tween-20 (TBS-T), את הקרומים מודגרת עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר עם 3F4 חד שבטי או polyclonal העיקרי נוגדנים (1:40,000), 1E4 (1 : 1000), אנטי-N ⁸ (1:6,000), או אנטי C ⁸ (1:6,000) לחיטוט מולקולת PRP.
4. לאחר דגירה עם כבשים אנטי עכבר IgG HRP-מצומדת ב1:3000, או חמור נגד ארנב IgG ב1:3,000 להקות PRP הם דמיינו על סרט קודאק באמצעות ECL בנוסף, בהתאם לפרוטוקול של היצרן.

6. נציג תוצאות

בהשוואה לדגימות CJD ספורדיות, כמות קטנה של iPrP ^C התגלתה בשבריר P2 במוח נורמלי אם כי רוב PRP ^C ששוחזר בשבריר S2 (איור 1). כפי שצוינו בעבר ^8, חשבונות iPrP כ 5-25% מPRP הסך כולל באורך מלא ומינים קטומים N-סופנים.

ניתוחים באמצעות שקיעה הדרגתית צעד סוכרוז גילו כי בעוד רוב PRP ^C מהמוחה הלא CJD היה התאושש בשברים 1-3 העליונים, כמויות קטנות של PRP גם זוהו בשברי 9-11 התחתונים כי בדרך כלל מכילים אגרגטים גדולים ⁸ (איור 2).

מגוון מיני PRP ^Sc צלצלing ממונומרים, oligomers הקטן למצרפים גדולים יותר הייתי מבודד על ידי סינון ג'ל במוח עם קרויצפלד יקוב-מחלה (איור 3 א). עם זאת, כמות קטנה של אגרגטים גדולים יותר עם ​​משקל מולקולרי גבוה יותר מ -2,000 kDa הייתה גם להבחין בשברים מסיסים של מוח הנורמלי (האיור 3C). יתר על כן, הדימרים וtetramers של PRP ^C לא אותרו רק בשברים מסיסים אלא גם בשברים מסיסים (האיור 3B ו3C).

לאחר טיפול PK וPNGase, PRP נתפס על ידי g5p זוהה עם הנוגדנים נגד 1E4 PrP97-105 ^8. שלושה שברי הליבה קי עמידים כינו PRP * ^20, PRP * ^19, וPRP * ⁷ התגלו, נודדים ב~ 20 ~ 19, kDa KDA ו~ 7 KDA, בהתאמה (תרשים 4, לוח שמאלי). עם זאת, לא זוהה PRP כאשר הנוגדן 1E4 היה מראש מודגרות-עם הפפטיד סינטטי שיש לו זיהוי רצףiCal לepitope 1E4 (איור 4, באמצע פנל), מצביע על כך שלהקות זוהו על ידי 1E4 הן שברי PRP. יתר על כן, הנוגדן אנטי C התגלה שני שברי PRP שונים נודדים ב~ 18 kDa (PRP * ¹⁸⁾ ו~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), בנוסף לPRP * ²⁰ (תרשים 4, לוח ימני).

איור 1. איתור של iPrP ^C ו iPrP ^Sc. לאחר הטיפול בF PNGase ב1 / 10 של הנפח הכולל תגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי להסיר glycans מהחלבון, באורך מלא או N-סופנים מקוצצים מיני PRP בשברים המסיסים ובלתי מסיסים (S2 ו-P2) המבודד על ידי ultracentrifugation בדגימות מוח משליטה רגילה (CTL) וCJD הסדיר (sCJD) זוהה עם 3F4 נגד PrP106-112 (פנל שמאלי), אנטי-N נגד PrP23-40 (באמצע לוח), ואנטי-C נגד PRP220-231 (לוח ימני). בדגימות CTL, כמות קטנה של PRP הוא זוהה בP2, ואילו כמות גדולה נמצאת בS2. לעומת זאת, יותר PRP הוא זוהה בP2 מאשר בS2 בדגימות sCJD.

איור 2. שקיעה של PRP בשיפועי צעד סוכרוז. PRP בשברים בודדים מ1 עד 11 מתוך מדגם S1 המוח הלא CJD זוהה על ידי מערב סופג עם 3F4. למרות שרוב PRP ^C התגלה בשברי 1-3 עליונים, כמויות קטנות של PRP גם נצפו בשברים תחתונים 9-11. יתר על כן, דפוס הפסים של PRP מחלק העליון ותחתון שונה: PRP התאושש בשברים העליונים יש רצועה עליונה דומיננטית בעוד PRP התאושש בשברים התחתונים יש רצועה תחתונה דומיננטית. קי התייחס-PRP ^Sc נטען כשליטה בצד ימין של כתם.

איור 3. איתור של oligomers המסיס ולא המסיס PRP ^{C. C} מסיס ולא מסיס PRP ממוחות האנושיים בריאים הופרדו על ידי ultracentrifugation ולאחר מכן נתון לסינון ג'ל, בהתאמה. הגדלים המולקולריים של שברים בודדים נמדדו על ידי הפעלת קבוצה של סמני מסה מולקולריות. () מיני PRP ^Sc מדגימות המוח sCJD. שתי אוכלוסיות של מיני PRP התגלו: שברי ג'ל סינון 49-65 מכילים מונומרים וoligomers קל, ואילו שברים 27-33 מכילים אגרגטים גדולים. מיני PRP ^C משבריר מסיס (S2) (ב) וחלק קטן מסיס (P2) (ג) לביקורת רגילה אותרו. PRP היה גשש בנוגדן 3F4. הדימרים (חלק 55) וtetramers (חלק 51) של PRP התגלו לא רק בP2 אלא גם בS2 של sampl המוח הנורמליes (B ו-C). אגרגטים גדולים התגלו רק בP2 של דגימות רגילות (C).

איור 4. איתור של שברי iPrP קי עמידים שונים בהכנות g5p מועשרים ממוחות האנושיים בריאים. דוגמאות מועשרות על ידי g5p טופלו PK וF PNGase לפני סופג מערבי חיטוט עם 1E4 (פנל שמאלי), 1E4 מודגרות מראש עם הפפטיד סינטטי שהיה רצף זהה ל1E4 epitope (באמצע לוח), ואנטי C ( לוח ימני). 1E4 זוהו 3 ברים PRP קי עמידים כינו PRP * ^20, PRP * ^19, וPRP * ⁷ (פנל שמאלי). לאחר החסימה של 1E4 במקטעים, לא ^מיל PRP אותר (פנל באמצע), מצביע על כך שהלהקות שזוהו עם 1E4 הן שברי PRP. Anti-C התגלה שני שברים PRP קי עמידים בנוסף כינו PRP * ¹⁸ וPRP-CTF12 /13, בנוסף ל* PRP ^20.

דיון

שילוב של גישות דיווח כאן מבודד אגרגטים עקביות מסיסים PRP ^C וoligomers המסיס PRP ^C מהמוח האנושי הרגיל. Ultracentrifugation ב100.000 XG במשך שעה אחת הוא שיטה קלסית שכבר בשימוש נרחב להפרדת PRP ^Sc המסיס מPRP ^C המסיס ^14. אמנם זה יעיל, אחד הוא מזהיר כדי למנוע זיהום במהלך מושך את supernatant (S2) לאחר צנטריפוגה. מכיוון שהפרופיל של ג'ל iPrP ^C הוא שונה מזו של PRP ^C, אין זה סביר שPRP זוהה בשבריר P2 נובע מזיהום ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
פלואוריד Phenylmethylsulfonyl	סיגמה אולדריץ	P7626	72 מ"מ ב2-propanol
Proteinase K	סיגמה אולדריץ	P2308	2 מ"ג / מ"ל בH 2 O
PNGase F	ניו אינגלנד Biolabs	MWGF200
Ultracentrifuge LE-80k, SW55 הרוטור	Beckman Coulter	חלק מס '365668, 356860
Superdex 200 חרוזי HR	GE Healthcare	17-1088-01
תקטע FPLC מערכת	GE Healthcare	18-1900-26
סמני משקל מולקולריים	סיגמה אולדריץ	MWGF200	מגוון
Dynabeads M-280 חרוזים מגנטיים	Invitrogen	143-01
נוגדן 3F4	Covance	SIG-39600
נוגדן 1E4	מדעי התא	M1840
ג'ל המוכן 15% טריס-HCl ג'לי טרומי	Bio-Rad	345-0020