מאמר שיטה

מדידת תא בודדה של שחרור דופמין במתח-clamp וAmperometry סימולטני

DOI:

10.3791/3798

⸱

21 בנובמבר 2012

 ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Florida , 2Department of Psychiatry, University of Florida

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת amperometric מודדת שחרור דופאמין מתא בודד על ידי גילוי נוכחי חמצונים המיוצרים על ידי חמצון דופמין ספונטני. מהדק המתח סימולטני ומתודולוגיה amperometry לחשוף את מערכת היחסים בין מכניסטית "הפעילות" הכוללת של טרנספורטר דופאמין ותפקיד הרגולציה של פעילות זו על ההובלה ההפוכה של דופמין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר השחרור ל, דופמין המרווח הסינפטי מפעיל תכונות הביולוגיות שלו דרך יעדיה לפני ואחרי-הסינפטי 1. אות דופמין הוא הופסק על ידי דיפוזיה 2-3, אנזימים תאיים 4, ומובילים בממברנה 5. טרנספורטר דופאמין, הממוקם בחריץ שperi-הסינפטית של הנוירונים דופאמין מנקה את האמינים ישוחררו באמצעות שטף דופמין פנימה (ספיגה). טרנספורטר דופאמין יכול לעבוד גם בכיוון הפוך כדי לשחרר אמינים מבפנים החוצה בתהליך שנקרא תחבורה או זרימה של דופמין 5 כלפי חוץ. . יותר מ 20 שנים לפני זולצר et al דיווח טרנספורטר דופאמין יכול לפעול בשני מצבי פעילות: קדימה (ספיגה) והפוך (זרימה) 5. הנוירוטרנסמיטר משתחרר דרך הזרימה דרך טרנספורטר יכול להזיז כמות גדולה של דופמין למרחב החוץ התאי, והוכח לשחק תפקיד מרכזי בויסות דופמין h התאיomeostasis 6. כאן אנו מתארים כיצד מהדק תיקון זמני והקלטת amperometry יכולים לשמש למדידת דופמין שוחרר באמצעות מנגנון הזרימה עם רזולוצית זמן האלפית השנייה, כאשר פוטנציאל הממברנה נשלט. לשם כך, בהווה ובאותות חמצונים כל תאים (amperometric) נמדדים בו זמנית באמצעות מגבר 200B Axopatch (התקנים מולקולריים, עם סט נמוך לעבור Bessel מסנן ב1000 הרץ להקלטה נוכחית כל תאים). לamperometry הקלטת האלקטרודה סיבי פחמן מחובר למגבר שני (Axopatch 200B) וממוקמת בסמוך לממברנת הפלזמה ונערכה ב700 mV. הזרמים כל התא וחמצונים (amperometric) ניתן להקליט ויחסים נוכחי מתח יכולים להיות שנוצרו באמצעות פרוטוקול צעד מתח. בניגוד לכיול amperometric הרגיל, שדורש המרה לריכוז, הנוכחי הוא דיווח ישירות ללא התחשבות בנפח 7 היעילים. לפיכך, את הנתונים המתקבלמייצג גבול תחתון לזרימת דופאמין כי חלק המשדר הפסיד לפתרון התפזורת.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ציוד ואספקה

  1. הר כלוב פאראדיי בחלק העליון של טבלת הרטט אנטי (TMI) כדי להקטין את רעש הרקע.
  2. המערכת בו זמנית תיקון מהדק amperometry ההקלטה דורשת מיקרוסקופ הפוך עם אופטיקה DIC מצוין ועדשת מרחק עבודה ארוכה. חבר את המיקרוסקופ מגדלור לסוללה של מכונית. מקור אור זה DC עבור המערכת יהיה עוד יותר להקטין את הרעש החשמלי.
  3. micromanipulators ההידראולי (Siskiyou) רעש ירידה נוסף. בתצורה שלנו, אנו משתמשים בידי מניפולטור זכות להקלטת התא כולו, ונתן לשמאל ampero....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מהדק תיקון משולב עם amperometry יכול למדוד DA זרימת 2A מתח תלוי DAT בתיווך. איור מציג תצורת נציג ניסיוני והקלטה של DA זרימת DAT בתיווך כאשר הסביבה התאית ופוטנציאל הקרום הם הדקו ע"י פיפטה תיקון כל תאים. באמצעות טכניקה זו, תאים לבטא חלבוני YFP-DAT הם מתח הדק עם פיפטה תיקון תא שלמה תוך האלקטרודה amperometric ממוקמת על קרום הפלזמה (איור 2 א). האלקטרודה התא כולו מתמלאת בפתרון פיפטה המכיל 2 המ"מ DA. האלקטרודה amperometric נוגעת קרום הפל.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתח מהדק וamperometry סימולטני מציעים את היתרונות הבאים. כל סוגי התאים נגישים וניתן להשתמש בו להקלטה. זיהוי של תאים או נוירונים בי את ההקלטות נעשות הוא פשוט וברור. בפרט, אם התא מסומן fluorescently ידי הוספת תג ניאון לחלבון של עניין הנסיין יכול לבחור בקלות לתא המטרה או תא העצב. התצורה הניסיונית מאפשרת משלוח אחיד ומבוקר של סוכנים תרופתיים או באמצעות פיפטה התיקון, או על ידי תוספת של חומרים אלה לפתרון האמבטיה 10. טכניקת amperometry מהדק התיקון הזמנית מאפשרת חקירה של התפקיד .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר Sanika Chirwa לסקירה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (DA026947, DA021471, וNS071122).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ציוד
נגד רעידות שולחן w / פאראדיי כלוב טכנית ייצור חברה 63-500 סדרה אנו משתמשים במודל 63-543
הפוך מיקרוסקופ ניקון TE-2000 ניקון הופסק עכשיו אקליפס Ti
שני מגברי רעש נמוכים axopatch 200 מיליארדים התקנים מולקולריים 800-635-5577
203 headstage 1-CV BU התקנים מולקולריים 800-635-5578
1-HL-U בעל פיפטה התקנים מולקולריים 800-635-5579
Digidata 1440A / D ממיר התקנים מולקולריים 800-635-5580
שני Siskyou המניפולטורים, עזבוונתן זכות Siskiyou MX6600R MX6600L 877-313-6418
ליזר פיפטה חולץ סאטר מכשירים P-2000 888-883-0128
האלקטרודה רעש נמוכה סיבי פחם amperometric ProCFE www.dagan.com
רעש הנמוכה קוורץ פיפטה סאטר מכשירים QF100-70-7.5 888-883-0128
סוללה במכונית 12-וולט זמין באופן נרחב
מטען סוללה לרכב זמין באופן נרחב
מגיב
נתרן כלורי (NaCl) סיגמא S7653
HEPES סיגמא H3375
דקסטרוז סיגמא G7528
מגנזיום סולפט (MgSO 4) סיגמא M2643
אשלגן זרח monobasic (KH 2 PO 4) סיגמא P5655
אשלגן כלורי (KCl) סיגמא P9333
dihydrate סידן כלוריד (CaCl 2 • 2H 2 0) סיגמא 223506
hexahydrate מגנזיום כלוריד (MgCl 2 • 6H 2 0) סיגמא M2670
EGTA סיגמא E0396

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
  2. Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DAT

מאמרים קשורים