בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרוטוקול זה מתאר סינון הקרינה המיקרוסקופ מבוסס על שתילים ארבידופסיס ומתאר כיצד למפות מוטציות רצסיבי אשר משנים את חלוקת subcellular של סמן מסוים ניאון מתויג במסלול הפרשה. ארבידופסיס הוא מודל ביולוגי רב עוצמה למחקרים גנטיים בגלל גודל הגנום שלו, זמן דור, ושימור של המנגנונים המולקולריים בין הממלכות. מערך genotyping כגישה למפות מוטציה חלופה לשיטה המסורתית המבוססת על סמנים מולקולריים יש יתרון משום שהוא הוא יחסית מהיר יותר עשוי לאפשר מיפוי של מוטציות מספר פרק זמן קצר מאוד. שיטה זו מאפשרת זיהוי של חלבונים אשר יכולים להשפיע על שלמות אברון כל בצמחים. הנה, לדוגמה, אנו מציעים מסך לגנים מפת חשובים שלמות של reticulum endoplasmic (ER). הגישה שלנו, לעומת זאת, ניתן להרחיב בקלות אברונים תאים אחרים צמחים(לדוגמה לראות 1,2), ובכך מייצג צעד חשוב לקראת הבנת הבסיס המולקולרי השולט מבנים subcellular אחרים.
פרוטוקול
1. EMS טיפול
זרעים thaliana ארבידופסיס הם mutagenized משתמש כמו sulfonate mutagen אתיל מתאן סוכן (EMS) 3,4, אשר מעוררת את ה-C-ל-T משתנה הגנום וכתוצאה מכך C / G ל T / A מוטציות 5-7.
- שוקל 0.8 גרם זרעי ארבידופסיס (~~~HEAD=NNS 40,000 זרעים) הנושאים את הסמן ניאון אברון (באופן ספציפי, במחקר זה ssGFPHDEL (רצף ה-GFP-HDEL האות tetrapeptide) שימש כסמן ER).
- להעביר את הזרעים צינור פלקון 50 מ"ל, ואז מוסי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן תיארנו ההקרנה confocal מיקרוסקופיה מבוססת על זיהוי של מוטציות endomembrane. גישה זו ניתן להרחיב בקלות אברונים אחרים של התא עבורו סמנים ספציפיים חלבון פלואורסצנטי הזמינים. המסך מבוסס על זיהוי של מוטנטים המציגים התפלגות חריגה של סמן פלואורסצנטי בין אם אברון היעד או אברונים שאינם אמורים להכיל את הסמן. בהתאמה, מוטציות אלה מייצגים אוכלוסיות בו גם את היכולת של אברון כדי subcompartimentalize סמן נפגעת או מוטציות שלא ניתן כראוי translocate את הסמן בין האברונים. במהלך ההקרנה שמנו לב כמ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין לנו מה למסור.
תודות
אנו מכירים תמיכה על ידי למדעי הכימיה, Geosciences ו Biosciences החטיבה, משרד האנרגיה של יסוד מדעי, משרד המדע, משרד האנרגיה של ארה"ב (מספר הפרס DE-FG02-91ER20021) ואת הקרן הלאומית למדע (MCB 0948584) (FB). אנו אסירי תודה על קרן בירד גב לעריכה את כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | |
| Ethylmethane sulfonate | סיגמא | M0880 | |
| NaOH | JT בייקר | 3722-05 | |
| Murashige skoog הבסיס בינוני * פרנסות gamborg ויטמינים | פיטו technolog laboratorie | M404 | |
| Phytagel | סיגמא | P8169-1 ק"ג | |
| ערכת RNeasy מיני | Qiagen | 74104 | |
| הורים צמח טהור עלה DNA ערכת טיהור | Epicentre | MPP92100 | |
| ה-DNA Bioprime תיוג מערכת | Invitrogen | 18094-011 | |
| 200 אלכוהול הוכחה | Decan מעבדות Inc. | 2716 | |
| NaOAc | JT בייקר | ||
| שבב גנטי ארבידופסיס ATH1הגנום מערך | Affymetrix | 900385 | |
| פלקון צינורות 50 מ"ל | קורנינג | 430290 | |
| Eppendorf מבחנות 1.5 מ"ל | |||
| נייר סינון 90 מ"מ | Whatman | 1001090 | |
| אנליטי מאזן | Mettler טולדו AB54-S | נה | |
| Nutating (גל) שאכר | Heidolph polymax 1040 | נה | |
| סרכזת | Eppendorf 5417-R | נה |
מקורות
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
