בזרימת כולסטרול Assay

סיכום

Assay כולסטרול נועדה לכמת את שיעור בזרימת כולסטרול מן התאים בתרבית ואת היכולת של פלזמה acceptors לקבל את הכולסטרול מתאי שוחרר. Assay כולל תיוג תאים עם איזון כולסטרול, הכולסטרול בין בריכות תאיים ושחרור של כולסטרול כדי acceptor תאיים.

תקציר

תוכן כולסטרול בתאי יש לשמור בגבולות צרים מאוד, יותר מדי או מעט מדי כולסטרול בעוד כמה תוצאות תאים שיבוש של ממברנות הסלולר, אפופטוזיס ו נמק ^1. תאים יכולים כולסטרול המקור סינתזה תאיים וממנה ליפופרוטאינים פלזמה, שני מקורות מספיקים כדי לספק את הדרישות באופן מלא של תאים כולסטרול. תהליכים של סינתזה ספיגת כולסטרול מוסדרים בחוזקה ליקויים של כולסטרול הן ² נדיר. כולסטרול מופרזת היא בעיה נפוצה יותר ^3. למעט hepatocytes וכן כמה תאים תואר adrenocortical, התאים אינם יכולים לבזות כולסטרול. לתאים יש שתי אפשרויות להפחתת כולסטרול התוכן שלהם: להמיר כולסטרול לתוך אסטרים cholesteryl, אופציה עם קיבולת מוגבלת כמו עומס יתר התאים עם אסטרים cholesteryl הוא גם רעיל, בזרימת כולסטרול, אפשרות בלתי מוגבלת עם יכולת פוטנציאלית. בזרימת כולסטרול הוא מפרטתהליך ific זה מוסדר על ידי מספר מובילי תאיים, כגון ה-ATP מחייב טרנספורטר קלטת חלבונים A1 (ABCA1) ו - G1 (ABCG1) ו הקולטן נבלות B1 סוג. Acceptor טבעי של כולסטרול בפלסמה הוא ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) אפוליפופרוטאין AI.

Assay בזרימת כולסטרול נועדה לכמת את שיעור בזרימת כולסטרול מן התאים בתרבית. הוא מודד את היכולת של התאים לשמור בזרימת כולסטרול ו / או את היכולת של פלזמה acceptors לקבל את הכולסטרול מתאי שוחרר. Assay מורכב מהשלבים הבאים. שלב 1: תיוג כולסטרול הסלולר באמצעות הוספת כולסטרול שכותרתו עד בינוני סרום המכיל ו דוגרים עם תאים של 24-48 שעות. צעד זה עשוי להיות משולב עם הטעינה של תאים עם כולסטרול. שלב 2: הדגירה של תאים בינוניים סרום ללא כולסטרול כדי לאזן בין כל שכותרתו בריכות כולסטרול תאיים. שלב זה עשוי להיות משולב עם הפעלת הסלולר CHolesterol מובילי. שלב 3: הדגירה של תאים עם acceptor תאי ו quantitation התנועה של כולסטרול שכותרתו מתאי כדי acceptor. אם מבשרי כולסטרול שימשו לתייג כולסטרול מסונתז החדש, שלב 1/4, טיהור של כולסטרול, ייתכן שיהיה צורך.

Assay מספק את הפרטים הבאים: (א) כיצד טיפול מסוים (מוטציה, דפיקה למטה, ביטוי יתר או טיפול) משפיע על היכולת של התא כולסטרול בזרימת ו (ב) עד כמה את היכולת של acceptors פלזמה לקבל את הכולסטרול נגוע במחלה או טיפול. שיטה זו משמשת לעתים קרובות בהקשר של המחקר לב וכלי דם, הפרעות מטבוליות ו ניווניות, מחלות זיהומיות הרבייה.

פרוטוקול

1. הכנת ^[3 H] כולסטרול

1. בשכונה קטר, לוותר על הסכום הנדרש של כולסטרול ^[3 H] לתוך צינור microfuge 1.5 מ"ל (0.5 μCi (19 kBq) לכל גם נדרש assay אופייני).
2. אם ^[3 H]-כולסטרול הוא תלוי טולואן, לייבש אותו לחלוטין עם גז N2 ו resuspend אתנול עם 100% ריכוז סופי של 1 μCi (37 kBq / μl. וורטקס ומערבבים היטב.

2. ציפוי תאים וסימון כולסטרול נייד

פרוטוקול זה נבדק באמצעות סוגי תאים הבאים: ומונוציטים האדם, ^4.5 THP-1 אדם מונוציטים למוצרי ומקרופגים ^6,7,8, גלם 264.7 ומקרופגים Murine ^5,9,10,11, תאים הלה ^12, וריד הטבור האדם אנדותל תאים (HUVEC), BHK-21 תאים ^9, fibroblasts אדם ועכבר ^13,14, HepG2 תאים hepatocarcinoma אדם ¹⁵ ו, בצורה שונה, החל טסיות ^16.

1. Resuspend תאים ולספור אותם. התאים לתוך צלחת של 12 צלחות גם בצפיפות הסופי של 0.2x10 ⁶ תאים בכל טוב בינוני 0.9 מ"ל מלאה. תאים ימשיך לגדול ויגיע 0.8x10 ⁶ תאים לכל גם כאשר הניסוי בזרימת. עבור תאים שאינם מתחלקים, כמו הבדיל THP-1 תאים, צפיפות זריעה צריך להיות 0.8x10 ⁶ תאים לכל טוב. אם באמצעות 6 - או 24 גם צלחות, כפול או חצי את מספר התאים בכל טוב בהתאמה. מספר בארות צריך להיות מספיק קביעות ארבע פעמים עבור כל תנאי הניסוי.
2. אם הבידול של THP-1 התאים נדרשת, להוסיף PMA (הריכוז הסופי 0.1 מיקרוגרם / מ"ל) לתקשורת של 48-72 שעות.
3. הוסף aliquot קטנה של מדיה לתוך צינור המכיל microfuge ^[3 H] כולסטרול.
4. לשטוף את הצדדים של הצינור עם התקשורת לפני הוספת ^[3 H] כולסטרול לתוך aliquot נפרד של אמצעי התקשורת מלאים (100 μl / טוב).
5. הוסף התקשורת המכילים ^[3 H] הכולסטרול על בארות עם תאים (נפח סופי לכל גם הוא 1 מ"ל). אם אין טיפול בתאי נדרש לפני תיוג, תאים ניתן מצופה ב ^[3 H] בינוני כולסטרול המכיל.
6. דגירה התאים למשך 48 שעות בתרבית תאים בחממה (37 ° C, CO 5% _2).

3. איזון דגירה

1. לאחר דגירה 48 שעות, לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ. לוודא שהם בריאים הם במפגש כ 80%.
2. הסר מדיה המכילה ^[3 H] כולסטרול. לשטוף את התאים בעדינות עם PBS. לחזור 3 פעמים כביסה.
3. להכין סרום ללא התקשורת. במידת הצורך, להפעיל את התאים על ידי הוספת אגוניסט LXR (כגון, 901317 ב 1-4 mmol / L) או מחנה (0.3 μMol / L, עבור תאים ממוצא העכבר בלבד) כדי בסרום חופשי בתקשורת.
4. הוסף 500 μl מדיה חופשיים בסרום היטב כל אחד מהם.
5. דגירה של 18 שעות תרבית תאים בחממה (37 ° C, CO 5% _2).

4. בזרימת כולסטרול דגירה

1. לאחר דגירה 18 שעות במדיום סרום חינם, לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ. לוודא שהם בריאים confluent (מינימום 80% confluency).
2. הכן את הפתרון של acceptors בזרימת הכולסטרול בדם ללא בינוני. דוגמאות acceptors כוללים:
   אפוליפופרוטאין AI (apoA-I) (הריכוז הסופי 10 מיקרוגרם / מ"ל)
   ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) (הריכוז הסופי 20 מיקרוגרם / מ"ל)
   Cyclodextrin (הריכוז הסופי 200 מיקרוגרם / מ"ל)
   פלזמה (הריכוז הסופי 1-2%)
3. לשטוף את התאים בעדינות עם PBS.
4. הוסף 250 μl של סרום ללא מדיה עם acceptors היטב כל אחד מהם.
5. לעזוב קבוצה אחת של בארות כדי לקבוע רקע בזרימת (בזרימת התקשורת חופשיים בסרום עם acceptor NO)
6. דגירה תאים עבור 2 שעות תרבית תאים אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2). משך הדגירה בזרימת עשוי לנוע בין 30 דקות ועד 8 שעות לפי הצורך.

5. עיבוד שאmples

1. לאחר 2 שעות הדגירה לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ.
2. איסוף מדיה לתוך צינורות 1.5 מ"ל microfuge. ספין ב -14,000 סל"ד 1-10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר שאריות הסלולר.
3. להעביר Media 100 μl לתוך בקבוקון מ"ל 7 נצנץ. הוסף 5 MLS של Insta-ג'ל פלוס (PerkinElmer) תערובת מערבולת. לאחסן דגימות הנותרים ב 4 ° C.
4. מניחים צלחות במקפיא למשך 30 דקות. הוסף 500 μl DH ₂ O היטב כל אחד מהם. לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ על מנת להבטיח כי כל התאים נוקף מעומק בארות. אם חסיד עדיין, או לעזוב את הצלחות עם DH ₂ O על 4 מעלות צלזיוס בארות לילה או גירוד.
5. לאחר כל התאים לא המריא, פיפטה למעלה ולמטה כדי לפרק את גושי תאים. העברת 100 μl לתוך צלוחיות 7 מ"ל נצנץ. הוסף 5 MLS של Insta-ג'ל פלוס (PerkinElmer) תערובת מערבולת. אחסן את לוחות הנותרים ב 4 ° C.
6. מניחים צלוחיות נצנץ על מונה נצנץ. להגדיר מונה לספור על ^[3 H] בDPM יחידות.

6. ניתוח תוצאות

1. שיעור בזרימת הכולסטרול בא לידי ביטוי בדרך כלל שיעור הכולסטרול עבר התאים acceptor. הנוסחה הבאה נעשה שימוש:

2. בזרימת מסוימת מחושב כהפרש בין בזרימת בנוכחות או העדר acceptor (ריק).

7. ציר הזמן

8. נציג תוצאות

דוגמה לתוצאות של ניסוי בזרימת כולסטרול מוצג איור. 1. בניסוי זה THP-1 מונוציטים אדם היו מובחנים אל מקרופאגים ו בזרימת הכולסטרול acceptors שונים היהנבדק. בזרימת כולסטרול עד בינוני ללא acceptors ("ריק") היה 0.79% ואת ערך זה נחשב בזרימת שאינו ספציפי והיה מפחיתים את הערכים האחרים. בזרימת כולסטרול לאדם apoA-I (הריכוז הסופי 30 מיקרוגרם / מ"ל) היה 4.75%. מדגם פלזמה התייחסות נכלל לתוך הניסוי הזה כדי לפקח בין הניסוי השונות. מדגם התייחסות יכול לשמש נורמליזציה של נתונים על פני מספר רב של ניסויים, אבל מצאנו שנכון לחזור assay אם השונות היא גבוהה. פלזמה החולה (הריכוז הסופי 2%) נבדקה לפני ואחרי החולה קיבל טיפול תרופתי. הוא הגיע למסקנה כי התרופה לחולה הייתה השפעה שלילית על היכולת של פלזמה לתמוך בזרימת כולסטרול.

דוגמה נוספת של תוצאות הניסוי בזרימת מוצג איור. 2. בניסוי זה הגלם 264.7 מקרופאגים הופעלו או לא יופעלו על ידי הדגירה לילה עם אגוניסט LXR TO-901317 (הריכוז הסופי1 μmol / L) בזרימת כולסטרול מדגם זהה של פלסמה אנושית (2%) נבדק. הוא הגיע למסקנה כי הפעלת ביטוי הסלולר של רשת ABC עם מובילי אגוניסט LXR מגביר את היכולת של התאים לשחרר את הכולסטרול acceptor תאיים.

באיור 1. בזרימת כולסטרול מן THP-1 תאים acceptors שונים. אחוז בזרימת כולסטרול (דהיינו, את שיעור הכולסטרול שכותרתו עבר התאים acceptor הוגדר) מוצגת לאחר ניכוי המקרים של ערכים ריקים. ממוצע ± סטיית תקן של קביעות ארבע פעמים, * p <0.05.

איור 2. בזרימת כולסטרול מ 264.7 אחוז מופעל או לא מופעל עם אגוניסט LXR כדי פלזמה האדם. RAW של בזרימת כולסטרול (דהיינו, את שיעור הכולסטרול שכותרתו עבר התאיםacceptor המצוין) מוצגת לאחר ניכוי המקרים של ערכים ריקים. ממוצע ± סטיית תקן של קביעות ארבע פעמים, * p <0.001.

דיון

השיטה המתוארת למדוד בזרימת כולסטרול נועד למדוד את התנועה של כולסטרול מן התאים acceptor כולסטרול תאי. ישנם שיקולים קריטיים מספר בהבנה זו מתודולוגיה.

Labelling ועל איזון

המתודולוגיה המתוארת כולסטרול שכותרתו מתווסף סרום סרום המכיל. למרות שמעולם לא נחקר בהרחבה, ההנחה היא כי כולסטרול הוא משולב בתוך ליפופרוטאינים בדם והם נתפסות על ידי התאים. חשוב לאפשר מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים \ תאים	הלה	THP-1	RAW	HUVEC	BHK-21	HFF
השלם מדיה	RPMI - 10% FCS - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס			M199 - 5% FCS - 1% L-גלוטמין - עט 1% סטרפטוקוקוס HEPES - 2% (1M) - 7% תוספת צמיחה תא האנדותל (ECGS)	DMEM - 10% FCS - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס
חינם מדיה בסרום	RPMI - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס			M199 - 1% L-גלוטמין - עט 1% סטרפטוקוקוס HEPES - 2% (1M) - תא האנדותל 7% לגדולה תוספת (ECGS)	DMEM - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס
מעבר שיטה	1 x טריפסין	השעיה	לגרד	1 x טריפסין
מעבר יחס	3:10	01:03		1:20	01:03	01:03
הפעלת התא (לא חובה)		TO-901317 - LXR-אגוניסט - גמר קונצרט כלשהו. 4 מיקרומטר
אחרים ריאגנטים		phorbol 12-13-myristate אצטט (PMA) - תא התמיינות - גמר קונצרט כלשהו. 0.1μg/ml