Method Article

מדידה של פעילות פקטור V בפלזמה אנושית באמצעות Assay קרישת Microplate

DOI:

10.3791/3822

⸱

September 9th, 2012

 ,  , 
1Applied Bioscience Program, Faculty of Science, University of Ontario Institute of Technology , 2Nursing Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology , 3Medical Laboratory Science Program, Faculty of Health Sciences, University of Ontario Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר assay microplate רומן שמודד את פעילות קרישת FV במהלך היווצרות קריש פיברין בפלזמה אנושית שלא דווח בעבר. השיטה משתמשת בקורא microplate הקינטית ברציפות כדי למדוד את השינוי בספיגה ב405nm במהלך היווצרות קריש פיברין בפלזמה אנושית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתגובה לפציעה, קרישת דם מופעלת ותוצאות בדור של פרוטאז הקרישה, טרומבין. פיברינוגן תרומבין דבק בפיברין אשר מהווה מסיס קריש שעוצר את הדימום. פקטור V (ע"ע) בצורתו הפעילה, FVa, הוא קריטי לcofactor פרוטאז FXa והמאיץ של דור תרומבין במהלך היווצרות קריש הפיברין כחלק מ1 prothrombinase, 2. מבחני FV הידניים תוארו 3, 4, אבל הם גוזלים זמן וסובייקטיבי. מבחנים אוטומטיים FV דווחו 5-7, אך המנתח וריאגנטים יקרים ומספקים בדרך כלל רק זמן הקריש, לא שיעור וההיקף של היווצרות פיברין. פלטפורמת microplate עדיפה למדידת אירועי אנזימים catalyzed בגלל הנוחות, זמן, עלות, נפח קטן, ניטור רציף, ותפוקה גבוהה 8, 9. מבחני microplate דווחו לתמוגה קריש 10, טסיות דם11, וגורמי קרישה 12, אך לא עבור פעילות FV בפלזמה אנושית. מטרת השיטה הייתה לפתח assay microplate שמודד את פעילות FV במהלך היווצרות פיברין בפלזמה אנושית.

שיטת microplate רומן זה מתארת ​​assay פשוט, זול ומהיר של פעילות FV בפלזמה אנושית. Assay מנצל קורא microplate הקינטית ללפקח שינוי בספיגת 405nm במהלך היווצרות פיברין בפלזמה אנושית (איור 1) 13. הבדיקה מדויקת מודדת את הזמן, שיעור ראשוני, ומידה של היווצרות קריש פיברין. זה דורש רק כמויות μl של פלזמה, הושלם ב6 דקות, יש תפוקה גבוהה, הוא רגיש ל24 80pM FV, ומודד את הכמות הופעל שלא במתכוון (פעילות 1-במה) ו( ע"ע פעילות תרומבין הופעל-2-שלב ) כדי לקבל הערכה מלאה של הפעילות הפונקציונלית הכוללת שלה (פעילות 2-במה - פעילות 1-שלב).

intravas הופץcular הקרישה (DIC) היא coagulopathy רכש כי לרוב מתפתח מזיהומים קיימים מראש 14. דסק"ש קשור לפרוגנוזה גרועה ותמותת עליות מעל 15 פתולוגיה קיימת מראש. הבדיקה נעשתה שימוש כדי להראות כי ב9 חולים עם דסק"ש, ע.נ. 1-הבמה, 2-במה, וכלל פעילויות שירד, בממוצע, ב 54%, 44%, ו 42%, בהתאמה, בהשוואה לאדם רגיל נקווה התייחסות הפלזמה (NHP).

Assay microplate FV הוא להתאמה בקלות למדוד את הפעילות של כל גורם קרישה. assay זה יגביר את ההבנה של FV הביוכימיה שלנו באמצעות מדידה מדויקת ומלאה יותר של פעילותה במחקר ובמסגרות קליניות. מידע זה יהיה השפעה חיובית סביבות בריאות באמצעות אבחון ופיתוח טיפולים יעילים יותר להפרעות קרישה, כגון דסק"ש קודם לכן.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת פלזמת אנוש FV הלקוי

  1. שיטה זו היא שינוי של ההליך המתואר במקור על ידי הבלום ואח' 4.
  2. להשיג דם אנושי כולו מהסכמתו מתנדבת בריאה בוגרת (זכר או נקבה, גיל 18-50 שנים) שאינו נוטלים תרופות כלשהן. ללבוש כפפות גומי ומעייל מעבדה לאורך ההליך.
  3. הכן 100 מ"ל של 3.2% (w / v) ציטראט Trisodium במים מזוקקים. טען 6.0 מ"ל של פתרון זה ל60 מיליליטר מזרקים נפרדים. הסר אוויר על ידי בוכנה מדכאת בזהירות לציון 6.0 המ"ל במזרק.
  4. השתמש במטלית אלכוהול לניקוי שטח של וריד cubital בין שריר הזרוע ואמה. חבר מנגנון פרפר מד 20 למזרק 3 מ"ל. הכנס מחט פרפר לוריד cubital ולמשוך בעדינות על בוכנה, עד דם ממלא לסימן 3 המ"ל. השלך מזרק עם דם. צעד זה נעשה כדי להסיר כל גורם רקמות שוחרר מהאנדותל הפגוע במחטאתר פציעה שעלול להפעיל את תהליך הקרישה ולהפריע להכנת הפלזמה FV-לקויה.
  5. חבר מחט פרפר ציטראט מזרק 60 מ"ל "נטען" עם 6.0 המ"ל Trisodium ולמשוך בעדינות את הבוכנה עד שהדם מגיע לסימן 60 המ"ל במזרק. (10.9mM ריכוז ציטראט הסופי).
  6. הסר מחט מזרק מהפרפר ולערבב בעדינות מזרק תוך שמירה על אצבע או אגודל כפפה על שקע המזרק.
  7. המשך לצייר דם לתוך 60 מיליליטר מזרקים כל אחת עמוס עם 6.0 מ"ל של 3.2% ציטראט Trisodium כפי שתואר לעיל. אחד צריך לצפות להתאוששות של 50% כ של נפח הדם citrated כפלזמה לאחר צנטריפוגה וכי 50 μl של פלזמת FV הלקוי נדרש לדגימה בassay microplate. המעבדה שלנו באופן שגרתי מעבדת 300-420 מ"ל של דם citrated בזמן שימוש במזרקים 60 x 5-7 מ"ל כל אחת עם 6.0 מ"ל של 3.2% ציטראט / מזרק Trisodium. זה מספיק פלזמה FV לקויה לכ 3000 מייקרומבחני צלחת (ראו להלן).
  8. הסר מחט פרפר מזרועו של המתנדב ולחץ רפידת גזה סטרילית על אתר של דיקור וריד ל1.0 דק '. כיסוי אתר של דיקור וריד בתחבושת סטרילית.
  9. צנטריפוגה דם citrated ב3300 XG במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. שחזור שכבת פלזמה צהובה העליונה לכוס פלסטיק עם בר ומערבבים באמצעות פיפטה העברת פלסטיק נזהר שלא להפריע את שכבת התא התחתונה האדומה ולבנה בדם.
  10. נפח המדוד של פלזמה במ"ל ולשמור 100 μl של פלזמה לפני בנוסף EDTA על קרח לזמן עתיד פרותרומבין קריש (PT) בדיקות (ראה להלן).
  11. לאט להוסיף EDTA המוצק לפלזמת citrated עם ערבוב עדין בטמפרטורת חדר כדי להשיג 5mm (ריכוז סופי). ברגע EDTA נמס, להתאים pH ל -7.0 ידי בנוסף dropwise של 1.0m NaOH עם ערבוב עדין.
  12. כיסוי כוס בניילון נצמד ודגירה במשך 8-10 שעות בלי לזוז על 37 ° C.
  13. כל 2 שעות, להתאושש 100 μl שלפלזמת EDTA טופל על קרח ולקבוע PT בזמן דגירה עם EDTA והשוותה ל PT של פלזמה לפני בנוסף EDTA (ראה לעיל).
  14. לקביעות PT, מקום 8 רצועות immunomodule גם נשלפות למחזיק פלסטיק תבנית ולהכניס לתוך microplate הקורא.
  15. רצועות אוריינט immunomodule בmicroplate קורא כמו:,, לדוגמה, ריק, ריק, מדגם ריק, ריק, ריקות, וריקות משמאל לימין בבעל התבנית כדי למזער את הפרעות פיזור אור משכנת רצועות מדגם המכיל-. כמו כן, השתמש רק 2-7 בארות מלמעלה עד למטה בכל רצועת immunomodule 8 היטב כדי למזער את הפרעות פיזור אור מקצוות של בעל תבנית פלסטיק.
  16. Assay microplate FV הוא מסוגל למדוד היווצרות הקריש פיברין בלפחות 12 דגימות שונות בו זמנית (6 דגימות לרצועת immunomodule מעל 2 רצועות immunomodule).
  17. באמצעות פיפטה רב, להוסיף 50 μl של HBS (HEPES 20mm, 150mm NaCl, pH 7.4) לכל microplate גם לכל אחת מהמדגם שassayed. באמצעות פיפטה אחת, להוסיף 50 μl של נקוותה התייחסות פלזמה נורמלית האנושית (NHP) או פלזמה לפני תוספת של EDTA או בזמנים שונים דגירה לאחר הוספת EDTA להפריד microplate בארות.
  18. באמצעות פיפטה רב, להוסיף 50 thromboplastin μl (ראה להלן שיטת הכנה) לכל microplate הבארות עם הפלזמה שassayed. הדגירה בmicroplate הקורא ב 25 ° C עבור 1 דקות ותכנית קורא microplate לנער את הצלחת במהלך 15-25 השניות של דגירת דקות 1.
  19. שימוש במחשב interfaced עם microplate הקורא, יישום גישת SoftMax Pro תוכנת microplate. הגדר את הקורא לספיג, אורך גל ל405nm, מצב ל, טמפרטורה הקינטית 25 מעלות צלזיוס, ותכנית קורא microplate ללחוץ למשך 5 שניות, ולקרוא את הספיגה ב405nm כל 5 שניות ל6 דקות.
  20. באמצעות פיפטה רב, להוסיף סידן כלוריד (50 μl של 25mm במים מזוקקים; 2.1mm finaריכוז הליטר) לכל microplate הבארות, לחכות 15 שניות, ולחץ על הסמל "התחל" בתפריט microplate SoftMax Pro כדי להתחיל את מהלך הבדיקה.
  21. קבע PT בפרופילי הספיגה לעומת זמן בSoftMax Pro והזמן כדי להגיע לגידול המקסימאלי 1/2 בספיגה ב405nm (נקודת האמצע של הספיג sigmoidal לעומת עקומת זמן הופק לאחר thromboplastin ובנוסף סידן כלוריד. ראה להלן, איור 1).
  22. חישוב פעילות ע.נ. 1-השלב מהזמן התחבר הקריש (שניות) לעומת הפעילות התחבר FV (יחידות / מ"ל) כפי שמודגם להלן באיור 2A. למטרות quantitation, 1Unit פעילות FV מוגדר כפעילות בהווה 1.0 המ"ל NHP לפני ההפעלה מכוונת עם הוסיף תרומבין (ראה להלן, assaying דגימות פלזמה אנושיות עם ע.נ. 1-השלב ובדיקת קרישת microplate 2-שלב).
  23. הכן 4.0l של HEPES 20mm המכיל 0.15M NaCl במים מזוקקים עם ערבוב עדין. התאם pH ל -7.4 עם dropw האיטיבנוסף ISE של 5.0M NaOH (HBS, pH 7.4).
  24. השג אורך מספיק של צינורות דיאליזה ולשטוף היטב במים מזוקקים. לקשור קשר בקצה אחד של הצינור. העברת EDTA טופל פלזמה לצינורות דיאליזה עם פיפטה העברת פלסטיק, הסר אוויר, ולקשור קשר בקצה השני של הצינור.
  25. זהירות לתלות פלזמת EDTA טופל-בצינורות לרוורד עם ערבוב עדין. מכסים בניילון נצמד ודיאליזה ל14-16h עם ערבוב עדין ב 4 ° C.
  26. מוציא בזהירות את פלזמת EDTA-treated/dialyzed ב3.0 aliquots מ"ל ל -15.0 צינורות הכתירו בורג מ"ל ולשמור 100 μl עבור assay PT של פלזמה 'סופית' FV לקוי על קרח. אחסן פלזמת FV-חסרה ב-80 ° C עד שימוש. בתנאים המתוארים לעיל, גידול PT ב10-15 שניות לפני תוספת EDTA ל8-10 שעות 90-100 שניות אחרי תוספת EDTA. פלזמת FV הלקויה שהוכנה על ידי שיטה זו באופן שגרתי מכילה פחות מ -0.1% מהווה FV הפעיל בהתחלהפלזמה אנושית טריה.

2. הכנת Thromboplastin

  1. דיאליזה נדרשה להסיר כל הסידן ממגיב זה על מנת לאפשר היווצרות קריש דם דווקא עיתוי הפיברין מהמועד בנוסף כלוריד הסידן ליזום תהליך קרישה.
  2. הכן 100 מ"ל ו4.0l של HEPES 20mm ו0.15M NaCl במים מזוקקים בכוס פלסטיק עם ערבוב עדין. התאם pH ל -7.4 עם תוספת dropwise איטית של 5.0M NaOH (HBS, 7.4 pH).
  3. הוסף 6.0 מ"ל של הרוורד, 7.4 pH לכל בקבוקון של ריאגנט thromboplastin, להחליף מכסה, ולנער בעדינות כדי להמס. דגירה מגיבה בבקבוקונים הכתירו במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר לפזר חומר יבש. לנער בעדינות כדי להמס לחלוטין.
  4. חותך אורך מספיק של צינורות דיאליזה, לשטוף היטב במים מזוקקים, ולקשור את קצו האחד של הצינור עם קשר. העברת thromboplastin לצינורות דיאליזה, הסר אוויר, ולקשור את הקצה שני של צינור עם קשר.
  5. Carefully לתלות צינורות דיאליזה ב4.0l של הרוורד, 7.4 pH ומערבבים בעדינות מכוסית בפלסטיק נצמד ב 4 מעלות צלזיוס במשך 14-16 שעות.
  6. העברת aliquots 3.0 מ"ל של thromboplastin הדיאליזה ל15 צינורות מיליליטר בורג כתרים ולאחסן ב -80 ° C עד שימוש.

3. הכנת FV Curves 1-במת microplate קרישת Assay פעילות הרגילה

  1. הפשר פלזמת FV-לקויה, NHP, וthromboplastin על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בעדינות מערבב פלזמת FV-לקויה וthromboplastin באופן עצמאי, להעביר להפריד מגשי פלסטיק כביסה, ולדגור על קרח. אחסן NHP על קרח אחרי בעדינות ערבוב. החנות כלוריד סידן (25mm במים מזוקקים) במגש כביסה נפרד בטמפרטורת חדר.
  2. הכן 200 μl כל אחד מדילולים סידוריים 2-קיפול של NHP מ0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512-לקפל ברוורד, pH 7.4 באמצעות 1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל. מערבולת היטב ולדגור על קרח.
  3. הנח 8 רצועות immunomodule גם נשלפות לעמבעל lastic תבנית ולהכניס לתוך microplate הקורא.
  4. רצועות אוריינט immunomodule בmicroplate קורא כמו:,, לדוגמה, ריק, ריק, מדגם ריק, ריק, ריקות, וריקות משמאל לימין בבעל התבנית כדי למזער את הפרעות פיזור אור משכנת רצועות מדגם המכיל-. כמו כן, השתמש רק 2-7 בארות מלמעלה עד למטה בכל רצועת immunomodule 8 היטב כדי למזער את הפרעות פיזור אור מקצוות של בעל תבנית פלסטיק.
  5. Assay microplate FV הוא מסוגל למדוד היווצרות הקריש פיברין בלפחות 12 דגימות שונות בו זמנית (6 דגימות לרצועת immunomodule מעל 2 רצועות immunomodule).
  6. הפעל microplate קורא ותוכנת גישת SoftMax Pro microplate יישום.
  7. באמצעות פיפטה רב, יערוך בו זמני של פלזמת FV-לקויה (50 μl) לכל מדגם microplate הבארות. השתמש פיפטה אחת, להוסיף 50 μl של 10 דילולים הסידוריים של NHP הוכנו לעיל כדי להפריד microplate בארות.
  8. באמצעות פיפטה רב, להוסיף thromboplastin (50 μl) לכל הבארות לדוגמה. דגירה בקורא microplate ב 25 ° C עבור 1 דקות ותכנית קורא microplate לנער את הצלחת במהלך 15-25 השניות של דגירת דקות 1.
  9. שימוש במחשב interfaced עם microplate הקורא, יישום גישת SoftMax Pro תוכנת microplate. הגדר את הקורא לספיג, אורך גל ל405nm, מצב ל, טמפרטורה הקינטית 25 מעלות צלזיוס, ותכנית קורא microplate ללחוץ לראשונות 5 שניות אחרי תוספת כלוריד הסידן, וספיגה במידת 405nm כל 5 שניות ל6 דקות לאחר מכן. מרווח 5 שניות הרעד אינו כלול בזמני הקריש המחושב (ראה להלן).
  10. באמצעות פיפטה רב, להוסיף סידן כלוריד (50 μl של 25mm במים מזוקקים; ריכוז סופי 3.5 מ"מ) לכל מדגם microplate הבארות, לחכות 15 שניות, לחץ על הסמל "התחל" ביישום microplate בSoftMax Pro ממחשב כדי להתחיל assay.
  11. Tהוא פעמי קריש מחושבים כזמן בשניות להגיע לנקודת האמצע בין הספיגה המינימאלית ומקסימלי ב405nm לאחר thromboplastin ובנוסף סידן כלוריד.
  12. השיעורים הראשונים של היווצרות קריש דם מחושבים כמכפלה של שיעור עלייה בספיגה ב405nm (mUnits / דקות) שיקיף את 5 נקודתי הזמן הראשונה של היווצרות קריש דם בחלק הליניארי של העקומה הספיגה לעומת זמן.
  13. המידה של היווצרות קריש מחושב כהפרש בין הספיגה המקסימלי ומינימאלית ב405nm (יחידות) הושג במהלך אירוע היווצרות קריש הדם.

4. Assaying דגימות פלזמת אנוש עם ע.נ. 1-הבמה וAssay קרישת Microplate 2-שלב

  1. הפשר פלזמת FV-לקויה, NHP, פלזמות לדוגמה, וthromboplastin על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בעדינות מערבב פלזמת FV-לקויה וthromboplastin באופן עצמאי, להעביר להפריד מגשי כביסת ELISA פלסטיק, ולדגור על קרח. אחסן את פלזמות NHP ומדגם על קרחלאחר ערבוב בעדינות. החנות כלוריד סידן (25mm במים מזוקקים) במגש כביסת ELISA נפרד בטמפרטורת חדר.
  2. הכן 200 μl כל אחד מדילולים 40-קיפול של פלזמות NHP ומדגם ברוורד, 7.4 pH 1.5 באמצעות צינורות microcentrifuge מ"ל. מערבולת היטב ולדגור על קרח.
  3. הכנס 8 רצועות immunomodule גם נשלפות לבעל תבנית פלסטיק ולהכניס לתוך microplate הקורא.
  4. רצועות immunomodule, מדגם,,, מדגם חלופי ריק ריק ריק ריק, ריקות, וריקות משמאל לימין בבעל התבנית כדי למזער את הפרעות פיזור אור משכנת רצועות מדגם המכילים. השתמש אך ורק בארות 2-7 מלמעלה עד למטה בכל רצועת immunomodule כדי למזער הפרעות פיזור אור מקצוות של בעל תבנית פלסטיק.
  5. הפעל microplate קורא ותוכנת גישת SoftMax Pro microplate יישום.
  6. באמצעות פיפטה רב, להוסיף פלזמת FV-לקויה (50 μl) לכל מדגם microplate הבארות. שימוש singlדואר פיפטה, להוסיף 50 μl של NHP המדוללת 40-לקפל או פלזמות מדגם הוכנו לעיל כדי להפריד microplate בארות.
  7. באמצעות פיפטה רב, להוסיף thromboplastin (50 μl) לכל הבארות לדוגמה. דגירה בקורא microplate ב 25 ° C עבור 1 דקות ותכנית קורא microplate לנער את הצלחת במהלך 15-25 השניות של דגירת דקות 1.
  8. שימוש במחשב interfaced עם microplate הקורא, יישום גישת SoftMax Pro תוכנת microplate. הגדר את הקורא לספיג, אורך גל ל405nm, מצב ל, טמפרטורה הקינטית 25 מעלות צלזיוס, ותכנית קורא microplate ללחוץ לראשונות 5 שניות אחרי תוספת כלוריד הסידן, וספיגה במידת 405nm כל 5 שניות ל6 דקות לאחר מכן. מרווח 5 שניות הרעד אינו כלול בזמני הקריש המחושב (ראה להלן).
  9. באמצעות פיפטה רב, להוסיף סידן כלוריד (50 μl של 25mm במים מזוקקים; ריכוז סופי 6.25mM) לכל מדגם microplate הבארות ומייד יחסי ציבורESS הסמל "התחל" ביישום microplate בSoftMax Pro ממחשב כדי להתחיל את הבדיקה.
  10. בתום הריצה, לקבוע את הזמן, שיעור ראשוני, והיקף של היווצרות קריש דם לNHP 40-לקפל מדוללת ופלזמות לדוגמה מפרופילי הספיגה לעומת הזמן בSoftMax Pro.
  11. אם ייקח בחשבון את דילול 40-הקיפול, לנצל את זמן קרישה לכל דגימה על מנת לחשב את פעילות FV ביחידות / מ"ל מFV עקומת סטנדרט 1-שלב פעילות של זמן התחבר קריש לעומת פעילות FV יומן (איור 2 א). זה מייצג את פעילות שלב FV-1 או שללא הפעלה 'מכוונת' על ידי תרומבין.
  12. מאז FV מופעל עם תרומבין לcofactor הפעיל, 1 FVa, assay שני לאחר דגירה ובנוסף עם תרומבין הוא קריטי כדי למדוד במדויק את פעילות FV 2-השלב של מדגם פלזמה (עם הפעלה 'מכוונת' על ידי הוסיף תרומבין).
  13. לבדיקת FV 2-הבמה, להכין 200-300 μl מטוהר תרומבין 18לא 100nm ברוורד, 7.4 pH ולדגור על קרח. מתכנן להשתמש μl 10 של תרומבין המדולל לכל דגימת פלזמה שassayed עם assay FV 2-הבמה.
  14. דלל 120 μl של NHP מעל והפלזמות לדוגמה מ40-קיפול לקיפול עם 100-170 μl של הרוורד, 7.4 pH המכיל כלוריד הסידן 2.8mM. הוסף 10 תרומבין μl (10nm ריכוז סופי) לכל דגימה. מערבולת גם לערבב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך דקת 1.
  15. דלל NHP ופלזמות לדוגמה 500-לקפל ידי הוספת 400 μl של הרוורד, 7.4 pH, מערבולת היטב, וassay 50 μl של כל דגימת פלזמה בFV assay microplate 1-במה, כמתואר לעיל.
  16. לקבוע זמן לקריש NHP וכל דגימת פלזמת assayed מפרופילי הספיגה לעומת זמן בSoftMax Pro. אם ייקח בחשבון את דילול 500-הקיפול, לנצל את זמן קרישה לכל דגימה לחשב FV הפעילות 2-שלב מעקומת ע.נ. 1-שלב הסטנדרטית של זמן קריש התחבר לעומת פעילות FV יומן (איור 2 א).
  17. סך FV פעילויותיוty יכול אז יחושב כפעילות FV 2 שלבים - פעילות ע.נ. 1-במה.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נציג תוצאות - הכנת FV עקומות 1-במת microplate קרישת assay פעילות הרגילה

דוגמה מייצגת להיווצרות קרישי הפיברין בassay FV לאורך זמן נוצר על ידי microplate הקורא מוצגת באיור 1. Assay FV במדויק מודד את הזמן, שיעור ראשוני, ומידה של היווצרות קריש פיברין. בדיקה של בארות עם השלמת בדיקה אשרה כי היווצרות קריש דם התרחשה. כל התגובות הגיעו בערך באותו ההיקף של היווצרות קריש דם עם שינוי כללי בספיגה ב405nm של 0.35-0.45 יחידות בין הספיגה מתחילה לפני ואחרי הספיגה המקסימלי thromboplastin ובנוסף סידן כלוריד. דוגמאות מייצגות של עקומות ע.נ. 1-שלב פעילות סטנדרטיות של זמן קריש התחבר (בשניות) לעומת פעילות התחבר FV (יחידות / מ"ל) וכניסת דרג ראשוני של היווצרות קריש דם (בmUnits / min) פעילות לעומת התחבר FV (יחידות / מ"ל ) לדילולים סידוריים של NHP מוצגת ב ו -2 איור, בהתאמה. התאמת העלילה התחבר התחבר של זמן קריש לעומת ע.נ. 1-פעילות הצביעה על קשר חזק בין המשתנים הללו לאחר ניתוח רגרסיה ליניארית (איור 2 א; R 2 = 0.980). התאמת העלילה התחבר התחברה מהדרג הראשוני של היווצרות קריש דם לעומת פעילות FV ציינה גם קשר חזק בין המשתנים הללו לאחר ניתוח רגרסיה ליניארית (התרשים 2B, R 2 = 0.983). מערכת היחסים של שניהם זמן הקריש התחבר והתחבר דרג ראשוני של היווצרות קריש דם לעומת פעילות FV התחבר נשארה ליניארי לNHP דילול עד 512-קיפול. מאז FV מסתובב בNHP בכ 12 40nm-16, assay microplate רגיש לכ 24 80pM FV בNHP. בהתחשב בכך שהניתוק המתמיד של האינטראקציה של FVa-FXa-שומנים בprothrombinase הוא כ 1nm 17, assay microplate FV הוא לגמרי מתאים למדידה של רמות FV בפיסיולוגי relevanמגוון nM לא לפונקצית FVa בprothrombinase.

שימוש assay microplate FV, זה נקבע גם שהטווח הנורמלי של פעילות FV בassay ע.נ. 1-שלב הפעילות של 15 פלזמות בריאות שליטה (זכר ונקבה, גיל 18-20yrs) היה (ממוצע ± סטיית תקן, טווח): 0.96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. זה מסכים גם עם הפעילות הנורמלית הבריאות ומגוון FV (0.66-1.14U/ml) דווחה על ידי קטלר et al. לFV פעילות 1-שלב נקבעה עם מנתח אוטומטי 7. שונות התוך assay של הזמן, במידה והשיעור ראשוני של היווצרות קריש דם בבדיקת 1-שלב FV 6 בבארות על 8 ימים שונים היו 3.4%, 4.4%, ו -3.1%, בהתאמה. ההשתנות-assay בין של הזמן, במידה והשיעור ראשוני של היווצרות קריש דם בבדיקת 1-שלב FV 6 בבארות של 8 ניסויים שונים על 8 ימים שונים היו 7.1%, 7.8% ו -9.2%, בהתאמה. לפיכך, השתנות פן ו- assay בין השלוש אלה measuמשתנים אדומים היו ברמה נמוכה ומקובלת לביצוע בדיקה חזק בתוך ובין assay microplate של דגימות מרובות בו זמנית (עד 12).

נציג תוצאות - assaying דגימות פלזמה אנושיות עם ע.נ. 1-השלב ובדיקת קרישת microplate 2-שלב

עקומת הסטנדרט של פעילות מול התחבר קריש זמן התחבר FV (איור 2 א) שמשה למדידת פעילות FV בNHP ופלזמות מטופל 9 DIC שלא הופעלו במכוון במוסף תרומבין (פעילות 1-שלב ע"ע) או במכוון הופעלו עם הוסיף תרומבין (פעילות 2-שלב ע"ע) והתוצאות מוצגות בטבלת 1. כל 9 פלזמות מטופל DIC הציגו FV פעילויות 1-במה ושיעורים הראשונים של היווצרות קריש דם שירדו בממוצע ב 54% ו 18%, בהתאמה, מNHP. את גודל היווצרות קריש דם בבדיקת 1-שלב FV בחולי DIC לא היו במידה רבה שונים מNHP, ועלה בממוצע, ב 13% מNHP.

הפעלה של NHP עם תרומבין שנוצרה גידול 8-פי משוער בFV פעילות 2-שלב מעל פעילות 1-שלב FV (טבלה 1). זה מצביע על כך ע"ע בNHP היה בעיקר בצורתו נוכחית לא הממושכת שלו ומסכים עם תוצאות שדווחו בעבר באמצעות מבחנים ידניים Tilt-tube FV 3, 4 מבחני FV אוטומטיים 5-7. FV 2-הבמה ומסך פעילותם הירד גם בחולי DIC בממוצע, 44% ו 42%, בהתאמה, מNHP. השיעורים הראשוניים וההיקפים של היווצרות קריש דם בבדיקת 2-במה בחולי DIC FV לא היו שונים משמעותי מNHP ומגוונים בממוצע, ב 9% וכ 4%, בהתאמה, מזו שנצפתה בNHP. תוצאות אלו מצביעות על כך שלעומת FV בNHP, FV בפלזמות מטופל DIC הביא זמן ממושך וירידה בקצב היווצרות קריש הפיברין וכי החולה FV היה בממוצע, רק 56% כactivatable עם תרומבין גם כן.

אף אוזן הגרון "fo: לשמור-together.within עמודים =" תמיד "> figure-results-1
איור 1. היווצרות קריש דם בפלזמה נורמלית נקוותה אדם התייחסות נמדדה עם microplate FV הקינטית assay קרישה 1-במה. היווצרות קריש פיברין בNHP הייתה פיקוח ברציפות ב405nm באמצעות קורא microplate קינטית. העלילה היא הפלט של קורא microplate תגובת 6 דקות של NHP 32-לקפל בדילול המלאה, פלזמה FV-לקויה, thromboplastin, וכלוריד הסידן בmicroplate היטב. הציר האנכי מייצג את השינוי בספיגה ב405nm שאירע כתוצאה מהיווצרות פיברין בפלזמה. הזמן של היווצרות הפיברין הוגדר כזמן להגיע לגידול המקסימאלי 1/2 בספיגה או האמצע עקום (36.40 שניות). השיעור הראשוני של היווצרות קריש דם הוגדר כשיעור שינוי של ספיגה ב405nm במהלך 5 נקודתי הזמן הראשונות של העלייה ליניארית של חלק הספיגה של העקומה (611.88 mUnits / min). לשעבראוהל של היווצרות קריש דם הוגדר כהבדל בין הספיגה המקסימלי ומינימאלית ב405 ננומטר (0.35 יחידות).

figure-results-2
איור 2. עקומות סטנדרטיות של זמן וקצב ראשוני של היווצרות קריש דם לעומת פעילות V פקטור בפלזמת התייחסות נורמלית נקוותה אנושית באמצעות FV assay microplate 1-במה. NHP הייתה מדוללת סדרתי (0 - ל 512-לקפל ברוורד) וassayed עם FV assay microplate 1-במה, כמתואר בפרוטוקול. חלקות יומן יומן של הזמן והקצב ראשוני של היווצרות קריש דם לעומת פעילות בע.נ. ע.נ. assay microplate 1-במה מוצגות לאחר דוגמנות רגרסיה לינארית של הנתונים בלוחות, ו-B בהתאמה.

assay 1-שלב דרג ראשוני (mUnits / דקות)
מדגם פעילות assay 1-במה (יחידות / מ"ל) היקף assay 1-במה (יחידות) פעילות assay 2-במה (יחידות / מ"ל) היקף assay 2-במה (יחידות) דרג ראשוני assay 2-במה (mUnits / דקות) פעילות כוללת (יחידות / מ"ל)
NHP 1.02 0.363 744.96 7.93 0.433 375.84 6.91
חולה 1 0.36 0.404 583.80 3.84 0.432 249.96 3.48
חולה 2 0.67 0.416 704.04 5.28 0.469 323.16 4.61
0.31 0.435 562.08 3.92 0.453 294.96 3.61
מטופל 4 0.39 0.435 617.04 4.14 0.462 372.60 3.75
מטופל 5 0.73 0.401 641.40 5.91 0.433 354.24 5.18
חולה 6 0.45 0.403 600.72 4.16 0.445 393.96 3.71
חולה 7 0.49 0.395 575.40 4.89 0.449 357.48 4.40
מטופל 8 0.19 0.448 489.00 2.89 0.450 330.48 2.70
מטופל 9 0.64 0.423 699.48 5.11 0.455 417.24 4.47

פעילות טבלת 1 ע.נ. בNHP וב9 חולים שפתחו מופץ קרישת intravascular (DIC). ע.נ. 1-הבמה, 2-במה, ופעילות הכוללת בNHP ופלזמות מטופל 9 DIC נקבעה משלב 1-FV microplate assay הסטנדרטי עקומת זמן של היווצרות קריש דם לעומת פעילות FV (איור 2 א) וניתנת ביחידות / מ"ל. השיעורים הראשונים (שיעור ראשוני של עלייה בA405nm מעל חמש נקודות בפעם הראשונה בmUnits / min) ומי פחות (A405nm המרבי - A40 מינימום5nm) להיווצרות קרישים ב1 ע.נ. - וassay microplate 2-במה מוצגים גם.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת בדיקת microplate הקינטית מתארת ​​את התפתחות רומן, טכניקה מהירה, זולה, ונוחה למדידת פעילות קרישת FV בדגימות של פלזמה אנושית אשר לא (1-assay שלב ע"ע) או שהופעל במכוון במוסף תרומבין (ע"ע 2-שלב בדיקה). Assay מנצל קורא microplate הקינטית ואת כל החומרים וריאגנטים נדרשים זמינים מסחרי או עשויים להיות בבית. בדיקת רציפות מנטרת את השינוי בפיזור האור של פלזמה במהלך היווצרות קריש פיברין ב405nm. Assay microplate יש את היתרון של שימוש בכרכי מדגם פלזמה קטנים (μl) והוא נוח לניתוח של דגימות מרובות בו זמנית (עד 12). תכונות אלו assay הן יתרון כאשר ציוד וריאגנטים יקרים משמשים (מנתחים אוטומטיים ופלזמות Factor-לקויות); רק בנפחי מדגם קטנים זמינים (פלזמות חולות) או לנתח מספר גדול של דגימות (f במהלך טיהור FVrom פלזמה).

Assay microplate FV יש את היתרונות המוספים שהוא נוח, מהיר ואינו דורש בידוד והטיהור של רכיבים המרכיבים את הנדרשים. לעומת Tilt-צינור ידני 3, 4 ו מבחני FV 5-7 אוטומטיים שכבר דיווחו, assay microplate FV יש טווח דומה שימושי של פעמי קריש (25-75 שניות) ורמות FV מקבילים במדגם (0.5-0.005 יחידות / מ"ל), ורגישות / גילוי מגבלות (20-80pM). בהשוואה למבחנים ידניים Tilt-tube ע.נ. הסובלים מהערכה חזותית הסובייקטיבי של היווצרות קריש דם 3, 4, assay microplate FV מאפשר מדידה אובייקטיבית וכמותית של זמן הקריש, שיעור ראשוני, ומידה של היווצרות קריש פיברין. בהשוואה למבחנים אוטומטיים ע.נ. הסובלים מהדרישה של מנתחים ומגיב יקרים 5-7 את ריאגנטים FV microplate assay וחומרים הם זולים ואת כל החומרים הדרושים עשויים להיות purchased מסחרי או שנעשה בבית. Tilt-צינור 3 ידניים, 4 ומבחני FV 5-7 אוטומטיים בדרך כלל רק לספק הזמן להיווצרות קריש דם, לא זמן, שיעור ראשוני, והמידה של היווצרות קריש הפיברין אשר כל למדוד במדויק spectrophotometrically עם assay microplate FV. לבסוף, מבחני FV 5-7 Tilt-צינור ידניים ואוטומטיים 3,4 סובלים מלהיות יחיד מסוגל למדוד את פעילות FV בדגימות פלזמה אחד בכל פעם, ואילו assay microplate FV הוא נוח לתפוקה גבוהה ו12 דגימות עשויות להיות assayed בו זמנית.

Assay microplate שמש כדי להוכיח שע"ע ב9 פלזמות מטופל DIC היה פחות פעיל מאשר בNHP בגלל שילוב של זמני קריש מתעכבים ושיעורים ראשוניים נמוכים יותר של היווצרות קריש דם בבדיקת ע.נ. 1-הבמה. השיעורים הראשונים של היווצרות קריש דם בבדיקת 2-שלב FV בפלזמות מטופל DIC לא השתנו מNHP. את גודל היווצרות קריש דם בדסק"ש patienלא פלזמות גם לא שונו מNHP בע.נ. 1-הבמה ומבחנים 2-במה. ירידת ע.נ. 1-במה, 2 שלבים, וכלל פעילויות הייתה אולי כתוצאה מצריכה המוגברת FV 19 ו / או איון 6 בהתאם למחקרים אחרים בפתוגנזה של מחלת דם שנרכש זה. בהתחשב בהיקף היווצרות קריש דם בפלזמות DIC היה זהה נצפה עם NHP, משתנה זה היה ככל הנראה תוצאה של ריכוז פיברינוגן בפלזמת FV-הלקויה ואינה קשור למאפיינים של פלזמות המטופל.

התוצאות של בדיקת microplate ציינו כי מדידה של פעילות FV בדגימות של פלזמה האנושית ניתן לקבל מהרגע ראשון וקצב היווצרות קריש מassay ע.נ. 1-השלב והזמן של היווצרות קריש דם ופעילות הכוללת מע.נ. 2 - assay במה. לא ניתן היה להשיג מדידת כמותית של פעילות FV בדגימת פלזמה המבוססת על המידה להיווצרות קרישים בtהוא 1 ע.נ. - ומבחנים 2-במה או השיעור הראשוני של היווצרות קריש דם בבדיקת 2-שלב FV. בהינתן כל התגובות הגיעו לאותה המידה של היווצרות קריש דם של 0.35 כ - 0.45 יחידות בין הספיגה הראשונית לפני ואחרי הספיגה המקסימלי thromboplastin ובנוסף סידן כלוריד, מדידה של היקף היווצרות קריש דם אינה מספקת הערכה כמותית של פעילות FV ב נתן דגימת פלזמה.

Assay microplate הרומן ימצא שימוש במחקר ובמסגרות קליניות למדידה של פעילות FV בדגימות של פלזמה אנושית ושברים במהלך טיהורו מפלזמה אנושית ובעלי חיים. Assay microplate עשוי לשמש למדידת הזמן, שיעור ראשוני, והיקף של היווצרות קריש דם; פרמטרים לא נבדקו כלל במקביל במבחני Tilt-tube ומנתחי קרישה אוטומטיים ידניים. מידע זה מספק יותר מהערכה כמותית שלמה של המעורבות של FV במהלך אירוע היווצרות קריש הדםבפלזמה אנושית יותר ממה שדווח בעבר 3-7. מידע זה חשוב במיוחד במחקר והן במעבדות קליניות בעת מדידת שינויים משמעותיים בפעילות FV בדגימות של פלזמה או עם מטוהר FV או FVa. Assay microplate FV עשוי לשמש גם כדי לאפיין ולמדוד תרכובות שיכולים להפעיל או לנטרל FV וFVa, למדוד את פעילות FV בחולים בסיכון לפקקת ורידים כתוצאה ממוטצית ליידן FV 20, 21 וכדי לפקח על הפעילות של FV במהלך טיהורו מהפלזמה.

Assay microplate FV הוא להתאמה בקלות למדוד את הפעילות של כל גורם קרישה במסלול החיצוני, הפנימי, או משותף באמצעות הפלזמה המתאימה גורם הלקויה וייזום ריאגנטים להיווצרות פיברין. Assay יגדיל את ההבנה של FV הביוכימיה שלנו באמצעות מדידה מדויקת ומלאה יותר של פעילותה במחקר ובמעבדות קליניות. סופיly, מידע זה יהיה השפעה חיובית סביבות בריאות באמצעות אבחון ופיתוח טיפולים יעילים יותר עבור אנשים הסובלים מהפרעות קרישה, כגון דסק"ש קודם לכן.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר נתמך בפיתוח מקצועי וקרני מחקר אתחול מאוניברסיטת אונטריו המכון טכנולוגי (UOIT) לד"ר ג'ון א Samis ומכון קנדי ​​לפרס בריאות מחקר בריאות מקצועית לתלמיד מחקר של אירינה לויט. המחברים מודים שינון אוורט (הוראה ומרכז למידה, UOIT) על סיועה בהכנת הסרטון. המחברים מודים ד"ר מייקל א 'Nesheim (מחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת קווינס, קינגסטון, ON) לחונכותיו, תובנה ודיונים מועילים. המחברים גם להודות ד"ר צ'נג למשכן טווה (Haemostasis רואלד דאל ומרכז פקק, רויאל ליברפול חולים האוניברסיטאי, ליברפול, אנגליה) למתן פלזמות מטופל DIC השתמש במחקר.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שם מגיב חברה מספר קטלוגים תגובות (אופציונלי)
קינטי microplate קורא התקנים מולקולריים ספקטרה מקס 190 4.3 תוכנת SOFTmax PRO LS
פלזמת התייחסות רגילה נקוותה אנושית דיוק ביולוגי CCN-10
Trisodium ציטראט הקיטון דיקנסון B10242
EDTA הקיטון דיקנסון B10093
פלזמה אנושית FV לקוי 4 עשוי מפלזמה אנושית טריה ומאוחסן בaliquots ב -70 ° C.
3 ו 60מזרקי מ"ל הקיטון דיקנסון 309585 ו136898
מנגנון פרפר Vacutainer 367251 20 מד
HEPES סיגמא / אולדריץ H-3375
NaCl דיג BP358-212
Thromboplastin טריניטי ביוטק T1106 דיאליזה לעומת HBS, pH 7.4 ומאוחסן בaliquots ב -70 ° C.
סידן כלוריד הקיטון דיקנסון B10070
15 תרומבין אדם מפלזמה אנושית; מאוחסן ב -20 ° C ב 50% (v / v) גליצרול.
קרום דיאליזה דיג 21-152-6 6-8kDa חיתוך משקל מולקולרי; 50mm x 3m.
בעל תבנית ונשלף 8 רצועות גם. Nunc 14-245-63 ו469957
מגשי כביסת ELISA BioRad 224-4872
1.5 microfuge מ"ל ו 15 צינורות הכתירו בורג מ"ל. Sarstedt 72690 ו62554205
פיפטה הרבה ערוצים דיג 2703630 דגם 8 ערוצים.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
  2. Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
  3. Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. Factor V. Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).
  4. Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
  5. Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Jr Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
  6. Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
  7. Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
  8. Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
  9. Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
  10. Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
  11. Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
  12. Pratt, C. W., Monroe, D. M. Microplate coagulation assays. Biotechniques. 13, 430-433 (1992).
  13. Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
  14. Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
  15. Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
  16. Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
  17. Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. Assembly of prothrombinase complex. Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).
  18. Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
  19. Mammen, E. F. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).
  20. Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
  21. Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Factor V ActivityMicroplate Coagulation AssayFibrin Clot FormationHuman PlasmaCoagulation FactorThrombin ActivationAbsorbance MeasurementDisseminated Intravascular CoagulationProthrombinase ComplexKinetic Microplate Reader

Related Articles