נוירונים קולטניים ריח (ORNs) להמיר אותות ריח ראשון לתוך קולט נוכחיים מעורר בתור פוטנציאל פעולה שמועברים לנוירונים מסדר השנייה בנורת חוש הריח. כאן אנו מתארים את טכניקת יניקת פיפטה כדי להקליט את הקולטן odorant מושרה פוטנציאלי פעולה הנוכחי ומORNs העכבר בו זמנית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
בעלי חיים לטעום הסביבה הריחנית סביבם דרך מערכות chemosensory ממוקמות בחלל האף. אותות Chemosensory להשפיע התנהגויות מורכבות כגון בחירת אוכל, טורף, conspecific והכרת בן זוג ורמזים חברתיים רלוונטיים אחרים. נוירונים קולטניים ריח (ORNs) ממוקמים בחלק הגבה של חלל האף המוטבע באפיתל ההרחה. הנוירונים דו קוטביים אלו שולחים אקסון לנורת חוש הריח (ראה איור. 1, Reisert & זאו 1, שפורסם במקור בכתב העת של פיזיולוגיה כללית) ולהרחיב דנדריט אחת לגבול אפיתל ממקום שבי להקרין ריסים לליחה המכסה את חוש הריח האפיתל. הריסים מכילים מנגנון העברת האותות שסופו של דבר מוביל לגירוי זרם זרם דרך ערוצי ריסי transduction, ערוץ מחזורי נוקלאוטיד-מגודר (CNG) וCa 2 +-Cl פעיל - ערוץ (1 איור). Depola התפתחrization מפעיל דור פוטנציאל פעולה בגוף התא 2-4.
בסרטון זה אנו מתארים את השימוש של "טכניקת יניקת פיפטה" לרשום תגובות odorant מושרים מORNs. שיטה זו פותחה במקור כדי להקליט מphotoreceptors המוט 5 וריאנט של שיטה זו ניתן למצוא בjove.com השונה כדי להקליט מphotoreceptors קונוס העכבר 6. טכניקת יניקת פיפטה מאוחר יותר הותאם גם להקליט מORNs 7,8. בקצרה, לאחר הניתוק של האפיתל ההרחה ובידוד תא, גוף התא כולו של orn נשאב לתוך קצה פיפטה הקלטה. דנדריט והריסים יישארו חשוף לפתרון אמבטיה ובכך נגיש לשינויי פתרון שיאפשר odorant למשל או יישום חוסם תרופתי. בתצורה זו, אין לו גישה לסביבה התאית היא צברה (לא מהדק מתח כל תאים) והמתח התאי נותר חופשי להשתנות. כל זהows ההקלטה סימולטני של זרם הקולט האיטי שמקורו בריסים ופוטנציאל פעולה מהיר שנורה על ידי גוף התא 9. ההבדל בקינטיקה בין שני אותות אלה מאפשר להם להיות מופרדים באמצעות גדרות מסננות שונות. טכניקה זו ניתן להשתמש בכל סוג פרא או עכבר נוקאאוט או להקליט באופן סלקטיבי מORNs שגם מבטא GFP לתייג תת ספציפי של ORNs, למשל מבטא קולט odorant נתון או ערוץ יון.
פרוטוקול
1. הגדרת ההקלטה
חדר ההקלטה הוא רכוב על המיקרוסקופ ניקון TE2000U אקליפס הפוך עם אופטיקה לעומת השלב בו מצויד על שולחן אוויר וחשמל מוגן באמצעות כלוב פאראדיי. חדר הקלטת פרספקס מורכב משני חלקים מופרדים באופן חלקי על ידי מחסום והודבק על גבי זכוכית silanized. בחלקו האחד של החדר משמש ליישב את התאים ואילו השני משמש לגירוי חשיפה במהלך ההקלטה המוקדמת כדי למזער את החשיפה של התיישב אך עדיין אינם בשימוש תאים לodorant. הגדרת ההקלטה מורכבת מפיפטה שאיבה (ראה בהמשך) עלתה בבעל פיפטה pelleted והאלקטרודה קרקע. פיפטה היניקה תמוקם באמצעות micromanipulator. פתרוני תמריצים מיושמים באמצע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טכניקת יניקת פיפטה היא שיטת אלקטרו שמשמש להקלטה נוכחי ריח המושרה האיטיים הקולטן ואת פוטנציאל הפעולה פאזית המהיר מorn בו זמנית. מאז קרום הפלזמה של התא לא נסדק, שיטה זו מותירה סביבה באין מפריע התאית להבטיח שתגובות odorant אינן משתנית בשל שינויים של ריכוזי cytoplasmic יון או הדילול של גורמים תאיים. תאים ניתן להקליט מתקופות ארוכות (עד 4 שעות בצפרדע וh 1 בעכבר). יתרון נוסף של שיטה זו הוא, שכן גוף התא נמצא בפיפטה ההקלטה, שהגירוי מועבר רק לחלקו הקודקוד של orn, כלומר ריסים וידית הדנדריטים (כמו במקרה של In vivo.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לי מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי NIH DC009613, תכנית מדע הגבולות האנושית ומוראלית טיפול מלגה (לJR).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| שמו של החומר | סוג | חברה | קטלוג / מספר דגם | תגובות |
| שולחן אוויר | ציוד | ניופורט | ||
| משאבת אוויר | ציוד | ניופורט | ACGP | |
| פיפטה פולר | ציוד | סאטר | P-97 | |
| ורוסיליקט זכוכית | ציוד | WPI | 1B150-4 | |
| ניקון אקליפס מיקרוסקופ ההפוך | ציוד | ניקון | TE2000U | מצויד במנורה כספית, GFP מסנן ויעדים 20X 5X ולפחות |
| המגבר PC-501A | ציוד | וורנר | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| סכין יהלום | ציוד | מחוייט | ||
| Digitizer Mikro1401 / D | ציוד | עיצוב קיימברידג' אלקטרונית | ||
| יחידת סינון 3382 | ציוד | קרון הייט תאגיד | ||
| לאותת | תוכנה | עיצוב קיימברידג' אלקטרונית | ||
| Molded Ag / AgCl גלולה | ציוד | WPI | 64-1297 | |
| בעל פיפטה | ציוד | וורנר | 64-0997 | מותאם אישית שונה כדי להתאים headstage |
| חדר הקלטה | ציוד | מחוייט | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | ציוד | מכשיר סאטר | Micromanipulator MP85-1028 | |
| שמן מינרלים | פתרון | סיגמא | 330779-1L | |
| TDS אוסצילוסקופ 1001 | ציוד | Tektronix | ||
| שפופרת זכוכית המרובעת של שלושה עם הקנה | ציוד | וורנר | 64-0119 | מזהה מ"מ 0.6, 5 סנטימטרים ארוכים |
| שסתום | ציוד | החברה לי | ||
| Valvelink 8.2 | ציוד | אוטומציה מדעית | ||
| צעד מהיר זלוף SF-77B | ציוד | וורנר |
מקורות
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
