Method Article

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות Aplysia

DOI:

10.3791/3907

⸱

July 15th, 2012

 ,  , 
1Fishberg Department of Neuroscience and Friedman Brain Institute, Mt. Sinai School of Medicine, 2Phase Five Communications Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מראים כיצד שינויים בריכוז התאי החופשיים הסיד ויעילות הסינפטית ניתן לפקח במקביל בהכנה של גנגליון Aplysia. אנחנו תמונת הסידן תוך תאי באמצעות צבע פלואורסצנטי, אורנג' סידן, ולעורר ולפקח על העברה הסינפטית עם אלקטרודות חדות (תאי).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היה מי שהציע כי שינויים בסידן תאי לתווך אינדוקציה של מספר הצורות חשובות של פלסטיות הסינפטית (הנחיית למשל, homosynaptic) 1. השערות אלה ניתן לבדוק על ידי ניטור שינויים בסידן תוך תאי ושינויים ביעילות הסינפטית בו זמנית. אנו מדגימים כיצד זה יכול להתבצע על ידי שילוב הדמית סידן עם טכניקות הקלטה תאיות. הניסויים שלנו מתנהלים בגנגליון buccal של Aplysia californica הרכיכה. הכנה זו כוללת מספר התכונות מועילות בניסוי: גרעינים ניתן להסיר בקלות מAplysia וניסויים להשתמש תאי עצב בוגרים המרכיבים קשרים סינפטיים רגילים ויש לי ערוץ הפצת יון רגילה. בשל שיעור הנמוך מטבולים של בעלי החיים והטמפרטורות הנמוכות יחסית (14-16 מעלות צלזיוס) שהנם טבעיים לAplysia, הכנות הן יציבות לפרקי זמן ארוכים. > אף אוזן גרון "כדי לזהות שינויים בסידן חופשי תאי אנו משתמשים בגרסת impermeant התא של סידן אורנג' 2 אשר בקלות" נטען "לנוירון באמצעות iontophoresis. כאשר צבע אורך גל ניאון ארוך זה נקשר לסידן, עולה עוצמת קרינה. הסיד אורנג' יש תכונות מהירות הקינטית 3 ו, בניגוד לצבעי ratiometric (למשל, Fura 2), לא דורשות גלגל מסנן עבור הדמיה. זה די תמונה יציבה ופחות phototoxic מצבעים אחרים (למשל, Fluo-3) 2,4. כמו כל הלא ratiometric צבעים, סידן אורנג' מציין שינויים יחסיים בריכוז הסידן. אבל, מכיוון שלא ניתן להסביר את השינויים בריכוז צבע עקב טעינה ודיפוזיה, זה לא יכול להיות מכויל לספק ריכוז יוני הסידן מוחלט.

במה, מיקרוסקופ זקוף, קבוע מתחם שמש לנוירונים תמונה עם מצלמה מסוגלת להקליט סביב 30 מסגרות לשנייה CCD. בAplysia הרזולוציה של הזמן הזההוא יותר ממספק כדי לזהות אפילו שינוי מושרה ספייק יחיד בריכוז הסידן התוך התאי. אלקטרודות שארפ משמשות בו זמנית כדי לגרום ולהקליט שידור סינפטי בנוירונים לפני וpostsynaptic מזוהים. בסיומו של כל משפט, תסריט מותאם אישית משלב נתוני ההדמיה electrophysiology ו. כדי להבטיח סינכרון ראוי אנו משתמשים דופק אור LED הרכוב בנמל המצלמה של המיקרוסקופ. מניפולציה של רמות הסידן presynaptic (למשל, באמצעות הזרקת EGTA תאית) מאפשרת לנו לבחון את השערות ספציפיות, הנוגע לתפקידו של הסידן תוך תאי בתיווך צורות שונות של פלסטיות.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה

  1. הרדם את החיה על ידי הזרקת תמיסת 75-100 מ"ל איזוטוני מגנזיום כלוריד. Aplysia אנו משתמשים להדמיה הן בדרך כלל 150-200 גרם והם מתקבלים ממרינוס המדעי.
  2. להצמיד את החיה המורדמת לצלחת מכוסית שעווה. מחטי מזרקים לעבוד היטב למטרה זו; טכניקות סטריליות אינן נחוצות. שימוש במלקחי ברוטו ומספריים רגילים עושה חתך ברגלו של בעל החיים ולחשוף את מסת buccal. אתר גנגליון buccal. בעזרת מספרי האביב ומלקחיים עדינים, בזהירות חופשיה גנגליון על ידי חיתוך את כל עצבי buccal.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדגימים טכניקות שניתן להשתמש בו זמנית לפקח על ריכוז הסידן התוך התאי ולהעריך את היעילות של העברה הסינפטית. שיטות אלה מועילות לקביעה כיצד צורות שונות של פלסטיות לטווח קצר מתווכות.

ההדמיה מבוצעת עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומצלמת CCD. דרישות ציוד אלה הן צנועות יחסית בהשוואה ללהגדיר קופצים הדמיה פונקציונלית ביותר. הטכניקה היא פשוטה וקלה ללמידה. בעוד הדמיה עם מצלמת CCD מאפשרת הדמיה של שטח גדול עם רזולוציה של זמן טוב,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו מה למסור.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרנט PHS (MH51393) תמך עבודה זו. חלק מAplysia אנו משתמשים מסופקים על ידי המשאבים הלאומיים לAplysia של אוניברסיטת מיאמי תחת גרנט RR10294 מהמרכז הלאומי למשאבי מחקר, NIH.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שם מגיב חברה מספר קטלוגים הערה
הסיד אורנג' Invitrogen C-3013
EGTA סיגמא E-4378
ערכת חיץ כיול סידן Invitrogen C-3008MP שימושי לבדיקת הרגישות והטווח דינמי של האות
hexahydrate מגנזיום כלוריד סיגמא M0250 השתמש בתמיסת 0.33 M להרדים בעלי חיים

לוח 1. ריאגנטים שימוש.

שם ציוד חברה הערה
FN-1 מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף ניקון מכשירים עם Narishige-FN1 ITS השלב
לענ-21 המניפולטורים Narishige רכוב על במה עם מגנטים
מצלמת 2 CoolSNAP HQ CCD Photometrics
ח האלמנטים AR
(גרסה 3.22) 		ניקון מכשירים תוכנת הדמיה משמשת לרכישת נתוני קרינה
10X/0.3w תכנית פלואוריד אובייקטיבי ניקון מכשירים עדשת טבילה במים זה יש מרחק עבודה ארוך מאוד של 3.5 מ"מ
X-Cite מנורה הליד מתכת מחשב 120 EXFO משמש לדימות פלואורסצנטי
LS-DWL
מנורת הלוגן 		Sumica
קבוצת ET-CY3 מסנן טכנולוגית Chroma ;
כוח 1401 / D ממיר עיצוב קיימברידג' אלקטרונית הדגימה נעשתה ב 3 קילוהרץ
ספייק השני
(גרסה 7.07) 		עיצוב קיימברידג' אלקטרונית תוכנה המשמשת לאיסוף נתוני electrophysiology
SEC LX-10 מגבר NPI אלקטרוניקה בשימוש עם headstage 10X
410 מגבר דגם ראונלי דיוק משמש כדי להגביר את האות ולסנן
WS-4 מינוס k טכנולוגיה בידוד רעידות הדמיה
פלטפורמת קירור המנהג עשה לוחית הנחושת שדרכו מי קרח נשאבים בשיעור משתנה

טבלה 2. ציוד משומש.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).
  2. Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intracellular CalciumSynaptic EfficacyCalcium ImagingIntracellular RecordingAplysia GanglionCalcium Orange DyeElectrophysiology ImagingFluorescent MicroscopyCCD CameraSynaptic Plasticity

Related Articles