פיתוח Bronchiolitis סותם במודל Murine של השתלת ריאות Orthotopic

סיכום

Bronchiolitis סותם היא הפגיעה המפתח להישרדות ארוכת טווח של השתלת ריאה וחוסר מודל קליני חזק מונע בחינת immunopathogenesis bronchiolitis סותם. שלא כמו אחרים השתלות איברים מוצקים, vascularized העכבר השתלת ריאות יש רק לאחרונה פותחו. כאן אנו מציגים מודל שפותח באופן עצמאי שלנו bronchiolitis סותם לאחר ההשתלה Murine אחת הריאות orthotopic.

תקציר

השתלת ריאות Orthotopic בחולדות דווח לראשונה על ידי Asimacopoulos ועמיתים ב 1971 ^1. כיום, שיטה זו מקובלת גם ואחיד לא רק לחקר דחייה-Allo, אלא גם בין זנים syngeneic לבחינת מנגנוני פציעה איסכמיה reperfusion לאחר השתלת ריאה. אם כי יישומם של עכברוש ובעלי חיים אחרים מודל גדול ² תרומה משמעותית להבהרת של מחקרים אלה, היקף החקירות האלה היא מוגבלת על ידי מיעוט של נוק אאוט ו חולדות מהונדס. בשל אין טיפולים יעילים bronchiolitis סותם, הגורם המוביל למוות בקרב חולים השתלת ריאות, חלה בחיפוש אינטנסיבי אחר קדם קליניים מודלים הדומים bronchiolitis סותם. המודל allograft קנה הנשימה הוא הנפוץ ביותר ויכול לשחזר כמה מן התכונות של היסטופתולוגיות bronchiolitis סותם ^3. עם זאת, חוסר vasculat ללא פגעיור ללא קשר דרכי הנשימה ביצוע של הנמען, ותכונות פתולוגיים שלם של bronchiolitis סותם להגביל את השירות של מודל זה ^4. שלא כמו השתלת איברים מוצקים אחרים, vascularized השתלות ריאה העכבר רק לאחרונה דווח על ידי Okazaki ועמיתיו לראשונה בשנת 2007 ^5. יישום עקרונות היסוד של השתלת ריאות חולדה, במעבדה שלנו יזמה את המודל bronchiolitis סותם באמצעות קטין histoincompatible Murine אנטיגן orthotopic אחת לשמאל השתלות ריאה המאפשר מחקר נוסף של immunopathogenesis bronchiolitis סותם ^6.

פרוטוקול

1. התורם נוהל

1. הליכים כירורגיים כל בוצעו תוך ניצול טכניקה סטרילית. אנטיביוטיקה לא נותנים לתורם והן בעכברים הנמענים.
2. אינדוקציה של הרדמה של העכבר התורם נשלחת עם 5% Isoflurane.
3. העכבר הוא מחובר לצינורות orotracheally עם קטטר 20-מד תוך ורידי והניח לאחר מכן למכונת הנשמה מכרסם, באמצעות 100% חמצן בקצב של 125 נשימות בדקה וכ 0.5 מ"ל נפח הגאות (2% ממשקל גופו).
4. הרדמה נשמר עם בשאיפה 1-2% Isoflurane.
5. העכבר תורם ממוקם בתנוחה אופקית, הכינו עם אלכוהול 70%.
6. Laparosternotomy מבוצע כמו קו האמצע בשילוב חתך רוחבי.
7. הפרין ב 100 ק"ג / u מוזרק הנחות הווריד הנבוב (IVC), ממש מתחת לכבד.
8. הסרעפת היא לחתוך לאורך מצורף costal הגחון לכיוון עמוד השדרה, ואת חלל בית החזה נחשף על ידי חיתוך משני צידי החזהמקיר אל הצוואר.
9. לאחר incising IVC ברמה של הסרעפת, תוספת פרוזדורים הנכון לחתוך הריאות סמוקות מ"ל 2 של קירור (4 ° C) הזרקת רינגר לקטט ושל 0.1 מ"ל של הפרין דרך חתך רוחבי השורש של עורק הריאה ( הרשות הפלסטינית) תא המטען.
10. מעצר אוורור בשני שלישים האינפלציה סוף גאות, לחסום לב ריאה הוא נכרת ומאוחסן על הקרח (4 ° C).
11. הריאה השמאלית התורם מוכן הנמען על ידי החיבור של האזיקים. רצועה ריאתי הוא חקוק עד עורק ריאתי (PV). Hilum מובא על ידי הסרת הוושט ואבי העורקים.
12. זהה את הרשות הפלסטינית, הממוקם היבט גולגולתי רוב hilum, כמו גם את הסמפונות העיקריים המחוברים (BR). בזהירות לנתח את הרשות הפלסטינית מן הסמפונות את.
13. השרוול הרשות עשוי קטטר 24 מד (IV) תוך ורידי וחותכים ל 0.5 מ"מ באורך עם סיומת של 0.7 מ"מ.
14. פני השטח של השרוול היא הכתה אז כדי להקל על anastomosis.
15. השרוול של הסמפונות נגזר קטטר IV 20-מד, וחותכים באורך של 1.0 מ"מ עם הרחבה של 0.7 מ"מ.
16. שימוש בחומרים אותם, השרוול PV משתנה עם משקל של העכבר התורם. באופן ספציפי, על עכברים 24-27 גרם גודל השרוול הוא 22-מד, 0.7 מ"מ אורך עם סיומת 0.7 מ"מ. על עכברים במשקל 27-32 גרם, המחקרים מנוצל קטטר 20-מד כלומר 0.7 מ"מ אורך עם סיומת 0.7 מ"מ.
17. האזיקים מוכנסים לתוך הקצוות המרוחקים של הרשות הפלסטינית PV ו Br ומאובטחת עם תפר 9-0.
18. ריאה מתורם סמוקות ורחצה עם מי מלח סטרילית עם הפרין סטרילי לפני האחסון. ריאה מתורם עטוף מכן עם גזה סטרילית ספוגה מלח סטרילית על הקרח (4 ° C), אשר שומר על הריאות מאוד נקי וסטרילי.
19. מהדק microvessel מושם על הסמפונות כדי למנוע כניסה רינגר לקטט לתוך דרכי הנשימה.

2. הנמען נוהל

1. אינדוקציה של anesthesia, אוורור מכני זהים כמתואר לעיל עבור התורם.
2. בית החזה השמאלי הוא מגולח הכינו עם אלכוהול 70% ו בתחום כירורגית הוא עטוף.
3. חתך פתיחת בית החזה נעשית בחלל השמאלי בין צלעי השלישי, הרחבת החתך קרוב dorsally לעמוד השדרה, וכן מהדק microvessel דגש על כלי ריאתי הסמפונות שמאל הסמוכים ללב. אתה יכול לראות את הרשות הפלסטינית בכל היבט גולגולתי, PV בסוף הזנב של hilum ו Br ביניהם.
4. באמצעות גרירה עדינה על hemostat כדי לגרום למתח קל על, הרשות הפלסטינית בר ו PV, הריאה השמאלית הוא שלף מחלל בית החזה תוך השארת המבנים המרכזיים hilar הידק.
5. , הרשות PV ו Br מבודדים על ידי דיסקציה קהה ואחריו הנחת תפר 9-0 ממוצבת באופן רופף סביב, הרשות הפלסטינית PV ו - Br.
6. לאחר לנתח הרשות לחלוטין נדן adventitial שלו, חתך רוחבי קטן של 4 בערך של היקף של כלי הואלהפוך הקיר הקדמי, והשאיר את המשך בחלק הגבי של העורק ללא שינוי.
7. ריאה מתורם, עטופה בתחבושת קרה, רינגר לקטט ספוג כותנה מוכן כמתואר לעיל, היא ממוצבת לתוך חלל בית החזה, ואת האזיקים מוכנס לתוך הרשות הפלסטינית הנמען, PV ו Br ומאובטחת עם תפר 9-0.
8. מהדק את הצלב hilar מוסר המאפשר reperfusion ואוורור.
9. לאחר הצבת ריאות המושתל אל תוך בית החזה הנמען, החתך נסגר באמצעות פתיחת בית החזה תפר 5-0.
10. עכבר מותר להתאושש מן ההרדמה. עצירות (0.05-0.15 מ"ג / ק"ג) ניתנת מיד לאחר הניתוח, ובמשך כל 8 שעות למשך 2-3 ימים לאחר הניתוח.

3. נציג תוצאות

הניסיון שלנו לימד אותנו, כי זה דורש מספר חודשים של תרגול חוזר להיות בקיאים מודל העכבר הריאות להשתלה. לאחר שליטה מושגת, אנחנוchieved בשיעור 96% (96/100 ניתוחים רצופים) הישרדות perioperative עם מקרי מוות שאירעו בתוך 7 ימים שלאחר הניתוח. שני מקרי המוות היו תוצאה של דימום שהחל intraoperatively, ו pneumothraces היו סיבת המוות בשני עכברים אחרים. עבור פרוצדורות כל, זמן איסכמיה חמה היה 14.32 ± 3.14 דקות, וזמן איסכמיה קר היה 58.51 ± 18.06 דקות. שלוש קבוצות orthotopic השתלת ריאה נחקרו: isograft: C57BL / 6 → C57BL / 6, allograft: C57BL/10 → C57BL / 6 ו C57BL / 6 → C57BL/10. השתמשנו רק בעכברים ממין זכר, אך הטכניקה שלנו יכול להיות מיושם גם נקבות עכברים, כי אין הבדל אנטומי משמעותי בין המינים.

לדירוג של דחייה הפתולוגיה נערך באופן עיוור ניצול קריטריונים סטנדרטיים עבור השתלת ריאות קלינית ⁷ (טבלה 1). ואילו צפינו דחייה קלה או ללא isograft (C57BL / 6 → C57BL / 6), שתי שילובים allograft פיתח compaדחייה אקוטית או כרונית rable (איור 1). לעומת זאת, היה OB באופן משמעותי את שכיחות יותר C57BL/10 → C57BL / 6 מ C57BL / 6 → C57BL/10 קבוצה ידי day28 (טבלה 1).

	C57BL / 6 → C57BL / 6	C57BL/10 → C57BL / 6	C57BL / 6 → C57BL/10	P-value
דחייה פתולוגיה "A" ציוני בכל יום 28	0.67 ± 0.89	* 3.33 ± 0.82	* 3.29 ± 0.76	* P <0.05
OB / עכברים סך הכל ב 21 יום ו 28	0/24 (0%)	** 14/34 (42.1%)	** 2/16 (12.5%)	** P <0.05

טבלה 1. עשרות היסטולוגית של דחייה חריפה השכיחות של השתלת bronchiolitis סותם הודעה. הניקוד של דחייה חריפה ("A" ציוני) קנה מידה CRIteria כמתואר תוצאות מייצגים. הנתונים מייצג את ממוצע ± סטיית תקן של "A" ציוני בכל השתלת הודעה 28 ימים. הנתונים מייצג את כמות ואחוז עכברים בכל קבוצה שהתפתחו OB ב 21 ו 28 ימים השתלת פוסט.

באיור 1. ממצאים מאקרוסקופיים אנליזה פתולוגית בכליה ב 28 ימים השתלת ריאות הדואר. לוח 1 א לייצג ממצאים מאקרוסקופיים ו-H & E ריאה Isograft מוכתם ריאות נאיבי הנכון. 1 ב 'פאנל 1 ג מייצג H & E ו Trichrome צבעונית של מייסון BL/10 allograft ריאות הושתלו הנמען BL / 6 העכבר, שפיתחה OB OB ולא, בהתאמה. החץ הלבן 1B מזהה נגעים של OB. 1D לוח מראה BL / 6 allograft ריאות הושתלו הנמען BL/10 העכבר.

פתרון בעיות במהלך ההליך העיקרי היו כדלקמן.

1. זרימת דם הפרעה: ריאה מתורם פלאש עדהצבע הופך להיות בצבע לבן. הפעלת לחץ מוגזם יכול לגרום בצקת ריאות. אבל לא לדחוף יותר מדי כדי למנוע בצקת לאחר ההשתלה.
2. הקושי של הכניסה לתוך השרוול התורם: לוודא vasculature הוא באורך מספיק חינם של רקמות שומן החיבור המצורפים.
3. דימום במקום anastomotic: השתמש טיפים q כדי להפעיל לחץ במקום הפגוע למשך כ 5 דקות.
4. מקבל חסימה בזרימת הדם הרשות הפלסטינית: נגרמת בעיקר במהלך החדרת השרוול על ידי פיתול של. אם האוויר הוא ציין בתוך הרשות מחדש לעשות השקה של הכרחי.
5. קשה השקה PV: ממברנה של PV הוא דק מאוד ובקלות דמעות. בחר גודל השרוול תקין להכניס ישר PV של הנמען בעדינות רבה.
6. מקבל חסימה בזרימת הדם PV: ודא את המיקום ואת הכיוון של השרוול. לשחרר את הדחיסה מן השרוול הסימפונות.
7. Pneumothorax: זו עשויה להיגרם על ידי ניקוב או הסימפונות בשל manipulation של דרכי הנשימה, או ניקוב של פני השטח ריאות עקב טראומה הקשורה הליך ההשתלה. לשעבר מטופל עם סגירת כירורגית של חור בתוך הקיר דרכי הנשימה, וזו מטופלת על ידי oversewing הדליפה על פני הריאות באמצעות 10-0 תפר ניילון.

דיון

השתלת ריאות Orthotopic בעכברים הוא מאתגר בשל דרישות microsurgical ואת שבריריותם קיצוני של רקמות. מבוא של הטכניקה השרוול אפשרה לשימוש נרחב של השתלת ריאות orthotopic בחולדות ^8. זה הפך את הבסיס לפיתוח מודל השתלת orthotopic ריאות בעכברים במעבדה שלנו. בעכברים וחולדות, שלא כמו בני האדם, הריאה השמאלי מכיל רק 1 האונה ו מהווה רק 25% ממסת הריאות הכולל. זה עושה שמאל אחת השתלת ריאות אפשרי במודל murine ללא צורך במערכת תמיכה הדם.

ניתוחים ראשונית שלנו עולה כי אוורור זלוף של הריאה המושתלת היתה תלויה מאוד בגודל של PV השקה. גודל מסוים PV anastomotic השרוול נוצלו כדי להתאים התורם מקבלי כפי שדווח ^9. השרוול לשינוי גודל בלתי הולם הביא atelectasis אחת הריאות בקיעה המושתל או anast PVomosis. Okazaki et al דיווחו על שימוש קשירת כלי משולב גזר ⁵ הסמפונות. במחקר הנוכחי אנו משתמשים קליפ מפרצת עבור כל המבנים hilar, אשר אנו מציעים עלולה לקצר את זמן איסכמי חמים. מגבלה אחת של השתלת ריאות orthotopic שמאל במודל murine היא שבעלי חיים הנמען יכול לשרוד אחרי נמק alloimmune בתיווך של allografts שלהם ^5. לכן, מחקרים הישרדות לא ריאלי והערכה השתל תלויה בבדיקה היסטולוגית של הריאה המושתלת ^10.

באמצעות טכניקה זו, פיתחנו מודל קליני bronchiolitis סותם בעכברים. באופן ספציפי, העכבר הוא C57BL/10 התורם והמקבל הוא C57BL / 6. הדבר מצביע על תפקידו של קטין, ולא גדולים, אנטיגנים histocompatibility בהיווצרות bronchiolitis סותם ^6. יתר על כן, דיווחנו נטרול IL-17 מונע bronchiolitis סותם במודל murine. במצב זהאני מייצג כלי מחקר חדשנית לבדיקת ריאות השתלת וקידום השתלות ריאה קליניים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם הציוד	חברה	קטלוג מספר
Zeiss Opmi 6SFC-1880	פרסקוט של בע"מ	PMZ014
הרווארד מאוורר מכרסמים	הרווארד Apparatus	55-7058
20 מד IV קטטר	Terumo רפואי Corporation	100510D
22-מד IV קטטר	Terumo רפואי Corporation	081015S
24 מד IV קטטר	Terumo רפואי Corporation	100522A
9/0 מט משי כחול הבתולה	Ashaway קו & CO פתילים Mfg.	MBVS-90
10-0 אלקון ניתוח קשירת	Alcon Laboratories, Inc	8065-192101
BLack משי 5-0/18inches קלועה	הנרי שיין	M652630
הפרין 1000 יחידות / מ"ל	APP Pharmaceuticals	407156
בבטאדין פתרון	פרדו מוצר	67618-150
לקטט רינגר של הזרקה	Hospira	NDC 0409-7953-03

זן של עכברים	מוכר	גיל משקל	מגדר, תגובות
C57BL/10	הרלן Sprague-Dawley	8-12 שבועות, 25-30G	תורמים זכר,
C57BL / 6	הרלן Sprague-Dawley	8-12 שבועות, 25-30G	, זכר התורם או המקבל