Solubilization ביו נטיה של נקודות קוונטיות ועל מבחני רעילות של חיידקים עקומת צמיחה הרוזן פלייט

סיכום

חלקיקים כגון מוליכים למחצה נקודות קוונטיות (QDs) ניתן להשתמש כדי ליצור סוכני photoactivatable עבור יישומים אנטי מיקרוביאליים או נגד סרטן. טכניקה זו מראה כיצד מים solubilize Telluride קדמיום (CdTe) QDs, להטות להם אנטיביוטיקה, ולבצע assay עיכוב חיידקי על בסיס עקומות גדילה ספירת צלחת.

תקציר

נקודות קוונטיות (QDs) הם חלקיקים מוליכים למחצה ניאון עם ספקטרום פליטת תלוי בגודל כי יכול להיות נרגש מתוך בחירה רחב של אורכי גל. QDs משכו הרבה עניין הדמיה, אבחון וטיפול בשל הקרינה בהיר, יציב שלהם ^{1,2 3,4,5.} QDs יכול להיות מצומדת למגוון ביולוגי פעיל מולקולות של קשירה חיידקים ותאי יונקים ^6.

QDs גם נחקר באופן נרחב כסוכני ציטוטוקסיות של סיכול ממוקד של חיידקים. הופעתם של זנים עמידים להתרבות חיידקים הוא הופך במהירות למשבר בריאות הציבור, במיוחד במקרה של פתוגנים גראם שליליים ^7. בשל אפקט ידוע מיקרוביאלית של ננו מסוימים, במיוחד AG, יש מאות מחקרים הבוחנים את הרעילות של חלקיקים חיידקים ^8. מחקרים חיידקים בוצעו עם סוגים אחרים של חלקיקים מוליכים למחצה, כמו גם, especially טיו ₂ ^9,10-11, אלא גם ZnO ¹² ואחרים כולל CuO ^13. השוואות של כמה זני חיידקים בוצעו מחקרים אלה, בדרך כלל משווים זן גראם שלילי עם גראם חיובי. עם כל החלקיקים האלה, מנגנונים של רעילות מיוחסות חמצון: או photogeneration של מינים החמצן מגיב (ROS) על ידי חלקיקים או שחרור ישיר של יונים של מתכות העלולות לגרום לרעילות חמצוני. אפילו עם חומרים אלו, תוצאות של מחקרים שונים נבדלים מאוד. בחלק מהמחקרים זן בדיקה חיובית גראם הוא מדווח רגיש יותר מ ¹⁰ גרם שלילי, במקרים אחרים זה ¹⁴ מול. מחקרים אלה נבדקו גם ^15.

בכל המחקרים nanoparticle, בהרכב החלקיקים, גודל, כימיה של פני השטח, מדגם הזדקנות / פירוט, ואת אורך גל, עוצמה, משך החשיפה לאור כל אלה יכולים להשפיע באופן דרמטי את התוצאות. בנוסף, synthesiתוצרי לוואי S ו ממיסים יש לקחת בחשבון ^{16 17.} תפוקה גבוהה בטכניקות ההקרנה יש צורך להיות מסוגל לפתח יעיל nanomedicine סוכנים חדשים.

QDs CdTe יש השפעות אנטי מיקרוביאליים ¹⁸ בלבד או בשילוב עם אנטיביוטיקה. במחקר קודם, הראינו כי צימוד של אנטיביוטיקה כדי CdTe יכול להגדיל רעילות לחיידקים אך להקטין רעילות לתאי יונקים, עקב ירידה בייצור של מינים החמצן מגיב מן conjugates ^19. אמנם אין זה סביר כי קדמיום המכילים תרכובות תאושר לשימוש בבני אדם, הכנות כאלה עלולים לשמש חיטוי של משטחים או עיקור של מים.

בפרוטוקול זה, אנחנו נותנים גישה ישירה אל solubilizing QDs CdTe עם חומצה mercaptopropionic (MPA). QDs מוכנים לשימוש בתוך שעה. לאחר מכן להפגין צימוד לסוכן מיקרוביאלית.

החלק השני של פרוטוקולמדגים assay עיכוב 96-גם חיידקי באמצעות QDs מצומדות ו unconjugated. צפיפות אופטית נקרא על שעות רבות, המתיר את ההשפעות של תוספת QD וחשיפה לאור לעבור הערכה מיידית, כמו גם לאחר תקופת ההחלמה. כמו כן, אנו ממחישים ספירת המושבה לכימות הישרדות חיידקים.

פרוטוקול

1. QD solubilization

מדובר בשיטה המתאימה CdTe. בשיטות דומות ניתן להשתמש בסוגים אחרים של QDs כגון InP / ZnS ²⁰ ו CdSe / ZnS ^21.

1. הכן פתרון של QDs CdTe ב טולואן ב 15 מיקרומטר (= צפיפות אופטית 2.5 בשיא אקסיטון 1).
2. העברת 200 μL של מניות זה לתוך בקבוקון זכוכית. אל תשתמש מפלסטיק!
3. הוספת 800 טולואן μL, 1 מ"ל של חיץ 200 מ"מ borate (pH 9) ו - 2 μL של חומצה M 11.5 mercaptopropionic (MPA).
4. מכסה בקבוקון ולנער אותו נמרצות על 30-60 שניות.
5. שלבי מימית ואורגנית-ממס יפרידו באופן ספונטני. השלב מימית תהפוך את הצבע של QDs את. כדי למנוע את השכבה טולואן, להסיר אותו וזורקים אותו. לאחר מכן להעביר את השלב מימית לתוך בקבוקון נקי.
6. לטהר את QDs solubilized על ידי שטיפה / סינון ארבע פעמים באמצעות μL 500, 10000 משקל מולקולרי הפסקת מסנן צנטריפוגות. מסננים את צריכה להיותהסתובב על XG 3000 במשך 13 דקות. לפחות שתי כביסות האחרונות, לשטוף עם המאגר הסופי הרצוי.
7. לאחר שטיפה של דבר להשעות את QDs שטף של חיץ 50 borate mM ב-pH הרצוי החנות ב 4 ° C. הם יהיו יציבים למשך 1-2 שבועות.
8. למדוד את ספקטרום הספיגה ופליטת להעריך ריכוז מבוסס על נוסחאות שפורסמו ^22.

תוצאות נציג: איור 1 מציג תמונה של QDs CdTe תחת תאורה מנורת UV, ספקטרום פליטה לפני ואחרי solubilization מים, מראה שינוי זניח מהבורסה הכובע. הערכים הם בגודל קוטר הליבה נמדד על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים.

2. הצמידה QD לאנטיביוטיקה

חלק זה של פרוטוקול ישים nanoparticle כל מים solubilized שלילי טעון, כולל QDs המסחריים, חלקיקי מתכת, ו ^-19 נוספים.

1. כל מולקולה יעבוד כי eithאה עצמית מרכיב את QDs solubilized שלילי, מטען, או שיש לו קבוצה תגובתי זה יכול להיות מצומדת, כגון אמין ראשוני. בדוגמה זו, אנו משתמשים polymyxin B (PMB), אשר טעונה חיובית עצמית מרכיב ללא צורך ריאגנטים הצמידה. ממיסים את PMB ב H ₂ O ב -60 מיקרומטר. (אם אנטיביוטיקה שנבחר אינו מסיס H ₂ O, מסיס DMSO או אתנול בריכוז 0.1-1 מ"מ). זה יהיה פתרון 10x (ב H ₂ O) או פתרון 100x (ממס).
2. לחשב כמה הפתרון QD תצטרך עבור הניסויים רעילות של חיידקים. על צלחת 96-היטב עם 0.3 מ"ל לכל היטב quadruplicates, 0.5 מ"ל של המצומד 200 ננומטר הוא זקוק. הכן שתי מבחנות המכילות 100 μL של 1 נקודות קוונטיות מיקרומטר חיץ borate 50 מ"מ.
3. אם צימוד אל אמין ראשוני, להכין 19 מ"ג / מ"ל (100 מ"מ) הפתרון של 1-אתיל-3-[3-dimethylaminopropyl] hydrochloride carbodiimide (EDC) של H ₂ O. EDC בתמיסה אינו יציב; להשתמש מיד ולזרוק את השאר.
4. הוסף 50 μL של פתרון אנטיביוטיקה 10x (ב H ₂ O) או 5 μL של פתרון 100x (ממס) על צינור הצמוד. עבור PMB: נטיה CdTe ביחס טוחנת של 30:1, להוסיף 50 μL של PMB 60 מיקרומטר. הוסף H ₂ O או ממס על צינור השליטה QD בלבד.
5. במידת הצורך, להוסיף 1 μL של פתרון המניות EDC אל הצינור הצמוד.
6. להעלות את נפח המצומד ל 0.5 מ"ל עם המאגר המתאים (borate חיץ או PBS, לא אמין המכילים מאגרי כמו טריס, כפי שהם ימנע EDC).
7. מגן צינורות של האור עם רדיד אלומיניום, ומניחים על nutator או הנדנדה HR 1. אם מתרחשת צבירה, חזור הצמידה עם ריכוזים נמוכים של אנטיביוטיקה. לכיל כלפי מעלה עד ריכוז החלקיקים לא במצטבר.
8. לשטוף את conjugates ידי עובר דרך מסנן מתאים. 10000 הפסקת משקל מולקולרי עובד לרוב אנטיביוטיקה, אבל לא חלבונים או נוגדנים.
בהתאם המולקולה, שיטות שונות שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את מספר מולקולות אנטיביוטיקה לכל QD: ספיגת הקרינה או ספקטרוסקופיה, ג'ל אלקטרופורזה, או התמרת אינפרא אדום ספקטרוסקופית (FTIR).

התוצאות מייצגות. בדוגמה זו, הצמידה PMB מאופיין על ידי שינויים ספקטרום פליטת QD. תרשים 2 מציג את הספקטרום של QDs CdTe בתוספת PMB.

3. הכנת חיידקים על מסך 96-היטב, קביעת IC לאנטיביוטיקה ₅₀

זה החל על כמעט כל זן חיידקי גדל במדיום המתאים ^18. פרק הזמן המדויק הנדרש ההקלטות צריך להמשיך תלוי בקצב התפתחות חיידקים. בדוגמה שלנו, אנו משתמשים Escherichia coli הגדלים מרק lysogeny (LB) בינוני.

1. על מנת לבחור את המתאימים ריכוזים לצמד QD, חשוב לדעתIC ₅₀ של אנטיביוטיקה להיות מצומדת ואם QDs בלבד רעילים. זה צריך להיות החלה 2 ימים לפני הניסוי הצמידה. בערב, 10 מ"ל של זרע בינוני התפתחות חיידקים מהמושבה טרי, באמצעות טכניקה סטרילית biosafety הנכון.
2. למחרת, 1-2 שעות לפני הניסוי, למלא את כל הבארות של צלחת 96-גם ברור התחתונה עם כמות מקסימלית של כ-בינוני צמיחה. באמצעות זרע רב, פיפטה כל טוב עם μL 1-50 של התרבות חיידקים (ריכוז יהיה תלוי כמה מהר זן מסוים גדל צריך להיות מכויל על ידי המעבדה שלך).
3. לשים את הצלחת על הקורא את הצלחת להגדיר את זה כדי לקרוא כל 10 דקות למשך 2 שעות באורך גל נקבע (בדרך כלל 600 ננומטר). לפקח על צלחת, כך החיידקים אינם גדלים צפופה מדי מהר מדי.
4. כאשר התאים מגיעים כל OD = 0.1-0.15, הסר את צלחת מן הקורא את הצלחת לעצור את ההקלטה.
5. הוספת התרופה לבד QDs לבדריכוזים שונים לפחות triplicates. השתמש צד אחד של הצלחת, כמו שליטה "אפל" ו 1 1/2 להיות מואר. פריסת הציע ניתנת באיור 3. הריכוזים צריך לכלול קשת רחבה דיה כדי לכלול ריכוז המעכבת את החיידקים מעט מאוד, ואף אחד שהורג את כולם.
6. להגן על הצד "האפל" של צלחת עם נייר אלומיניום. לחשוף את הצד השני מנורה באורך גל הרצוי. אנו משתמשים אישית 96-ובכן, 440 ננומטר המנורה עשוי 2.4 mW נוריות (איור 4), להקרין דקות 30-60. לוחות שחורים עם תחתית ברורים לעזור להגן על החיידקים שלא נחשפו מאור תועה. עמודה ריקה עשוי לשמש גם בין הצדדים חשופים ובלתי חשוף.
7. לאחר החשיפה לאור, לשים את הצלחת לקורא את הצלחת שיא OD 600 כל 10 דקות במשך 5-12 שעות, תלוי בקצב הצמיחה. לשמור על טמפרטורת <32 מעלות צלזיוס, אם אפשר למנוע ייבוש של התרבויות.
8. לשרטט את עקומות גדילהבנקודת הזמן שנבחר מול יומן [ריכוז] ולקבוע IC ₅₀ של אנטיביוטיקה באמצעות משוואת היל:

שם H הוא מקדם היל, y _מקס הוא הנקודה הגבוהה ביותר של צמיחה (באופן אידיאלי על רמה), ו-y _{דק 'היא} נקודת אפס, גם באופן אידיאלי על רמה. אין זה סביר כי QDs בלבד יראה הרבה רעילות לתאי על ריכוזי בשימוש, כך הערך לא ייקבע.

התוצאות מייצגות. בסוף התקופה הקלטה, בארות ברורים יציין מוות של תאים מלאה, שיפוע של צפיפות התאים אמור להופיע יחד להגדיל ריכוזים של התרופה. החיידק צריך להראות S בצורת עקומות גדילה (איור 5); את המיקום של הרמה המקסימלית תשתנה באופן משמעותי מן המתח למתח גם תלוי בטמפרטורה. נקודת זמן נתונה יכול להיותנבחר כנציג והערכים זממו לעומת התחבר [אנטיביוטיקה] לתת IC ₅₀ (איור 5 ב '). להערכת הרעילות QD, הישרדות מול התחבר [QD] יכול להיות גם זממו, אך השגת הריגת חיידקי משמעותי עם QDs לבד נדיר (איור 5 C).

4. הכנת חיידקים על מסך 96 גם עם אנטיביוטיקה / QDs

1. יום לפני הניסוי, 10 מ"ל הזרע של תרבות מהמושבה טרי לתוך המדיום עשיר המתאים, תוך שימוש בטכניקה סטרילית biosafety הנכון. המצומד QD-אנטיביוטי יש להכין ביום זה, אלא אם כן הוא יציב מאוד.
2. 1-2 שעות לפני הניסוי, למלא את כל הבארות של צלחת 96-גם ברור התחתונה עם כמות מקסימלית של כ-בינוני צמיחה. באמצעות זרע רב, פיפטה כל טוב עם μL 1-50 של התרבות חיידקים.
3. לשים את הצלחת על הקורא את הצלחת להגדיר את זה כדי לקרוא כל 10 דקות למשך 2 שעות באורך גל זהה בחלק 3.
4. כאשר התאים מגיעים כל OD = 0.1-0.15, הסר את צלחת מן הקורא את הצלחת לעצור את ההקלטה.
5. הוסף conjugates QD בריכוזים שונים ארבע פעמים לפחות. השתמש צד אחד של הצלחת, כמו שליטה "אפל" ו 1 1/2 להיות מואר. פריסת הציע ניתנת באיור 6. רצועת חיידקים בלבד השליטה תמיד צריך להיכלל בעיות במקרה של הטמפרטורה תרבות, וכו 'משפיעים על תנאי הגידול. רצועה אחת של התרופה בלבד, QD רק יש לכלול גם על מנת להבטיח כי הם תואמים את לוח הבקרה לעשות קודם לכן. שאר הבארות מחויבים conjugates כדי לאפשר סטטיסטיקות טובות.
6. להגן על הצד "האפל" של צלחת עם נייר אלומיניום. לחשוף את הצד השני מנורה באורך גל הרצוי.
7. לאחר החשיפה לאור, לשים את הצלחת לקורא את הצלחת שיא OD 600 כל 10 דקות במשך 5-12 שעות. לשמור על טמפרטורת <32 מעלות צלזיוס ואם אפשר להימנע ד"ריינג של התרבויות.

נציג תוצאות. השילוב של QDs ו אנטיביוטיות עלולים להיות רעילים פחות אנטיביוטיקה לבד; רעילים פחות, או רעיל יותר. ניתן לכמת באמצעות עקומות גדילה ו IC ₅₀ מדידות. איור 7 מציג דוגמה conjugates כי רעיל באותה מידה כמו אנטיביוטיקה בלבד, למשל של conjugates כי הם רעילים יותר.

5. הצלחת הרוזן

1. בחר אחד או יותר בארות של צלחת 96-שטופלה היטב כדי לשמש דילולים סדרתי והספירה נמשכת המושבה.
2. לעשות דילול הסידורי של כל אחד דגימות חיידקים נבחרים עם פתרון PBS או תמיסת מלח (0.9% NaCl). העברת 20 μL הפתרון חיידקים לדלל את זה עם הפתרון 180 מלוחים μL, לשנות את תמהיל, פיפטה עצה ולהעביר 20 μL של פתרון חיידקי בדילול מלא לפתרון 180 מלוחים μL. חזור 6 פעמים.
3. קח 10 μL מ דילול כל הצלחת על המתאים הצלחת התקשורת מוצק. 8 כל הריכוזים של מדגם אחד, אולי לא מצופה על צלחת עגולה 10 ס"מ פטרי, אם כי כלים מלבניים עדיפים כפי שהוא קל יותר להסתדר העניינים.
4. תנו לו להתייבש על הספסל במשך 15 דקות. ואז דגירה בטמפרטורה המתאימה חיידקים שלך במשך 16 שעות.
5. ספירת מושבות ולחשב יחידות המושבה להרכיב (CFU) על פי (# המושבות X גורם דילול) / נפח מצופה = CFU / mL.

איור 8 מראה צלחת CFU למשל.

6. נציג תוצאות

באיור 1. QDs CdTe. (א ') שמונה ההכנות של QDs CdTe מואר עם שרביט סגול (365 ננומטר). (ב) ו ספיגת פליטת הספקטרום של בחמישה גדלים שנבחרו לפני ואחרי solubilization מים. הקווים מקווקווים הם ספקטרום טולואן, קווי מוצקים הם במים.

files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg "/>
איור 2. ניתוח ספקטרלי וגם ג'ל של QD-PMB conjugates. אורנג' פולטות QDs CdTe שימשו בדוגמה זו, את ההשפעות על סוגים אחרים של QDs יהיה צורך להעריך עבור כל ניסוי. (א) ספיגת אופיינית (קו אפור) ואת פליטת הספקטרום (קו שחור) של QDs לפני הצמידה של PMB ואת פליטת (קו מקווקו) לאחר תוספת של 160 ושווי טוחנת של PMB. (ב) הקשר בין היחס של PMB ואת עוצמת פליטת QD (ריבועים) ואת שיא מיקום אורך גל (משולשים).

איור 3. הצעה פריסת צלחת צלחת צמיחה שליטה. מגוון רחב של ריכוזים PMB ו QD מיוצג. מחצית אחת של צלחת הוא מוקרן (מסומן בכחול), ו 1/2 זהה מוגן מפני האור. לחץ כאןכדי להציג דמות גדולה.

איור 4. 96-LED אישית מנורה הקרנה צלחת אחיד, מראה מראה לסירוגין. מנורה טיפוסית ידני UV עשוי לשמש גם, אבל לא יכסה את הצלחת כולה באופן אחיד.

איור 5. דוגמה תוצאות עבור צלחת צמיחה מלאה. (א) נציג עקומות התפתחות חיידקים עם ריכוזים סמים שונים, מ -0 עד להשלמת מוות של תאים. הסמלים הם פתוחים PMB רק עם ריכוזים נתון; הסמלים מוצקים הם CdTe-PMB ללא קרינה, וכן את 1/2 מלאות סמלים הם CdTe-PMB עם הקרנה. ההקרנה לא הייתה השפעה על PMB בלבד דגימות, כך עקומות אלה הושמטו לבהירות. כל PMB-CdTe conjugates הם 30:1 PMB: יחסי QD. (ב) מגרשים של ערכים עקומת גדילה ב 200 דקות לעומת התחבר [PMB] ו מתאים ל Eq. (1). כדי המשךרול את ההשפעות של אור, עקומת נעשה עם אנטיביוטיקה רק עם 30 דקות של חשיפה לאור. (ג) הישרדות חיידקי על 200 דקות לעומת ריכוז QD, באמצעות QDs CdTe. רעילות מסוימת נתפסת עם חשיפה לאור, אבל מעט מדי כדי לקבוע ערך IC _50. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

איור 6. הציע פריסה עבור הצלחת הבדיקה המצומד. 1/2 כחול מודגש הצלחת יש לחשוף לאור, ואת החצי unhighlighted מוגן. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

איור 7. דוגמה תוצאות עבור הצלחת הבדיקה המצומד. עקומת גדילה ערכים ב 200 דקות היו PLotted ו לנכון Eq. (1). (א) CdTe-PMB conjugates להראות עלייה רעילות על PMB לבד. (ב) nanoparticle זהב Au-PMB conjugates לא הראו רעילות מוגברת על PMB לבד.

איור 8. דוגמה צלחת CFU. א ' coli שנזרעו בצלחת 96-גם טופלה QD-PMB עם או בלי הקרנה למשך 30 דקות. מודגרות מכן במשך 4 שעות ב 32 מעלות צלזיוס. דילולים סידוריים של מדגם זה חיידקי נעשו עם תמיסת מלח, ו 10 μL של 100 X 10-X ⁷ דילולים היו מצופה על צלחות אגר. הצלחות היו מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס, מושבות נספרו לאחר 16 שעות. צלחת מציגה את דילולים לאורך השורות, כמצוין, העמודים הם: (א) 0.06 מיקרומטר PMB + 2 nM CdTe, (ב ') 0.12 PMB מיקרומטר + 4 nM CdTe (C) 0.2 מיקרומטר PMB + 6.7 nM CdTe, (ד) 0.06 מיקרומטר PMB + ננומטר 2 CdTe מוקרן, (ה) 0.12 מיקרומטר PMB + 4 nM CdTe מוקרן, (F) 0.2 מיקרומטר PMB + 6.7 nM CdTe irradiated.

דיון

חלקיקים מייצגים גישה מבטיחה יצירת אנטי מיקרוביאליים סוכנים חדשים. ניתוח עקומת הצמיחה היא דרך לעקוב אחר צפיפות תא החיידק שמבדיל תאים באופן פעיל גידול של צמיחה עכבות תאים. כאשר יחד עם ספירת צלחת, היא מאפשרת ניתוח מעמיק של הפוטנציאל של אנטיביוטיקה המצומד. פורמט 96-מאפשר גם וריאציות יחסית תפוקה גבוהה של ריכוז ומצבים אחרים כגון חשיפה לאור, זו האחרונה חיונית אור הפעיל סוכנים כגון נקודות קוונטיות. וריאציות רבות על גישה בסיסית זו אפשריים, מה שהופך אותה שיטה צדדי nanotoxicology.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם	חברה	מספר קטלוגי	הערות (לא חובה)
Borate רכיב מאגר # 1	דיג	חומצת בור, 74-1
Borate רכיב מאגר # 2	Sigma-Aldrich	נתרן Tetraborate B9876
MPA	Sigma-Aldrich	M5801
Vivaspin 500	GE Healthcare	28-9322	MWCO השונים זמין
צלוחיות זכוכית	דיג	03-338C
EDC	Sigma-Aldrich	E6383
Polymyxin B	Sigma-Aldrich	P1004
חיידקי גרםowth בינוני (LB) רכיב # 1	דיג	NaCl S271
צמיחה בינונית רכיב חיידקי (LB) # 2	BD	Tryptone 211705
בינוני התפתחות חיידקים (LB) Component # 3	BD	תמצית שמרים 211929
מנורה חשיפה לאור	מנהג
ברור-96-התחתונה גם צלחות	דיג	07-200-567 07-200-730 או
הקרינה ספקטרומטר	התקנים מולקולריים
הצלחת ספיגת הקורא	התקנים מולקולריים
BactoAgar מדיה מוצקים	Bioshop	AGR001.1
צלחות פטרי סביב	דיג	08-75-12
פטרי כלים מלבניים	דיג	08-757-11A