קטרקט הוא הסיבה המובילה לעיוורון בעולם. קרינת אולטרה סגולה שמש (UVR) הוא גורם הסיכון העיקרי להתפתחות קטרקט. מודל חיה של הרבה UVR-B המושרה קטרקט פותח. במאמר זה אנו מתארים שיטות לחקירה של היווצרות קטרקט: חשיפה לUVR, כמותית RT-PCR ואימונוהיסטוכימיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
קטרקט הוא הסיבה המובילה לעיוורון בעולם 1. ארגון הבריאות העולמית מגדיר את הקטרקט כערפול של עדשת העין שמעכבת את ההעברה של אור. קטרקט הוא מחלה רבה עצרת קשורה עם סוכרת עישון קרינה, אולטרה סגול (UVR), אלכוהול, קרינה מייננת, סטרואידים ויתר לחץ דם. יש ראיות 2-4 ניסיוניות ואפידמיולוגי חזקות 5,6 שUVR גורם קטרקט. פתחנו מודל חיה לUVR B מושרה קטרקט בשני 7 מורדמים וחיות שאינן מורדמות 8.
התרופה היחידה לקטרקט היא ניתוח, אבל הטיפול הזה אינו נגיש לכל. ההערכה הוא, כי עיכוב של הופעת הקטרקט במשך 10 שנים יכול להפחית את הצורך בניתוח קטרקט על ידי 50% 9. כדי לעכב את השכיחות של קטרקט, הוא נחוץ כדי להבין את המנגנונים של היווצרות קטרקט ולמצוא strat מניעה היעילהegies. בין המנגנונים להתפתחות קטרקט, אפופטוזיס ממלא תפקיד מכריע בייזום של קטרקט בבני אדם ובעלי החיים 10. ההתמקדות שלנו הייתה לאחרונה אפופטוזיס בעדשה כמנגנון לקטרקט פיתוח 8,11,12. זה צפוי כי הבנה טובה יותר של ההשפעה של UVR על מסלול אפופטוזיס תספק אפשרויות לגילוי של תרופות חדשות למניעת קטרקט.
במאמר זה, אנו מתארים כיצד קטרקט יכול להיגרם על ידי ניסוי בחשיפת vivo לUVR-B. בהמשך RT-PCR ואימונוהיסטוכימיה מוצגים ככלים ללמוד מנגנונים מולקולריים של UVR-B המושרה קטרקט.
פרוטוקול
1. חשיפה לקרינת אולטרה סגולה
- 15 דקות לפני החשיפה, להרדים חולדת נקבת ספראג-Dawley בתערובת של 90 מ"ג / קילו Ketalar (קטמין) ומ"ג / הק"ג Rompun 10 (xylazine) על ידי הזרקת intraperitoneal.
- הנח את החיה בעוצרת חולדה ולהדק את החגורות עד קיבוע של העכברוש מבלי לגרום לסחוט גזע 13.
- להנחיל Mydriacyl (tropicamide), 10 מ"ג / מ"ל, בשתי עיניה של חיה כדי לגרום mydriasis.
- הנח את החיה, כך שעין אחת ממוקמת על קורה צר של UVR ב 300 ננומטר 14 עם רוחב 10 ננומטר בחצים המרביים ולגונן על העין הנגדית בסרטים שחורים.
- לחשוף את החולדה באופן חד צדדי לסף תת מינון 1 kJ / מ 2 UVR-B ב 300 ננומטר ל15 15 דקות.
2. בתור
- לאחר הפסקת חשיפת הודעה שנקבעה מראש (1, 5, 24 ו 120 שעות), להקריב את העכברוש הזקן של שישה שבועות (משקל <200 ג') על ידי carboחנק n דו ופריקה של חוליות הצוואר.
- עיני Enucleate. לאחר מכן, הכניס את קרנית העין למטה, בצד אחורי למעלה. ואז, אגרוף חור מינימאלי על ידי יישום צינורית מד 27 ולדחוף את נקודת השקה אחת ללובן העין כדי למנוע ניזק לעדשה שהיא מאוד קרוב ללובן העין. לאחר מכן, השתמש במספרי ניתוחים לרפואת עיניים לחתוך circumferentially ממש מאחורי גובל עד החלק האחורי של לובן העין יכול להיות המריא. לאחר מכן, הרם את העדשה עם מלקחיים מעוקלים בוטים.
- הסר שאריות של גוף ריסי מקו משווית העדשה תחת מיקרוסקופ, שמירה על העדשה בתמיסת מלח מאוזנת לא יותר מדקות 5-10.
3. כמותית RT-PCR
- הנח עדשות בתערובת של חיץ 350 μl RA1 תמוגה (NucleoSpin רנ"א השני סך רנ"א בידוד ערכה) וβ-mercaptoethanol μl 3.5 בצינור 2 מ"ל אפנדורף.
- לשמור את העדשה בתמהיל זה במהלך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- הומוגני העדשה עםמחט עד גרעין קשה בלבד של העדשה לא מהעדשה (קורטקס והקפסולה של העדשה lysed במאגר תמוגה). הסר את הגרעין מהתערובת.
- דגימות חנות באופן מיידי ב -70 ° C.
- הפשר את הדגימות ובצעו את הפרוטוקול "טיהור סה"כ RNA מן התאים ורקמות בתרבית" (NucleoSpin רנ"א השני סך רנ"א בידוד ערכה).
- דגימות RNA חנות ב -70 ° C.
- כדי לוודא הסרה מספקת של דנ"א מכל מדגם, לרוץ PCR בתנאים הבאים (שלב 1: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; שלב 2 במשך 40 מחזורים: 95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 72 ° צלזיוס במשך 20 שניות; שלב 3: 72 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות) עם פריימרים ספציפיים DNA p53, קדימה 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'ו5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3 הפוכים "וDNA פולימראז תקי (dNTPack), בהתאם לייצור פרוטוקול. מוצר ה-PCR הצפוי הוא 243 זוגות בסיסים.
- הפעל 1.5% ג'ל אלקטרופורזה agarose לזהות מוצר ספציפי PCR DNA של 243 זוגות בסיסים. כדי להכין1.5% agarose ג'ל בTBE חיץ לקחת 3.75 גרם של agarose ולפתור אותה ב250 מ"ל של חיץ TBE. הוסף ethidium ברומיד (0.5 מ"ג / מ"ל) 500 μl ב500 מ"ל של 1.5% פתרון ג'ל agarose. מחמם את התערובת במיקרוגל ומערבב אוון לפתור agarose.
אף אחת מהדגימות יש לחשוף את כל מוצרי ה-PCR DNA ספציפיים על 1.5% ג'ל אלקטרופורזה agarose.
- למדוד את הריכוז של דגימות RNA (μl 1) והיחס של ספיגת מדגם ב 260 ננומטר (RNA) ו 280 ננומטר (חלבון) בספקטרופוטומטר NanoDrop ND-1000. אם היחס רנ"א לחלבון של ספיגת מדגם RNA הוא 2.0 או יותר ואז מדגם RNA הוא טהור. אם היחס של ספיגת מדגם RNA הוא נמוך יותר מאשר 2.0, לעשות שוב RNA צעד טיהור 3.5.
- קח נפח של מדגם RNA מקביל למיקרוגרם 1 ולסנתז cDNA בעקבות ערכת פרוטוקול 1 st סטרנד cDNA הסינתזה (ערכת 1 st סטרנד cDNA סינתזה לRT-PCR).
- לאחסן דגימות cDNA ב -20 ° C(לתקופה של 1 שנה ויותר, בחנות ב -70 ° C).
- הפעל PCR כמותית בזמן אמת במערכת iCycler MyiQ יחידה צבע בזמן אמת PCR לזיהוי. עומס triplicates על צלחת 96 היטב עם מדגם 1 μl cDNA, TaqMan ביטוי גני מאסטר מיקס, Assay ביטוי גני TaqMan ל3 caspase, על פי הוראות לייצור. עומס triplicates על צלחת 96 היטב אחרת עם מדגם 1 μl cDNA, TaqMan ביטוי גני מאסטר מיקס, Assay ביטוי גני TaqMan ל18s, על פי הוראות לייצור (פרוטוקול Assay ביטוי גני TaqMan). לדלל בסדרת שבריר של cDNA משלוש עדשות שאינן חשופות נבחרו באקראי. הפעל דילולים סידוריים יחד עם cDNA מדגימות בצלחת 96 היטב.
- השתמש בשיטת עקומת הסטנדרט לכימות של התוצאות. מספר המחזורים בפלואורסצנטי הסף משמש כמדידה בתוכנת MyiQ. עקומת סטנדרט מבטא מספר המחזורים בסף כפונקציה של ריכוז יחסי של כיל היא established לדילולים הסידוריים בכל צלחת. cDNA משלוש דגימות עדשה טופלו אינן שמש לכיול. מתייחס למספר הסף של מחזורים לכל דגימה לעקומה הסטנדרטית כדי להשיג את הריכוז היחסי של מדגם cDNA נמדד. לבסוף, לקבל את רמת ביטוי של גני המטרה בהבאת הריכוז היחסי של יעד cDNA ל18s הבקרה הפנימי cDNA.
4. Immunohistochemical המכתים
- קבעון
- לנתח את העין ב PBS (Buffered Saline פוספט; pH 7.4).
- שים עין בצינור מלא paraformaldehyde 4% (PFA) בקור קרח במשך 20 דקות. הכן 4% PFA היום קודם לכן. חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. PFA הוא טרי במשך כשבוע.
- הסר PFA עם micropipette. לאחר מכן, לשטוף עם הקרח הקר PBS במשך 20 דקות.
- שים עין ב30% סוכרוז ב4 ° C במשך הלילה.
- שים עין בכוס מלאה בטמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר)-בינונית (רקמות-Tek). שים עין בעמדה מתאימה לחתך.
- הקפא באוקטובר בינוני על קרח יבש.
- חנות ב -70 ° C עד שימוש.
- קטגוריות קיימות
- מקם את עין cryo-החתך במטוס מתאים.
- אותו שלושה סעיפים 5 אמצע sagittal עבים מיקרומטר מחלק מרכזי של כל עדשה. השלך לפחות 6 חלקים בין חלקים רציפים, כדי למנוע הכתמה אותו הגרעינים בסעיפים שונים.
- ברגע שסעיף נחתך, מניחים בעדינות שקופיות על גבי זה. הסעיף צריך אז לתקוע לשקופית.
- השאר את השקופיות לייבוש באוויר לפני השימוש. שקופיות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד הצורך.
- פלואורסצנטי אימונוהיסטוכימיה
- בואו דגימות להשיג טמפרטורת חדר (5-10 דקות).
- צייר קצוות סביב דגימות עם PAP-עט (Invitrogen).
- בואו הגבול יבש לזמן (10 דקות).
- תייג את שקופיות מיקרוסקופ.
- Rehydrate ב1 × PBS במשך 15 דקות.
- Permeabilize בפתרון בלוק סטנדרטי למשך 30 דקות.
- הוסף נוגדן ראשוני (הארנב caspase-3 polyclonal, בקע נוגדן Asp175 9661; טכנולוגית איתות תא, Inc) דילול 1:3,000 בפתרון בלוק סטנדרטי.
- חנות בתא humidified ב4 ° C במשך הלילה.
- שטוף ב PBS על ידי pipetting (3 × 5 דקות) או על ידי טבילה באמבטיה גדולה (> 15 דקות, 1-2 שינויים).
- הוסף נוגדן שניוני (נוגדן אנטי משני ארנב עם ספקטרום ספציפי קליטה / פליטה) דילול 1:300 בפתרון הבלוק הסטנדרטי.
- שטוף ב PBS על ידי pipetting (3 × 5 דקות) או על ידי טבילה באמבטיה גדולה (> 15 דקות, 1-2 שינויים).
- נגב את משטח פאפ-עט.
- אחסן בתא humidified בטמפרטורת חדר למשך 3 שעות. הימנע מחשיפה לאור.
- הוסף טיפת Vectashield ולמקם את תלוש כיסוי בשקופית. הימנע עושה בועות.
- בואו Vectashield להקשיח (~ 20 דקות).
- שמור לי קטעיםn החושך עד ניתוח.
- כל סעיפי הבקרה מעובדים בהעדר הנוגדן ראשוני.
- חפש את התוצאות בתוך כמה שעות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- ספירת גרעיני תאי אפיתל 'מקידה גרעינית צד אחד לקשת גרעינית הצד השנייה של כל עדשה. להחיל את המסנן הכחול הסטנדרטי כדי לראות את כל גרעיני עדשת אפיתל בכחול ומסנן סטנדרטי שמתאים לפליטה של הנוגדן המשני כדי לראות גרעינים החיוביים caspase-3 בירוק.
- רשום את המספר של כל גרעיני אפיתל העדשה ומספר הגרעינים חיוביים. ספירת התאים שלוש פעמים לכל מקטע.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המקורות השונים של שונות במדידות נאמדו בניתוח שונה ונמצא כי שוקל שלוש מדידות לבעלי חיים שונים למדידות הייתה על הסדר של 15% כי לבעלי חיים. לפיכך, בהתחשב בניתוח עדשה כולה, לא ניתן להגדיל את הדיוק. בדיקות אורתוגונלית הובהרו ניגוד מובהק ל- 3 caspase מסר בין מרווח 120 שעתי השהיה לעומת מרווחי השהיה קצרות יותר.
בחשיפת UVR vivo גורם ביטוי caspase-3.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מאמר זה מתאר שיטות המאפשרות לימוד אירועים מולקולריים המתרחשים במהלך UVR-B המושרה קטרקט.
בהתחשב, כי רוב המידע זמין לin vivo UVR המושרה קטרקט נגזר מניסויים בבקן ספראג-Dawley 7 חולדות, 16, 17, 18, 19, החליט להשתמש בעכבר לבקן ספראג-Dawley במחקר הנוכחי. הגיל של החולדות היה שישה שבועות ישן. המגדר נבחר להיות נשי כי, בניגוד לגברים, לנשים יש פחות שתן אלרגני. יתר על כן, אין הבדל במגדר ביחס לחומר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי קרולינסקה KID-מימון הרשות, השבדית להגנה מפני קרינה, קרולינסקה עין קרן מחקר, אקדח och רטיל Stohnes Stiftelse, סנט אריק עין חולי קרן המחקר, Ögonfonden, Konung גוסטב החמישי: של och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם המגיב | חברה | מספר קטלוגים | תגובות (אופציונלי) |
| Ketalar | פייזר | 150086 | 50 מ"ג / מ"ל |
| Rompun | אייר | 022545 | 20 מ"ג / מ"ל |
| סימפלקס Oculentum | Apoteket, שוודיה | 336164 | 5 גרם |
| Mydriacyl | אלקון | 00352 | 10 מ"ג / מ"ל |
| תמיסת מלח מאוזנת | אלקון | 0007950055 | |
| 3.5 ul β-mercaptoethanol | |||
| NucleoSpin רנ"א השני סך רנ"א בידוד הערכה | Macherey-נגל GmbH & Co, דארן, גרמניה | 740955.50 | |
| פריימרים ספציפיים DNA p53 | biomers.net GmbH | Custom made | |
| פולימראז תקי-DNA, dNTPack | רוש | 04 728 866 001 | |
| Agarose | סיגמא | A5093 | |
| פתרון רומיד ethidium 0.5 מ"ג / מ"ל | סיגמא | E1385 | |
| Nano-Drop ND-1000 ספקטרופוטומטר | מוצרי NanoDrop | ||
| ערכת 1 st סטרנד cDNA סינתזה לRT-PCR (AMV) | רוש האבחון GmbH | 11 483 188 001 | |
| מערכת iCycler MyiQ יחידה צבע בזמן אמת PCR זיהוי | Bio-Rad Laboratories | ||
| צלחת 96-היטב | Sarstedt | 72.1979.202 | |
| מיקס מאסטר ביטוי גני TaqMan | אפלייד Biosystems | 4369016 | |
| Assay ביטוי הגנים TaqMan ל3 caspase | אפלייד Biosystems | Rn00563902_m1 | |
| Assay ביטוי גני TaqMan ל18s | אפלייד Biosystems | Hs99999901_s1 | |
| MyiQ תוכנה | Bio-Rad Laboratories | ||
| caspase-3 בקע (Asp175) | טכנולוגיית תא איתות | 9661 | |
| נגד הארנב IgG | Abcam | Ab6798 | |
| סוכרוז | סיגמה אולדריץ | 84097 | |
| Vectashield | מעבדות וקטור | ||
| יוניברסל מיקרוסקופ Axioplan 2 דימות | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | סיגמה אולדריץ | 441244 | |
| חיץ 10x TBE | Promega | V4251 |
מקורות
- Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
- Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
- Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
- Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
- McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
- Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
- Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).
- Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
- McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
- Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
- Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
- Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
- Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
- Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
- Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
- Löfgren, S. Cataract from ultraviolet radiation. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).
- Ayala, M. N. Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
- Dong, X. Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
- Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
