באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Summary

המתואר כאן טכניקה כיום בשימוש שגרתי לבודד קשורות ביציבות הריבוזום מתחמי הרשת המתהווה (RNCs). שיטה זו מנצלת את הגילוי כי 17 חומצות אמינו ארוכה SecM "מעצר רצף" יכול לעצור את התארכות תרגום פרוקריוטים ( א ' coli) המערכת, כאשר מוכנס לתוך (או התמזגו למסוף-C) של חלבון כמעט בכל.

Abstract

מחקר מקיף סיפקה ראיות בשפע טוען כי קיפול חלבונים בתא הוא תהליך שיתוף translational ^1-5. עם זאת, המסלול המדויק שרשרת פוליפפטיד כדלקמן במהלך קיפול שיתוף translational להשיג טופס הפונקציונלי הוא עדיין חידה. על מנת להבין את התהליך הזה כדי לקבוע את הקונפורמציה המדויק של שיתוף ביניים של תרגום מתקפלים, חשוב לפתח שיטות המאפשרות בידוד של RNCs שנשאו רשתות המתהווה בגדלים קבועים מראש על מנת לאפשר ניתוח מבנית נוספת שלהם.

SecM (צג הפרשת) הוא 170 חומצות אמינו א ' coli חלבון המווסת את ביטוי של ATPase במורד הזרם (נהיגה הפרשת) SecA ב operon secM-secA ^6. Nakatogawa ו איטו במקור נמצא כי רצף 17 חומצות אמינו ארוכה (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) באזור C-terminal של החלבון SecM מספיק וצריךכי השתהות של התארכות SecM ב Gly165, ובכך לייצר peptidyl-glycyl-tRNA קשורה ביציבות אל ריבוזומלי P-האתר ^7-9. יתרה מכך, נמצא כי 17 זה רצף חומצות האמינו זמן רב ניתן קיבע את הסופית-C של חלבון כמעט בכל באורך מלא ו / או מקוצר ובכך מאפשר ייצור של RNCs שנשאו רשתות המתהווה בגדלים קבועים מראש ^7. לכן, כאשר התמזגו או מוכנס לתוך היעד החלבון, רצף SecM מייצר השתהות מעצרו של התארכות שרשרת פוליפפטיד ומייצר RNCs יציבים הן in vivo של א ' קולי תאים במבחנה במערכת התא ללא. שיפוע צנטריפוגה סוכרוז הוא מנוצל יותר לבודד RNCs.

RNCs את בודדים ניתן לנתח מאפיינים מבניים ותפקודיים של שיתוף ביניים של תרגום מתקפלים. לאחרונה, טכניקה זו שימשה בהצלחה להבנה טובה של המבנה של הריבוזום שרשראות כמה המתהווה קשורות ^10,11. כאן אנו מתארים את הבידוד של Crystallin שור Gamma-B RNCs התמזגו כדי SecM ו שנוצר במערכת בתרגום חוץ גופית.

Protocol

1. תבנית ה-DNA הכנה בתעתיק חוץ גופית

1. הגן של הריבית לשכפל בכל T7 ו / או למשל SP6 האמרגן מבוסס פלסמיד. כדי להשיג RNCs של עניין, C-הסופית של יעד פוליפפטיד הוארך על ידי הוספת התרמה מעצר רצף של SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP ^7. על מנת להבטיח כי שבר פוליפפטיד מעניין יהיה extrude מתוך המנהרה ריבוזומלי, החלק C-טרמינל של חלבון המטרה צריכה להיות מורחבת על ידי לפחות 30 חומצות אמינו ^12-14. מקשר גליצין, סרין גמישה עשיר יכול להיות מוצג בין חלבון לבין רצף מעצר SecM כדי למנוע אילוצים קונפורמציה אפשריים.

Discussion

לקבלת תוצאות לשחזור, איכות ריכוז המרכיבים המשמשים ב שעתוק במבחנה התרגום הן קריטיות. השתמשנו זמינים מסחרית שעתוק במבחנה תמציות תרגום והם נותנים תוצאות יעיל לשחזור, אם מטופל בזהירות. האיכות של ה-mRNA יכול להשפיע על התרגום, ולכן הוא בעל חשיבות עליונה לבחון את שלמות ה-mRNA לפני השימוש בו בתרגום חוץ גופית. זמן הדגירה של בתרגום חוץ גופית משתנה עם אורך של החלבון. כמו כן, זמן / מהירות צנטריפוגה יכול להיות בהתאם, במקרה.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב / Kit	חברה	מספר קטלוגי
MEGAscript T7 ערכת גבוהה תמלול תשואה	Ambion	AM1333
RTS 100 E.coli ח.י. Kit	5 ראש	2401100
Ribonuclease אינהיביטור	Invitrogen	15518012
חוצה [35 S]-Label	מגה פיקסל Biomedicals	0151006
Amicon Ultra-4 יחידת מסנן צנטריפוגלי	Millipore	UFC801008
אחסון זרחן autoradiography	GE Healthcare	טייפון 9410 במצב משתנה imager
שיפוע צפיפות חלוקה מערכות	Teledyne Isco, Inc	ISCO צפיפות לתכנות Gradient מערכת
סוכרוז צבע CENtrifugation	Beckman Coulter	אופטימה L-90 K ultracentrifuge preparative