Method Article

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב חיידקי Escherichia באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

DOI:

10.3791/4057

⸱

November 12th, 2012

 ,  ,  ,  , 
1Banting and Best Department of Medical Research, Donnelly Centre, University of Toronto, 2Deparment of Biochemistry, Research and Innovation Centre, University of Regina, 3Department of Medical Genetics and Microbiology, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח לחיידק חיידקי Escherichia שיכול לשמש לבודד ולאפיין קומפלקסים יציבים רב חלבון להומוגניות קרובה אפילו החל מלהעתיק מספרים נמוכים לתא.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאחר שרוב התהליכים תאיים מתווכים על ידי אסיפות macromolecular, זיהוי השיטתי של אינטראקציות בין חלבונים (PPI) וזיהוי של רכב המקטע של חלבון רב קומפלקסים יכולים לספק תובנות לגבי תפקוד גן ולשפר את ההבנה של מערכות ביולוגיות 1, 2. אינטראקציות גופניות יכולות להיות ממופות עם בידוד גבוה ביטחון vialarge היקף ואפיון של קומפלקסי חלבונים אנדוגניים בתנאים כמעט פיסיולוגיים המבוססים על טיהור זיקה של חלבונים מתויגים-כרומוזומלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS). גישה זו יושמה בהצלחה באורגניזמים אבולוציונית מגוונים, כולל שמרים, זבובים, תולעים, תאי יונקים, וחיידקים 1-6. בפרט, לנו שנוצרנו מערכת תיוג כפולה זיקת Carboxy-מסוף פפטיד סדרתית (SPA) לקומפלקסי חלבוני ילידי זיקה לטיהור מחיידקי Escherichia גרם שלילי בתרבית, באמצעות geזני netically-צייתנים מארחים מעבדה שמתאימה היטב לחקירות הגנום של הביולוגיה הבסיסית ותהליכים משתמרים של 1 פרוקריוטים, 2, 7. מערכת ספא התיוג שלנו היא מקבילה לשיטת טיהור הזיקה מקביל פותחה במקור עבור שמרים 8, 9, והוא מורכב מcalmodulin מחייב פפטיד (CBP) ואחריו אתר המחשוף לטבק וירוס לחרוט (TEV) פרוטאז מאוד הספציפי ושלושה עותקים דגל epitope (FLAG 3X), ומאפשר לשני סיבובים רצופים של העשרת זיקה. לאחר הגברת קלטת, מוצרי PCR יניארי רצף ספציפי קידוד SPA-התג וסמן בחירה משולבים ובאים לידי ביטוי במסגרת כמו fusions Carboxy-מסוף בDY330 רקע שמושרה transiently לבטא מערכת יעילה ביותר Heterologous bacteriophage מבדה רקומבינציה 10. טיהור כפולה צעד בעקבות שימוש בחרוזי זיקה אנטי FLAG calmodulin ומאפשרת סלקטיביתוהחלמה יעילה של קומפלקסי חלבונים אפילו שפע נמוכים מתרבויות בקנה מידה גדולה. טנדם ספקטרומטריית מסה לאחר מכן נעשתה שימוש כדי לזהות את החלבונים ביציבות שיתוף לטיהור עם רגישות גבוהה (מגבלות זיהוי Nanogram נמוכות).

כאן, אנו מתארים את תהליכי צעד אחר צעד מפורטים אנחנו בדרך כלל משתמשים לתיוג חלבון, טיהור ושיטתית ניתוח ספקטרומטריית מבוססת של קומפלקסי חלבונים מסיסים מE. חיידק, שניתן לשנות את הגודל ופוטנציאל מותאם למיני חיידקים אחרים, כוללים פתוגנים מסוימים אופורטוניסטיים נוחות לrecombineering. האינטראקציות הפיזיות הנובעות לעתים קרובות יכולות לחשוף מרכיבים בלתי צפויים וחיבורים מעניינים המצביעים על קישורים מכניסטית רומן. אינטגרציה של נתוני PPI עם נתוני עמותה מולקולריים חלופיים כגון אינטראקציות גנטיות (גני גן) וגנומי להקשר (GC) תחזיות יכולות להקל הבהרה של הארגון המולקולרי הגלובלי של מתחמים רבים בחלבונים בתוך דומסלולי ological. הרשתות נוצרו עבור E. coli ניתן להשתמש כדי לקבל תובנה האדריכלות הפונקציונלית של מוצרי הגן orthologous בחיידקים אחרים שלהסברים פונקציונליים כרגע חסרים.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בניית SPA תיוג ג'ין הספציפי בE. DY330 זני חיידק

  1. PJL148 פלסמיד הכולל את רצף הדנ"א SPA-תג וקלטת kanamycin אנטיביוטיקת התנגדות סמן (קאן R) משמש כתבנית בתגובת שרשרת פולימרז (PCR) הגברה 7. פריימר 45 nt גן ספציפי קדימה, הממוקם באופן מיידי במעלה זרם של קודון עצירת גן המטרה במסגרת עם 27 פריימר נ"ב (-3 5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG ') תג מסוים קדימה, ופריימר 45 nt גן ספציפי הפוך, הממוקמים באופן מיידי במורד זרם של קודון עצירת גן המטרה במסגרת עם פריימר הפוך תג מסוים 27 נ"ב (-3 5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT '), משמש כדי להגביר SPA-התג וקלטת R קאן מpJL148 באמצעות התנאים הבאים PCR האופניים: 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, 55 ° C עבור 1 דקות, 68 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות 10 שניות, ואחריו 68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. רצפים אלה משמשים מוגבריםשל מצעים לλ-Red ההומולוגי רקומבינציה המכונות הציגו ectopically (ראה להלן).
  2. מוצר ה-PCR הוא מטוהר באמצעות ערכת טיהור PCR Qiaquick להסיר מלחים שעשויים להפריע לelectroporation. מוצר ה-PCR המטוהרים הוא ממוקד לאחר מכן לשלב בקצה 3 '(מייד במעלה זרם של קודון העצירה המקורית) של גן ספציפי בDY330 מתח שבו מכונות רקומבינציה-λ האדומות באו לידי ביטוי 10.
  3. DY330 הזן מבטא λ-האדום הוא גדל בלילה 2 וריא-Bertani בינוני מ"ל (LB) בשעת 32 ° C על ידי רועד ב 180 סל"ד. 1 מ"ל של תרבות הלילה הוא מחוסן לאחר מכן לתוך מדיום LB 70 מ"ל טרי בבקבוק 500 מיליליטר חרוטים. הבידוד הוא גדל ב 32 ° C על ידי רועד ב 180 סל"ד עד 600 OD מגיע ~ 0.8.
  4. התרבות מועברת לבקבוק 250 מיליליטר חרוטים טרי, שבו התאים הנגרמים על ידי דוגר את הבקבוק באמבט מים ב 42 ° C על ידי רועד בעדינות180 סל"ד במשך 15 דקות. מייד לאחר הגיוס, שמכל ההדגרה באמבט מי קרח slurry לפחות 30 דקות עם רעד.
  5. התרבות הקרה כקרח מועברת באופן מיידי לצינור פוליפרופילן מראש מקורר 50 מ"ל ונתונים לצנטריפוגה XG ב 3993 עבור 6 דקות ב 4 ° C. התא הגלול הוא resuspended במי 50 מ"ל קר כקרח סטרילית וcentrifuged שוב ב3993 XG ל6 דקות ב 4 ° C. התא היא גלולה אז resuspended ב 1 מ"ל של מים קרים והועברה לצינור 1.5 מ"ל Effendorf, וcentrifuged במהירות מרבית ל20 שניות ב 4 ° C. לאחר שניים או שלושה צעדי שטיפה במים קרים כקרח, התא הגלול הוא resuspended לבסוף ב700 μl של מים סטריליים קרים כקרח, וכתוצאה מכך תאי אלקטרו מוסמכים.
  6. באמצעות electroporation, μl אחד amplicon המטוהר מוחדר 40 μl של תאי אלקטרו המוסמכים. תאי electroporated בBio-Rad GenePulser שני עם ההגדרות הבאות: 2.5 ק, 25 μF עם דופקבקר של 200 Ω. לאחר הומולוגיים רקומבינציה ואינטגרציה, את transformants שrecombined התג / קלטת לכרומוזום בהצלחה הם מבוססים על התנגדות לקאן (איור 1 א). transformants המרובה נבחר למערב סופג כדי לאמת את הדור הנכון (כלומר איתות חיובית) של ספא בתיוג חלבוני היתוך עם נוגדן אנטי-M2 דגל שהוא סלקטיבי נגד אפיטופים דגל SPA-התג.
  7. זן אשר Carboxy מסוף SPA-תג היתוך בתרבית בקנה מידה גדולה לבודד מתחמי חלבון מסיסים מתאים נקצרו באמצעות פרוטוקול טיהור הספא. המתווה של השלבים הכרוכים בהליך טיהור תג הזיקה מוצגת בתרשים 1B.

2. Culturing וSonication

  1. לחסן 100 μl של ה-SPA מתויג מניית גליצרול coli לתוך 50 מיליליטר מרק נהדר (TB) נוזל בתוספת 50 μl של 25 מיקרוגרם / המ"ל oפתרון f קאן בבקבוק 250 מיליליטר חרוטים. לגדול תרבות הלילה ב 32 ° C.
    הערה: מאחר שהקלטת האדומה טמפרטורה המושרית λ במתח DY330 היא תחת השליטה של repressor רגיש לטמפרטורה 10, זן ספא מתויג-E. coli הוא גדל ב 32 ° C.
  2. העברת 10 מ"ל של תרבות הלילה לשחפת טריה 990 מ"ל בתוספת 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​של קן בבקבוק 4 ליטר. התרבות היא גדלה ב 32 ° C עם הרעד קבוע ב 250 סל"ד, ל5-6 שעות, עד שמגיע לOD 600 ~ 2 עד 3.
  3. להעביר 1 הליטר E. coli תרבות ספא תג לנקות בקבוקי צנטריפוגה ולסובב את התאים ב 4 ° C בקמן J6-HC צנטריפוגה @ 3993 XG במשך 15 דקות.
  4. Supernatant הוא להסיר את בקבוקי צנטריפוגה. Resuspend E. כדורים סלולריים coli עם 25 מ"ל של חיץ sonication. ודא לשמור את בקבוקי צנטריפוגה על קרח בכל העת.
  5. Resuspended הגלולה היאהועבר לצינור 50 מ"ל פוליפרופילן פלקון והוקפא באמצעות חנקן נוזלי. התאים הקפואים מאוחסנים ב-80 ° C לשימוש לטווח ארוך.
  6. לפני sonication, להפשיר את התאים הקפואים לחלוטין על ידי שמירה על את הכדורים על קרח. הפשירו הדגימות מועברות לכוס נירוסטה סטרילית הונחה על קרח לsonication. החללית היא שקועה לתוך המדגם וsonicated ל3 דקות. 2 דקות נוספות מותר לקרר את הדגימה מהתחממות יתר.
  7. Lysate התא sonicated מועבר לתוך צינור צנטריפוגה סטרילית מראש המצונן, ונתונים לצנטריפוגה ב 4 ° C בצנטריפוגה קמן באמצעות-17 JA הרוטור @ 35267 XG (16,000 סל"ד) במשך 15 דקות פעמים.
    הערה: במקרה של טיהור חלבוני קרום, lysate התא sonicated הוא centrifuged רק פעם אחת במשך 15 דקות כי אנחנו לא יודעים שבחלק מהחלבונים בממברנה הם, כי הוא, או בגלולה או בשבריר supernatant. אז כדי למנוע אובדן עודף של ממחלבוני brane, אנחנו לסובב את התאים למשך 15 דקות בצנטריפוגה במהירות גבוהה וsupernatant הוא המשך עיבוד לטיהור (ראה הנחיות בהמשך) שבו חומר ניקוי 1% משמש לsolubilize את החלבונים בממברנה.
  8. Supernatant מצינור צנטריפוגה מועבר בזהירות לצינור 50 מ"ל פוליפרופילן פלקון והוקפא באמצעות חנקן נוזלי. תמצית התא קפואה sonicated מאוחסנת לתקופה מקסימלית של 6 חודשים ב-80 ° C לשימוש עתידי.

3. טיהור זיקה

  1. לפני שימוש, 100 μl של חרוזי M2 אנטי דגל נשטפים על ידי 10 כרכים של ה-AFC חיץ (30 mM טריס-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% חומרי ניקוי, והמ"מ TCEP 0.1-0.5 [טריס (2-carboxyethyl) phosphine - חומצה הידרוכלורית]) ללא חומר הניקוי וצמצום הסוכן TCEP (טריס (2-carboxyethyl) phosphine).
  2. תמצית התא קפואה, sonicated מופשרת על ידי נחת הצינור במים קרים. תמצית התא המופשר הוא מודגרות עם 3 μl של benzonase nuclease למשך 30 דקות ב 4 ° C. לתערובת זו, להוסיף חומר ניקוי לא יוני טריטון X-100 (ריכוז סופי של חומר הניקוי צריך להיות 0.1%) ו 200 השעיות μl של חרוזים נגד דגל M2 agarose.
    הערה: לכל החלבון המסיס בטהרה, 0.1% Triton X-100 משמשים כדי למזער ספיחה לא ספציפית, שבו כמו לטיהור חלבון קרום, חומרי ניקוי שונים קלים שאינם יוניים, כגון C12E8 (אתר dodecyl גליקול Octaethylene), DDM ( n-Dodecyl β-D-maltoside) ומלטוז-neopentyl גליקול (MNG) ניתן להשתמש בחומר ניקוי 1% ריכוז כדי לשפר solubilization. מאז חומרי ניקוי שונים שמשתנים יעילות solubilization של חלבונים בממברנה, מומלץ לבצע טהרת חלבון עצמאית באמצעות חומר ניקוי יותר מפעם אחת.
  3. התוכן הוא מעורב בעדינות על ידי ההחלפה של הצינור עבור 3 שעות ב 4 ° C באמצעות LabQuake מטרף. לאחר 3 שעות של סיבוב, צינור centrifuged ב1700 XG ל6 דקות. Supernatant הוא ולאחר מכן removed בזהירות, עד כמה שניתן, מבלי להפריע לגלולת החרוז הרופפת.
  4. הגלולה היא resuspended בsupernatant שנותר ולאחר מכן הועברה ל0.8 4 עמודת x סנטימטר Bio-Rad פוליפרופילן הכנה. ודא להסיר את התקעים לשקע תחתית הטור, כדי לאפשר את eluates לניקוז על ידי זרימת כוח הכביד. לשטוף את העמודה 5 פעמים עם צעד המחשוף TEV.
  5. לאחר ייבוש eluates הרחוץ, שקע תחתית העמודה סגור. לאותה העמודה, מחשוף מבוצע על ידי הוספה ~ 5-10 μl (50 יחידות) של פרוטאז TEV ו400 μl של חיץ AFC 1X על העמודה. ודא כדי לסגור את החלק העליון של העמודה עם כובע. העמודה המכילה את החרוזים מסובבים בעדינות בין הלילה ב 4 ° C למשך הלילה באמצעות LabQuake מטרף.
  6. הסר את הכובע על הראש והתקע לשקע בתחתית הטור, ולנקז את eluates התאושש לאחר מחשוף TEV לטור טרי מכיל 200 השעיות μl של חרוזי calmodulin-sepharose, שנשטפה על ידי 10כרכים של חיץ מחייב calmodulin.
  7. שניהם העליונים והתחתונים של העמודה מהודקות בחוזקה, ואת התוכן בעמודה מעורבב בעדינות על ידי החלפה ל3 שעות ב 4 ° C באמצעות LabQuake מטרף.
  8. לאחר 3 שעות של סיבוב, eluate מנוקז על ידי הסרת המכסה העליון ותקע תחתית הטור. הטור הוא שטף ארבע פעמים עם 200 μl של חיץ מחייב 1X calmodulin אחרי שטיפה קפדנית 1 עם 400 μl של חיץ לשטוף calmodulin.
  9. החלבון הוא המאוגד eluted בארבעה חלקים של 50 μl בצינור אפנדורף טרי באמצעות חיץ 1X calmodulin elution. שבריר eluted מופץ בשני צינורות Eppendorf נקיים בכמויות שווות. שני הצינורות הם יבשים לאחר מכן באמצעות ואקום מהירות.
  10. Eluate המיובש מצינור אחד משמש להפעלת ג'ל כסף מכתים, ואילו השני הוא מאוחסן ב-80 ° C, לפני השימוש בספקטרומטריית מסות.

4. כתמי כסף

  1. לכסף staining, חצי נפח 3X חיץ המדגם SDS (סולפט dodecyl נתרן) הוא הוסיף 50 μl של eluate המיובש. לאחר רתחת התערובת במשך 5 דקות, הדגימות מועמסות על ג'ל SDS polyacrylamide.
  2. לאחר סיום פעולתו ג'ל, הוא הניח בזהירות לתוך תמיסת קיבוע (מתנול 50% וחומצה אצטית 10%) והנסער בעדינות על שייקר סיבובי במשך 20 דקות. אז ג'ל נשטף באתנול 20% למשך 10 דקות.
  3. ג'ל רחץ הקבוע פעמים ביסודיות עם 500 מ"ל של מים מזוקקים פעמים למשך 10 דקות, כדי להבטיח רקע אחיד נמוך.
  4. אז ג'ל נסער בעדינות נתרן תיוסולפט 500 מ"ל לדקה 1, ואחרי שני צעדי שטיפה במים מזוקקים ל20 שניות.
  5. המים שנזרקו, וג'ל הוא מודגרות ב200 מ"ל של 0.1% כסף חנק למשך 30 דקות. לאחר הזמן, הכסף חנק מוסר וג'ל רחץ במים מזוקקים למשך 20 שניות כדי להסיר את עודפי הכסף חנק.
  6. ג'ל לבסוף יד נסער ב75 מ"להפתרון של הפיתוח. כאשר העצמה הרצויה מושגת, פתרון הפיתוח נמחק ו80 מ"ל של חומצה אצטית נוסף כדי לעצור את התגובה. ודא כדי לדגור ג'ל בחומצה אצטית למינימום של 20 דקות להדמיה תקינה של להקות ג'ל.

5. Proteolysis ודוגמא הכנה להמונית ספקטרומטריית

  1. לדוגמא המיובשת, להוסיף 50 μl של חיץ העיכול ו0.9 μl של 100 מ"מימ TCEP-HCl (טריס (2-carboxyethyl) phosphine - חומצה הידרוכלורית) ו דגירה את התערובת במשך 45 דקות בטמפרטורת חדר עבור שלב הירידה. בשלב בא, μl 1 מתוך iodoacetamide mM 500 מוסיף ודגר בחושך במשך 40 דקות נוספות כדי לאפשר לאלקילציה מדגם.
  2. לאחר הסיבוב השני של דגירה, להוסיף מיקרוגרם 1 מתוך טריפסין המשותק לתערובת ולדגור גם על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות או למשך הלילה בטמפרטורת חדר. ודא כדי לעצור את התגובה על ידי הוספת μl 1 של חומצה אצטית.
  3. טרום הרטוב Millipoמיקוד-עצה מחדש קצה פיפטה ידי aspirating 10 μl של פתרון איזון וההרטבה. לוותר פתרון לטמיון. כתוצאה מכך לשאוב 10 μl של פתרון הכביסה ולוותר פתרון לטמיון. חזרו על פעולה זו פעמים.
  4. לכריכה יעילה של תערובת פפטיד לקצה, פיפטה לערבב את תערובת פפטיד 20 פעמים. תערובת פפטיד שדבק בקצה היא שטפה את ידי aspirating וניפוק פתרון הכביסה. חזור על תהליך זה פעמים לכריכה יעילה של תערובת פפטיד לקצה.
  5. עם קצה המכיל את פפטיד המאוגד, לשאוב 10 μl של פתרון איזון וההרטבה, ולוותר לתוך צינור Eppendorf נקי. חזור על פעולה זו פעמים. לאחר ייבוש דגימות eluted בואקום מהירות, הדגימות ניתן לנתח באופן מיידי על ידי ספקטרומטריית מסה או מאוחסנות ב-80 ° C לפני שימוש.

6. זיהוי חלבון על ידי LTQ Orbitrap לוס ההמוני ספקטרומטר

הדואר רכיבי פוליפפטיד של המתחמים המבודדים מזוהים באמצעות ספקטרומטר LTQ Orbitrap לוס ההיברידי טנדם המוני. Orbitrap יש כוח יוצא דופן לפתרון (> 60000 מרביים מלא רוחב חצי, או FWHM) ודיוק מסה (<2 עמודים לדקה) שממזער דגימת MS / MS של מזהמים שאינם ספציפיים רקע לא רלוונטיים שאותרו בטהרת בקרה, תוך מלכודת המהירות הגבוהה ולוס היון רכיב יכול לזהות ופפטידים שפע נמוכים בר באמצעות שני אלקטרוני העברת מצבי התנגשות מושרה דיסוציאציה דיסוציאציה ו. התאמות ברמת ודאות גבוהה בין MS כתוצאה / MS ספקטרום ממופות להתייחסות E. רצפי חלבוני coli באמצעות אלגוריתם חיפוש מסד נתונים כמו SEQUEST וכל רצף התאמה הוערך במהלך אלגוריתם הסתברות כמו 11 STATQUEST. סה"כ מספר ספקטרום ייחוד, פפטיד רצף ומזהמי רקע משותפים אותרו בשליטה שלילית (כלומר. מדומה) טהרה נחשבים להשגה שגויה דיס האמפירי נמוךשיעור covery. השלבים הבאים מבוצעים לזיהוי חלבון:

  1. מייקרו העמודות עמוסות ~ 10 סנטימטר של 3 מיקרומטר לון-C 18 ושרף הם interfaced למקור יון nanoelectrospray Proxeon הממוקם בקו אחד עם מכשיר Orbitrap.
  2. משאבת Proxeon ננו זרימת ינארי HPLC משמשת כדי לספק קצב זרימה יציב של קצה ~ 300 nl דקות -1 בהפרדות פפטיד.
  3. כדי להשיג elution פפטיד, שיפוע חיץ אורגני מוגדר בהתאם למורכבות המדגם. לדוגמה, השיפוע הבא מוגדר בדרך כלל עבור E. דגימות SPA coli: B ממס עלה מ 2% עד 6% בדקות 1, עד 24% ב38 דקות, עד 100% ב 4 דקות הבאות, שנערכו ב 100% ל1 דקות, ולאחר מכן ירד ל 2% בדקות 1, ואחרון להחזיק ברמה של 2% במשך 15 דקות. השלב הנייד ממס יש 95% מי HPLC שיפוע ו5% ACN עם חומצה פורמית 0.1%, ואילו ב 'ממס יש 5% מי HPLC שיפוע ו95% ACN עם 0.1% פורמית ACIד. קצב הזרימה בקצה המחט מוגדר עד 300 דקות nl -1 עבור 60 דקות.
  4. ככל שמחזורי ספקטרומטר המסה להפעיל באמצעות סריקה המונית אחד מלאה בהחלטות 60000, 10 סריקות המוניות פיצול טנדם נלוות נאספות ליונים המבשרים האינטנסיביים ביותר. הדרה דינמית, סלקציה המונית monoisotopic, ותכונות בזמן אמת נתונים תלויי רכישת מכשיר מופעלת.
  5. הספקטרומים חפשו באמצעות אלגוריתם חיפוש של מסד נתונים כמו SEQUEST מול מסד נתונים של ה רצפי coli חלבון, והתוצאה הם מסוננים באמצעות אלגוריתם סטטיסטי הסתברות כגון 11 STAQUEST כדי להבטיח שיעור גילוי שווא נמוך. רק אמון גבוה (99% הסתברות) מועמדים נבחרים, ואילו התאמות מראות שגיאה המונית יותר מ 10 עמודים לדקה בהשוואה למסת פפטיד התיאורטית מסולקות משיקול נוסף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר שחלבוני פיתיון מתויגים, המתבטאים ברמות אנדוגניות, מטוהרים בזיקה מתרביות פאזה לוגריתמית, הדגימות הופעלו על ג'ל כתם כסף כדי לדמיין את רכיבי הפוליפפטיד הבודדים של הקומפלקסים היציבים המבודדים. כמו כן, העברנו חלק שני של דגימות החלבון המטוהר בזיקה לספקטרומטריית מסה טנדם נטולת ג'ל (LCMS) כדי לזהות את רצפי הפוליפפטידים המתאימים. היעילות של הליך APMS זה מוצגת עם ניתוח SDS-PAGE מייצג של מרכיבי קומפלקסי חלבון RNA פולימראז (RNAP) ו-SufBCD ברזל-גופרית (Fe-S) שטוהרו בזיקה מ-E. coli (איור 1C ו-D). גם RNAP...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היבט מרכזי של גישת APMS ספא המבוססת המתוארים כאן הוא שהתיוג מתבצע במסגרת כרומוזומלית הטבעית, ובכך להבטיח רגולציה של גנים נורמליות נשמר (כלומר אמרגן פיתיון ילידים. נשמר, ומכאן רמות הביטוי אינה מוטרדות) וילידים הקשורים ביציבות קומפלקסי חלבונים הם התאוששו ברמה קרובה לאנדוגניים. נושאי קוטביות אופרון גם הם נמנעו על ידי כולל אמרגן כלפי חוץ בכיוון בסמן הבחירה. גישה זו SPA התיוג היא יעילה מספיק כדי לטהר את הרכיבים של קומפלקסים נמוכי שפע להומוגניות קרובה, כוללים מכלולי קרום קשור, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי כספים מהקרן הקנדית עבור חדשנות, הגנום קנדה, אונטריו מכון Genomics, אונטריו משרד החדשנות, ומכון הקנדי לבריאות מחקר המענק לJG ו AE אדום מבטא א coli הזן DY330 היה מתנה מסוג דונלד ל בית המשפט (המכון הלאומי לסרטן, פרדריק, מרילנד).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
I. אנטיביוטיקה
KanamycinBioshop#KAN201
AmpicillinBioshop#AMP201
2. Terrific-Broth בינוני
ביו-טריפטוןביושופ#TRP 402
תמצית שמריםביושופ#YEX 555
גליצרולביושופ#GLY 002
K<תת>2HPO<תת>4ביושופ#PPM 302
KH<תת>2PO<תת>4ביושופ#PPM 303
3. זן חיידקים ופלסמיד
DY330יו et al. (2000)10
pJL148Zeghouf et al. (2004)7
4. ריאגנטים PCR ואלקטרופורזה
Taq DNA פולימראזFermentas# EP0281
10 X מאגר PCRFermentas# EP0281
10 מ"מ dNTPsFermentas# EP0281
25 מ"מ MgCl2>Fermentas# EP0281
AgaroseBioshop# AGA002
טוען צבעNEB#B7021S
אתידיום ברומידביושופ# ETB444
10X TBE מאגרתרמו מדעי# 28355
Tris BaseBioshop#TRS001
חומצה בוריתביושופ#BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0)Sigma# E6768
סולם DNANEB#N3232L
<חזק>5. בידוד פלסמיד וערכות ניקוי< / חזק>
פלסמיד ערכת מידיQiagen# 12143
QIAquick PCR טיהור ערכתQiagen# 28104
<חזק>6. PCR וציוד טרנספורמציה
תרמיBioRadiCycler
Agarose ג'ל אלקטרופורזהBioRad
ElectroporatorBio-RadGenePulser II
0.2 ס"מ קוביית אלקטרופורציהBio-Rad
42 & deg; שייקר אמבט מים CInnova 3100
C שייקרניו ברונסוויק סיינטיפיק, ארה"ב
32 & deg; C שייקר גדולניו ברונסוויק סיינטיפיק, ארה"ב
32 & deg; חממת צלחת Cפישר Scientific
<חזק>7. אלקטרופורזה וכתמים מערביים
מונומר אקרילאמיד, N,N'- methylenebis-acrylamideBio-Rad#161-0125
אמוניום פרסולפטBioshop# AMP001
n-butanolSigma# B7906
TEMEDBioshop#TEM001
Whatman מס' 1 נייר סינוןFischer Scientific#09-806A
מיני פרוטאן 3 תאיםBio-Rad#165-3301
מכשיר העברת ג'ל iBlotInvitrogen#IB1001
ממברנות ניטרוצלולוזהBio-Rad#162-0115
נוגדן חד-שבטי נגד דגל M2סיגמא#F3165
חזרת פרוקסידאזאמרשם#NA931V
מוכתם מראש תקני משקל מולקולרי של חלבוןBio-Rad#161-0363
מגיב כימילומינסנציהPIERCE#1856136
סרט אוטורדיוגרפיהClonex Corp#CLEC810
נייר ספיגה Quick DrawSigma#P7796
שייקר נדנדה פלטפורמה C2ניו ברונסוויק סיינטיפיק, ארה"ב<
סוניקטורברנסון אולטרסאונד#23395
NaClBioshop#SOD001
מעכבי פרוטאזRoche#800-363-5887
0.5 מ"מ TCEP-HClThermo Scientific#20490
9. ריאגנטים וציוד לטיהור זיקה
0.8 x 4 ס"מ עמוד פוליפרופילן Bio-RadBio-Rad #732-6008
Benzonase nucleaseNovagen#70746
חרוזי אגרוז Anti-FLAG M2סיגמא#A2220
חרוזי קלמודולין-ספרוזGE Healthcare#17-0529-01
TEV פרוטאזInvitrogen#12575-015
Triton X-100Sigma#T9284
CaCl2Sigma#C2661
EGTASigma#E3889
LabQuake ShakerThermolyne#59558
10. ריאגנטים לצביעת כסף
מתנולביושופ#MET302
חומצה אצטיתביושופt#ACE222
נתרן-תיוסולפטסיגמא#S-7143
כסף חנקתיפישר מדעי#S181-100
פורמלדהידביושופ#FOR201
נתרן פחמתיBioshop#SOC512
11. ריאגנטים וציוד לזיהוי חלבונים
טריפסין זהב, ספקטרומטריית מסה דרגהPromega# V5280
50 מ"מ NH4HCO3Bioshop#AMC555
1 מ"מ CaCl2Bioshop#CCL302
AcetonitrileSigma#A998-4
Formic חומצהסיגמא#F0507
סיגמא מים בדרגת HPLC#95304
יודואצטמידסיגמא#16125
Millipore קצה רוכסןMillipore# ZTC18M960
~ 10 ס"מ של 3 μ m Luna-C18 שרףPhenomenex
Proxeon ננו HPLC משאבתThermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos ספקטרומטרThermo Fisher Scientific
<חזק>12. כלי מעבדה
4 ליטר צלוחיות חרוטיותVWR#89000-372
50 מ"ל צינורות בז פוליפרופילןכל ספק
1.5 מ"ל צינורות מיקרו-צנטריפוגהכל ספק
250 מ"ל פתיתים חרוטייםVWR#29140-045
15 מ"ל צינורות תרבית סטרילייםתרמו מדעי#366052
בקבוקונים קריוגנייםVWR# 479-3221-80
& deg; מקפיא CFisher Scientific#13-990-14
מערכת ואקום מהירהThermo Scientific

Buffers and Solutions

1. 1 ליטר מרק נהדר (TB) מדיה

11 גרם ביו-טריפטון
22 גרם תמצית שמרים
2% גליצרול
50 מ"ל ציר מלח אשלגן solution

2. תמיסת מלאי מלח אשלגן

1.5 M K2HPO4
0.35 M KH2PO4

3. מאגר סוניקציה

20 מ"מ Tris-HCl (pH 7.9)
150 מ"מ NaCl
0.2 מ"מ EDTA
10% גליצרול
לפני השימוש יש להוסיף מעכב פרוטאז (PI) ו-0.1-0.5 מ"מ TCEP

4. AFC buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.1% חומר ניקוי
לפני השימוש הוסף PI ו-0.1-0.5 מ"מ TCEP

5. מאגר מחשוף TEV

30 מ"מ Tris-HCl (pH 7.9)
150 מ"מ NaCl
0.2 מ"מ EDTA
0.1% חומר ניקוי
לפני השימוש הוסף PI ו-0.1-0.5 מ"מ TCEP

6. מאגר קשירת קלמודולין

30 מ"מ Tris-HCl (pH 7.9)
150 מ"מ NaCl
2 מ"מ CaCl2
0.1% חומר ניקוי
לפני השימוש הוסף PI ו-0.1-0.5 מ"מ TCEP

7. מאגר שטיפת קלמודולין

30 מ"מ Tris-HCl pH 7.9
150 מ"מ NaCl
2 מ"מ CaCl2
0.1-0.5 mM TCEP

8. מאגר פליטת קלמודולין

30 מ"מ Tris-HCl (pH 7.9)
100 מ"מ NaCl
10 מ"מ EGTA
0.1-0.5 מ"מ TCEP

9. פיתוח תמיסה (1L)

37% פורמלדהיד
30 גרם נתרן פחמתי
1000 מ"ל מים מזוקקים

10. מאגר עיכול

50 מ"מ NH4HCO3
1 mM CaCl2

11. תמיסת הרטבה ושיווי משקל

70% אצטוניטריל (ACN) ב-0.1% חומצה פורמית

12. תמיסת כביסה

100% H2O ב-0.1% חומצה פורמית

צנטריפוגה בקמן קולטר TJ-25 בקמן קולטר TS-5.1-500 32 & deg;td colspan="4"><חזק>8. ציוד סוניקציה וריאגנטים מסה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
  2. Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096(2009).
  3. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  4. Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
  5. Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
  6. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
  7. Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
  8. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  9. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  10. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
  11. Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
  12. Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
  13. de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).
  14. Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Complex IdentificationSequential Peptide Affinity PurificationTandem Mass SpectrometryEscherichia coliAffinity Purification Mass SpectrometryProtein Protein InteractionsSPA Tagging SystemCalmodulin Binding PeptideAnti FLAG Affinity BeadsTEV Protease Cleavage

Related Articles