סרט הווידאו הזה מדגים נהלים ואפיון של איים הלבלב אדם באמצעות hematoxylin ו eosin (H & E) ו אימונוהיסטוכימיה (IHC). סעיפים הלבלב מן הראש, הגוף, באזורים הזנב מוכתמות על ידי שני H & E ו-IHC לקבוע הרכב האנדוקרינית איון (אינסולין, גלוקגון, והלבלב פוליפפטיד), שכפול תאים (Ki67), וכן מחלחל דלקתיות (H & E, CD3). האזור אונקלי הוא מקומי באמצעות IHC של הלבלב פוליפפטיד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אומדני השטח מספרים איון ותא האנדוקרינית הרכב בלבלב אדם מבוגר נע בין כמה מאות אלפים על טווחים המונים כמה מיליוני ובטא מ 500 עד 1500 מ"ג 1-3. עם ההטרוגניות זה ידוע, עיבוד רגיל הליך מכתים פותחה על כך אזורים הלבלב הוגדרו בצורה ברורה איים מאופיין באמצעות אנליזה פתולוגית בכליה קפדני בדיקות immunolocalization.
נהלים אחידים לעיבוד הלבלב האנושי התאושש תורמים איברים מתוארים בחלק זה של סדרה 1. הלבלב מעובד ל 3 אזורים עיקריים (ראש, גוף, זנב) ואחריו חלקים רוחביים. חלקים רוחביים של ראש הלבלב מחולקים עוד יותר, כפי שמצוין על פי גודל, ממוספרות לפי סדר אלפביתי לציון קטנים. סטנדרטיזציה זו מאפשרת ניתוח מלא חתך רוחב של אזור הראש כולל אזור אונקלי המכיל איים המורכביםבעיקר של תאים בלבלב פוליפפטיד לאזור הזנב.
הדו"ח הנוכחי מהווה חלק 2 מתוך סדרה זו ומתאר את הנהלים המשמשים חתך סדרתי ואפיון histopathological של פרפין סעיפים הלבלב עם דגש על תאים אנדוקריניים איון, שכפול, T-cell המחלחל. פתולוגיה של הלבלב סעיפים נועד לאפיין גם אקסוקרינית, ductular, ורכיבים אנדוקריניות. תא אקסוקרינית מוערך נוכחות של דלקת הלבלב (פעיל או כרוני), ניוון, סיסטיק, שומן, כמו גם מערכת צינורות, בעיקר ביחס לנוכחות של neoplasia הלבלב intraductal 4. איי מוערכים על מורפולוגיה, גודל, צפיפות, תאים אנדוקריניים, דלקת, פיברוזיס, עמילואיד, ואת הנוכחות של תאים אפופטוטיים משכפלים או באמצעות H & E ו-IHC כתמים.
המרכיב האחרון המתואר חלק 2 הוא מתן שקופית צבעוניתכמו דיגיטציה של תמונות שקופיות שלמים. השקופיות דיגיטציה מסודרים לפי המקרה באזור הלבלב במסד נתונים של הפתולוגיה מקוון ליצירת biobank וירטואלי. גישה לאוסף מקוון זה מספק כיום יותר מ -200 רופאים ומדענים העוסקים במחקר סוכרת מסוג 1. מסד הנתונים המקוון מספק אמצעי לשיתוף נתונים מהירה מלאה לחוקרים בחר אבני פרפין או חלקים סדרתיים קפואים.
פרוטוקול
1. Microtomy על סעיפים בלא כתם
- הגדרת אמבט מים microtome באשר microtomy פרפין סטנדרטי. השתמש שקופיות בעלי מטען חשמלי חיובי ושל מראש תווית עם מספר התיק, באזור הלבלב (לדוגמה) ואת מספר שקופיות. פרפין במקום לחסום צ'אק microtome עם תווית את הקלטת בצד שמאל.
- בצע את ההליכים microtomy רגילים, סעיף לבלוק עד רקמת הוא נתקל באופן אחיד. לייצר סרט של חלקים סדרתיים (4 מיקרומטר עבים, 3-6, תלוי כמה כתמים הנדרשים הראשונים (ראה מקרה הגשת טופס, נספח 1)). חלקים נפרדים סרט, לקחת את זה לפי הסד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
סטנדרטיזציה של תהליכי IHC הוא קריטי לניתוח תמונה, במיוחד בעת שימוש במחשב מבוסס אלגוריתמים על פני מספר גדול של שקופיות לאורך זמן. הליך מכתים IHC המתואר בדוח זה יאפשר ניתוח סדרה של דגימות של תורמים ניתן באמצעות autostainer תוך יום 8 שעות עבודה משתנים מן הדו"ח הקודם 5. דיגיטציה שקופיות שלמים של כל שקופית צבעונית לרשות nPOD המזוהים עם החוקרים באמצעות מערכת מבוססת אינטרנט הפתולוגיה באינטרנט. החוקרים יכולים לבדוק נתונים דמוגרפיים, נתונים התורמות מעבדה, אחר ההיסטוריה קלינ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגוד עניינים הצהיר.
תודות
המחברים מודים משפחות של תורמים איברים הרכש ארגונים העוסקים במחקר זה ואמילי מונטגומרי, רוברט Pietras, אן פו, Mitali Agarwal, ו רושאן Agarwal לסיוע המומחה שלהם. עבודה זו מומנה על ידי Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) בתמיכה של רשת לעוגב תורמים הלבלב עם סוכרת.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| מי חמצן 30% (H 2 O 2) | FisherScientific | H325-500 | Peroxidase אנדוגני חסימת |
| ABC-phosphatase אלקליין (AP) | וקטור | AK-5000 | AP המצומד |
| נוגדנים diluent | Invitrogen | 003218 | ראשי נוגדן |
| Avidin חוסם | וקטור | SP-2001 | חסום ביוטין אנדוגני |
| עיזים Biotinylated נגד חזיר ים | וקטור | BA-7000 | משני הנוגדנים |
| Bluing מגיב | FisherScientific | 7301 | לייקה autostainer |
| מאגר ציטראט, ה-pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen אחזור |
| Clarifier 1 | FisherScientific | 7401 | לייקה autostainer |
| Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
| DAB | וקטור | SK-4100 | HRP אב צבע |
| דיב | DAKO | S2003 | AP אנדוגני חסימת מגיב |
| Eosin אלכוהולי Y | FisherScientific | 71204 | לייקה autostainer |
| Ethanols-100%, 95%, 90%, 70% | FisherScientific | שונים | Deparaffinization ו coverslipping |
| Hematoxylin | DAKO | S3301 | Dako autostainer |
| Hematoxylin 7211 | FisherScientific | 7211 | לייקה autostainer |
| IgG (כל המינים המארחות של נוגדנים ראשוניים) | שונים | שונים | בקרות שליליות על הפריימריז |
| אדום קבע נוזלי (LPR) | DAKO | K0640 | AP אב צבע |
| Mach2 AP | Biocare רפואי | MALP521L | אנטי עכבר עיזים AP המצומד |
| Mach2 HRP | Biocare רפואי | MHRP520L | אנטי עכבר עיזים HRP המצומד |
| Mach2 HRP | Biocare רפואי | RHRP520L | אנטי עכבר עיזים HRP המצומד |
| מתנול | FisherScientific | שונים | H 2 O 2 diluent |
| עז רגיל סרום | וקטור | S-1000 | IHC מגיב חסימת |
| צלף | Biocare רפואי | BS966M | IHC מגיב חסימת |
| TBST 20X | ThermoScientific | מדד ת"א 999-TT | IHC חיץ |
| Triology 20x | תא Marque | 920P-06 | Antigen אחזור |
| קסילן | FisherScientific | שונים | Deparaffinization ו coverslipping |
טבלה 1. חומרים כימיים ספציפיים.
| ראשי נוגדן | המארחות מינים | מוכר | החתול. # | תגובות ואחזור Antigen |
|---|---|---|---|---|
| פרפין | ||||
| עמילאז | עכבר | סנטה קרוז | SC-46657 | ציטראט |
| Amylin | עכבר | Serotec | MCA11267 | ציטראט |
| פחמתית anhydrase 19.9 | עכבר | Abcam | ab15146 | |
| Caspase-3, ביקע | ארנב | התא איתות | 9961 | ציטראט או הטרילוגיה |
| CD20 | עכבר | DAKO | M0755 | ציטראט או הטרילוגיה |
| CD3 | ארנב | DAKO | A0452 | ציטראט |
| CD34 | עכבר | התא איתות | 3569 | ציטראט |
| CD4 | עכבר | DAKO | M7310 | ציטראט |
| CD45 | עכבר | DAKO | M0754 | ציטראט |
| CD68 | עכבר | DAKO | M0876 | ציטראט |
| CD8 | עכבר | DAKO | M7103 | ציטראט |
| Chromogranin | ארנב | DAKO | A0430 | ציטראט |
| CK17 | עכבר | DAKO | M7046 | ציטראט |
| CK19 | עכבר | DAKO | M0772 | ציטראט |
| CK7 | עכבר | DAKO | M7018 | ציטראט |
| C-peptide | ארנב | התא איתות | 4593 | ציטראט |
| Foxp3 | עכברוש | Bioscience דואר | 14-4776-80 | ציטראט |
| גרלין | עז | סנטה קרוז | SC-10386 | |
| גרלין | ארנב | Abcam | ab85104 | |
| גלוקגון | ארנב | DAKO | A0565 | |
| גלוקגון | עכבר | Abcam | ab10988 | ציטראט |
| גלוקגון | חזיר ים | Bachem | T-5037 | ציטראט |
| שפע-1 | עכבר | Abcam | ab40084 | טרילוגיה |
| שפע-2 | ארנב | סנטה קרוז | SC-9117 | לא באה לידי ביטוי איים אדם |
| אינסולין | חזיר ים | DAKO | A0564 | |
| Ki-67 | עכבר | DAKO | M7240 | ציטראט |
| Mafa | ארנב | נובוס ביולוגית | NB400-137A | טרילוגיה |
| פוליפפטיד הלבלב | ארנב | Invitrogen | 18-0043 | ציטראט |
| PDX-1 | חזיר ים | Abcam | ab47308 | ציטראט או הטרילוגיה |
| Proinsulin | עכבר | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
| Proinsulin | עכבר | התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק | GS-9A8 | ציטראט |
| Secretagogin | ארנב | סיגמא | HPA 006641 | ציטראט |
| שריר חלק אקטין | ארנב | Abcam | ab5694 | |
| Somatostatin | ארנב | DAKO | A0566 | |
| Synaptophysin | עכבר | DAKO | M0776 | ציטראט |
| טרי קפוא | המארחות מינים | מוכר | החתול. # | תגובות |
| CD11b | עכברוש | Abcam | ab6332 | תקן עם PF 4% |
| CD11c | ארנב | Serotec | AHP1226 | |
| CD25 | עכבר | נובוס ביולוגית | נ.ב. 600-564 | השתמש הדגירה לילה עבור חלקים פרפין |
| CD94 | עכבר | Abcam | ab61874 | תקן עם אצטון |
| GAD65 | עכבר | סנטה קרוז | SC-130569 | תקן עם PF 4% |
| HLA-ABC | עכבר | DAKO | M0736 | תקן עם אצטון או PF 4% |
טבלה 2. נוגדנים ראשיים.
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
|---|---|---|---|
| Aperio Scanscope CS | Aperio | שקופית סורק דיגיטלי | |
| DAKO Autostainer פלוס | DAKO | IHC כתמים | |
| מטריקס לייבל הדפסה תוכנה | BioCarta | LM7UP57 | התווית שקופיות תוכנה |
| לייקה XL Autostainer | Leica | H & E כתמים | |
| פרימיום Coverglass | FisherScientific | 12-548-5j | Coverslip |
| מידע קשת Manager | Aperio | סורק תוכנות | |
| Superfrost פלוס מחליק | FisherScientific | 12-550-15 | מטען חשמלי חיובי שקופיות |
| ירקות קיטור | שחור דקר | שונים | Antigen אחזור |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | התווית שקופיות מדפסת |
לוח 3. אספקה וציוד ספציפיים.
מקורות
- In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008). ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
