מאמר שיטה

שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית ​​שומנים

DOI:

10.3791/4151

⸱

22 ביוני 2012

 ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Colorado Boulder, 2Biofrontiers Institute, University of Colorado Boulder

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה שחול להכנת שלפוחית ​​השומנים של מיקרון משנה גדלים עם רמה גבוהה של הומוגניות. שיטה זו משתמשת במערכת לחץ מבוקר עם מבוקרים זרימת שיעורי חנקן להכנת liposome. הכנה שומנים בדם 1,2, שיחול liposome, ואפיון גודל יוצגו להלן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליפוזומים הם בועיות שהוכנו באופן מלאכותי המורכב פוספוליפידים טבעיים וסינתטיים הנמצאים בשימוש נרחב כמו קרום התא מחקה פלטפורמת ללמוד חלבונים חלבונים חלבונים שומנים בדם אינטראקציות 3, משלוח צג התרופה 4,5, ו 4 אנקפסולציה. פוספוליפידים באופן טבעי ליצור bilayers השומנים מעוקלים, להבדיל את עצמו מן micelle. 6 ליפוזומים מסווגים באופן מסורתי על ידי גודל ומספר bilayers, כלומר שלפוחית ​​unilamellar גדולות ('לאב'), שלפוחית ​​unilamellar קטנים (רכבי השטח) ואת שלפוחית ​​multilamellar (MLVs) 7. בפרט, הכנת ליפוזומים הומוגניות בגדלים שונים, חשוב ללמוד עקמומיות קרום זה ממלא תפקיד חיוני איתות התא, אנדו ו-exocytosis, איחוי קרום, וסחר חלבון 8. מספר קבוצות לנתח כיצד חלבונים משמשים לווסת את התהליכים הכרוכים עקמומיות הממברנה ובכך להכין ליפוזומים בקטרים ​​של פחות מ -100 - 400ננומטר ללמוד את ההתנהגות שלהם על פונקציות התא 3. אחרים מתמקדים אנקפסולציה liposome תרופות, לומד ליפוזומים כלי רכב לבצע ולספק סמים עניין 9. אנקפסולציה התרופה ניתן להשיג כפי שדווח במהלך היווצרות liposome 9. צעד שחול שלנו לא אמור להשפיע על התרופה Encapsulated משתי סיבות, כלומר (1) אנקפסולציה התרופה צריכה להיות מושגת לפני השלב הזה (2) ליפוזומים צריך לשמור על יציבות biophysical הטבעי שלהם, באופן מאובטח נושאת את התרופה הליבה מימית. מטרות אלה מחקר נוסף מצביעים על הצורך שיטת אופטימיזציה לעצב יציבים מיקרון משנה שלפוחית ​​השומנים.

עם זאת, הטכנולוגיות הנוכחיות הכנה liposome (sonication 10, הקפאת-and-ההפשרה 10, שקיעה) לא מאפשרים הכנה של ליפוזומים עם משטח עקום מאוד (כלומר <בקוטר 100 ננומטר) עם עקביות יעילות גבוהה 10,5, אשר מגביל את biophysical מחקרים של emergiבתחום ng של חישה עקמומיות קרום. כאן, אנו מציגים שיטת הכנה חזק עבור מגוון רחב של ליפוזומים רלוונטיות מבחינה ביולוגית.

שחול ידני באמצעות גז חזק מזרקים וממברנות פוליקרבונט 10,5 היא מנהג נפוץ אך ההטרוגניות הוא נצפה לעיתים קרובות בעת השימוש גדלים הנקבוביות פחות מ -100 ננומטר בשל בשל השתנות של לחץ ידני מיושם. העסקנו מנגנון קבוע לחץ שבשליטת שחול להכין ליפוזומים סינתטיים אשר בקטרים ​​לנוע בין 30 ל 400 ננומטר. פיזור אור דינאמי (DLS) 10, 11 ו במיקרוסקופ אלקטרונים Nanoparticle מעקב וניתוח (נ.ת. ע) 12 שימשו כדי לכמת את גודל liposome כמפורט בפרוטוקול שלנו, עם קלקר מסחרי (PS) חרוזים ששימשו כסטנדרט כיול. קשר ליניארי ליד נצפתה בין גודל הנקבוביות מועסק על ליפוזומים נקבע באופן ניסיוני, המעיד על איכות גבוהה של הכנה שלנו לחץ שבשליטת liposome נפגשוהוד. יתר על כן, הראינו כי שלפוחית ​​שומנים שיטת הכנת חלה באופן כללי, ללא תלות בגודל liposome שונים. לבסוף, אנו הוכיחו גם במחקר כמובן אז אלה ליפוזומים מוכנים היו יציבים עד 16 שעות. פרוטוקול נציג בגודל ננו הכנה liposome באה לידי ביטוי בהמשך.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Liposome הכנה

  1. אחזור בקבוקון 20 מ"ל עם מכסה זכוכית מצופה טפלון.
  2. יש לנקות את כל כלי זכוכית מזרקים עם כלורופורם לפני השימוש כדי למנוע זיהום.
  3. העברת 100 μL של כלורופורם כיתה מגיב על בקבוקון זכוכית באמצעות מזרק 250 μL אוויר חזק זכוכית.
  4. הוסף 30 μL של מתנול כיתה מגיב על בקבוקון זכוכית אותו באמצעות מזרק 100 μL אוויר חזק זכוכית.
  5. להכין 2 7:1.5:1.5 mM....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש Liposofast Avestin LF-50 extruder, הראינו עד כמה קטן בגודל, ליפוזומים מלאכותיים מוכנים באמצעות מערכת לחץ מבוקר. חשוב לציין כי שלפוחית ​​multilamellar ליצור באופן ספונטני לאחר הידרציה liposome, מה שעשוי להוביל לייצור של חלקיקים קטנים יותר. אלו שלפוחיות קטנות multilamellar בהכרח לזרום גודל גדול נקבוביות פוליקרבונט הממברנה, גורם ההטרוגניות בפתרונות של שלפוחית ​​unilamellar המיוצרים על ידי נקבוביות מסנן גדול. לכן, מומלץ להפחית את הלחץ זרימת החנקן כאשר גודל הנקבוביות גדולות משמשו.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הווארד יוז רפואי במכון (HHMI) בפרס חדשנות שיתופית. לאם נתמך על ידי איתות נייד תקנה המכון הלאומי לבריאות אימון מענק (T32 GM008759) ואת רות NIH ל Kirschstein קדם דוקטורט (CA165349-01). אנו רוצים להודות פרופ 'מיכאל Stowell (CU Boulder), פרופ' דאגלס ריס ופרופ 'רוב פיליפס (קלטק) להערות יסולא בפז שלהם.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי תגובות
כלורופורם Sigma-Aldrich 02432-25ML 95% מייצבים
מתנול ציון גבוה Sigma-Aldrich 179337-4L
Extruder Liposofast LF-50 Avestin, Inc
פוספוליפידים AVANTI ליפידים פולאר
פוליקרבונט הנקבוביות Avestin, Inc 25 מ"מ קוטר
מסננים דיסקים PE Avestin, Inc 230600 25 מ"מ קוטר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).
  2. Smith, S. A., Morrissey, J. H.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Lipid Vesicle PreparationConstant Pressure ExtrusionLiposome Size ControlDynamic Light ScatteringNanoparticle Tracking AnalysisFreeze Thaw MethodPolycarbonate Membrane FiltrationNitrogen Pressure ControlLiposome Stability AnalysisElectron Microscopy Imaging

מאמרים קשורים