תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

Summary

זרימת הנוזל ביניים הוא גבוה בגידולים מוצקים והוא יכול לווסת את הפלישה תאים סרטניים. כאן נתאר את הטכניקה ליישם זרימת הנוזל ביניים לתאים משוקע בתוך ולאחר מכן למדוד את השפעותיו על הפלישה התא. טכניקה זו ניתן להתאים בקלות ללמוד מערכות אחרות.

Abstract

צמיחה והתקדמות של גידולים מוצקים רוב תלויים השינוי הראשוני של תאים סרטניים ואת תגובתם stroma הקשורים איתות microenvironment הגידול ^1. בעבר, מחקר על microenvironment הגידול התמקדו בעיקר גידולים סטרומה אינטראקציות ^1-2. עם זאת, microenvironment הגידול כולל גם מגוון של כוחות Biophysical, אשר תופעות להישאר ממעטים להבין. כוחות אלה הם תוצאות ביומכניים של הגידול להוביל שינויים בביטוי גנים, חלוקת התא, התמיינות ופלישה ^3. צפיפות מטריקס ^4, נוקשות ^5-6, והמבנה ^6-7, לחץ נוזלים ביניים ^8, ואת זרימת נוזל interstitial ⁸ משתנים במהלך כל התקדמות הסרטן.

זרימת הנוזל ביניים בפרט הוא גבוה יותר גידולים לעומת ^8-10 רקמות נורמליות. נוזל מוערך ביניים FLמהירויות ow נמדדו ונמצא כי בטווח של 0.1-3 מיקרומטר s ^-1, תלוי בגודל הגידול והבחנה ^{9, 11.} זאת בשל לחץ גבוה נוזל interstitial שנגרם על ידי הגידול אנגיוגנזה המושרית וחדירות כלי הדם מוגברת ^12. זרימת הנוזל ביניים הוכח להגדיל את הפלישה של תאים סרטניים ^13-14, fibroblasts כלי דם ותאי שריר חלק ^15. פלישה זו עשויה לנבוע הדרגתיים chemotactic עצמיים שנוצרו סביב תאים 3-D ¹⁶ או עלה metalloproteinase מטריקס (MMP) הביטוי ^15, הפרשת chemokine ו הידבקות התא מולקולות ביטוי ^17. עם זאת, המנגנון שבאמצעותו התאים לחוש זרימת הנוזל אינה מובנת היטב. בנוסף שינוי התנהגות תאים סרטניים, זרימת נוזל interstitial מודולציה את הפעילות של תאים אחרים microenvironment הגידול. היא מזוהה עם בידול (א) נהיגה של fibroblasts לתוך הגידול, קידום myofibroblasts ^18, (ב) ההובלה של אנטיגנים וגורמים מסיסים אחרים לבלוטות הלימפה ^19, (ג) הלימפה ויסות תא האנדותל המורפוגנזה ^20.

השיטה המוצגת כאן מטיל זרימת הנוזל ביניים על תאים במבחנה מכמת את השפעותיו על הפלישה (איור 1). שיטה זו פורסמו מחקרים רבים כדי למדוד את ההשפעות של זרימת הנוזל על סטרומה ופלישה סרטן תאים ^{13-15, 17.} על ידי שינוי הרכב מטריקס, סוג התא, וריכוז התא, שיטה זו ניתן להחיל על מחלות אחרות ומערכות פיזיולוגיות כדי לחקור את ההשפעות של זרם ביניים על תהליכים תאיים כגון התפשטות הפלישה, בידול, ועל ביטוי גנים.

Protocol

1. Assay Set-up

1. להפשיר aliquot קטן (<500 μl) של Matrigel על הקרח ב 4 ° C (כ 2 שעות).
2. להכין מתכון ג'ל (ראו כרכים לדוגמה בטבלה להלן): PBS 10x (1x בהיקף כולל), סודיום הידרוקסיד 1N (שווה ערך ל 0.023 כרכים של קולגן נוסף, או לפי המלצות היצרן של קולגן, על פי הצורך), הקלד Matrigel ו קולגן I ל הריכוזים האחרונים של 1 מ"ג / מ"ל ​​ו - 1.3 מ"ג / מ"ל ​​בהתאמה (ניסוחים מטריקס אחרים עשויים לשמש תלוי בסוג התא הניסוי).

ג'ל למ....

Discussion

כאן אנו מתארים מתודולוגיה לכימות ההשפעה של זרימת ביניים על הפלישה תאים סרטניים, תוך שימוש בתאי משוקע בתוך 3-D בתוך להוסיף תרבית תאים. שיטות אלה דומים שימשו כדי ללמוד את ההשפעה של זרימת ביניים על מגוון רחב של סוגי תאים ^{13-15, 17.} הגישה שלנו מחקה באופן חלקי microenvironment מטריצה ​​של הגידול על ידי שימוש בסוג אני קולגן Matrigel אשר מכילים חלבונים המצויים בתוך קרום במרתף של רקמת אפיתל stroma סביב ^21-22. מערכת זו קל יחסית ההגדרה, פשוט, ויותר חסכוני יותר התקנים m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
קולגן (זנב עכבר)	BD	354236	שמור סטרילית
תרבות Millicell תא הוספה	Millipore	PI8P01250	8 נקבוביות בקוטר מיקרומטר, פוליקרבונט הממברנה
Matrigel	BD	354234	שמור סטרילית
PBS	סיגמא אולדריץ'	100-8202	10x להכנת הפתרון ג'ל, 1x לשטיפת צעדים
נתרן הידרוקסידי, פתרון 1.0N	סיגמא אולדריץ'	S2770	שמור סטרילית
DMEM 1X	CellGro	10-013-CV	שמור סטרילית
בסרום שור עוברית	אטלנטה ביולוגיות	511150	שמור סטרילית
פניצילין סטרפטומיצין	CellGro	30002CI	שמור סטרילית
טריטון X-100	סיגמא אולדריץ'	100 x-500 מ"ל	0.5% ב PBS
Paraformaldehyde	פישר סיינטיפיק	04042-500	4% ב PBS
Deionized מים			שמור סטרילית
4 ',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI)	מגה פיקסל Biomedicals	0215757401	1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות
הרכבה פתרון	Thermo Scientific	מדד ת"א 030-FM
טריפסין-EDTA	CellGro	25-052-CI	שמור סטרילית