על שבב phenotyping דלקתיות האנדותל

סיכום

חדרי זרימת microfluidic חרוט על ידי photolithography מפוברק מ PDMS מוחלים לחקור התוצאות התפקודיות הקשורות בתפקוד EC ודלקת. בניסוי מייצג, את היכולת של מאמץ גזירה ההפרש לווסת הידבקות התא monocytic כדי הפעלת ציטוקינים EC monolayers באה לידי ביטוי.

תקציר

Atherogenesis הוא potentiated על ידי הפרעות מטבוליות שתורמים למדינה מוגברת של דלקת מערכתית וכתוצאה מכך תפקוד האנדותל. עם זאת, שינויים תפקודיים מוקדמים האנדותל מסמנים כי רמת הסיכון של הפרט לא מוערכים ישירות קלינית לעזור האסטרטגיה מדריך טיפולי. יתר על כן, ויסות דלקת ידי ופרמטרים המודינמיים מקומיים תורם ההפצה הלא אקראית המרחבי של טרשת עורקים, אך המנגנונים קשה להתוות in vivo. אנו מתארים גישה מבוססת מעבדה על שבב כדי ההפרעות כמותית assay חילוף החומרים של אירועים דלקת בתאי אנדותל אנושיים (EC) ומונוציטים בתנאים תזרים מדויקות. שיטות סטנדרטיות של ליתוגרפיה רך משמשים microfabricate כלי הדם לתאי microfluidic כוזב (VMMC), אשר קשורים ישירות בתרבית monolayers EC. ¹ מכשירים אלה יש את היתרון של שימוש בכמויות קטנות של חומרים כימיים תוךמתן במה הדמיה ישירות את האירועים דלקת קרום בבית של EC נחשף לשדה מוגדר היטב גזירה. יש לנו מיושם בהצלחה את המכשירים האלו לחקור ^{ציטוקינים-2,} שומנים בדם ^{3, 4} ו - ⁵ RAGE-Induced דלקת האנושי אבי העורקים EC (HAEC). כאן אנו מתעדים את השימוש VMMC לתא assay מתגלגל monocytic (THP-1) ומעצר על monolayers HAEC כי הם מותנים על פי מאפיינים גזירה דיפרנציאלי והופעל על ידי ציטוקינים דלקתיים TNF-α. מחקרים כגון אלה מספקים תובנה מכניסטית לתוך atherosusceptibility תחת גורמי סיכון מטבוליים.

פרוטוקול

1. התא התרבות הכנת התשתית

1. חותכים 3 אינץ' מצעים מעגליות של 100 x 20 מאכל רקמת התרבות מ"מ (BD פלקון) באמצעות מחרטה. לעקר מצעים ידי והשקיעה אתנול 70%. מקום בצלחת פטרי ומעיל עם קולגן 4 מ"ל סוג אני (100 מיקרוגרם / מ"ל) עבור שעות 1 בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף עם 4 x 1 מ"ל PBS.
2. להשעות אדם לתאי אנדותל אבי העורקים (HAEC, מעבר 4-6) בשעה 6.5x10 ⁵ תאים למ"ל וזרעי על ידי יישום 1 מ"ל ישירות המצע. מקום 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור ולאפשר התאים להיצמד למצע עבור שעה 1.
3. הוסף 9 מ"ל של צמיחה האנדותל בינוני-2 (EGM-2) להשלים את הפתרון לאנטיביוטיקה antimycotic 1x אל התאים. לשנות את התקשורת כל 2 ימים עד שהתאים מגיעים 90% confluency.
4. לשמור על THP-1 התאים במדיום 1640 RPMI השלימו עם 10% FBS ו 1x לאנטיביוטיקה antimycotic פתרון. המעבר התאים כאשר הם מגיעים צפיפות 10 ⁶ תאים למ"ל.

2. שירינג תא פרוטוקול

תאים מותנים ב מכשיר סלולרי מותאם אישית חרוט ו-צלחת הגז (CSD). פרטים התקנים והמפרטים עיצוב מתועדים טבלה 1, איור 4.

1. הכן CSD. לעקר הדיור קאמרית עם אתנול ולשטוף עם PBS סטרילית. מחממים את הדיור ל 37 מעלות צלזיוס ורמת להבטיח חרוט ניצב monolayer התא. להרכיב את המצע עם תאים מן החלק התחתון של הדיור ולהגדיר חרוט לגובה הרצוי.
2. השתמש ליבוביץ-15 (L-15) בינוני השלימו עם BulletKit האנדותל כמדיום הגז כדי לשמור על pH תקין בהעדר CO _2. כדי לעורר דלקת, נמק להוסיף הגידול גורם-α (TNF-α, 0.5 נ"ג / מ"ל) עד ​​בינוני הגז ולהזריק 6 מ"ל במכשיר באמצעות מזרק מחובר ליציאת מפרצון, נזהר שלא להכניס אווירבועות החדר.
3. תאים גזירה על מתח קבוע בעוצמה גבוהה גזירה (HSS, דיין 15 / ס"מ ²⁾ או מאמץ גזירה oscillatory (OSS, 0 5 ± דיין / ² ס"מ, 1 הרץ) עבור 4 שעות. אס הרצויה מושגת על ידי החלפה של קונוס מעל תאים, הנשלטת דווקא עם מנוע מיקרו דורך כפי שתואר קודם ⁶ אס הקיר על פני השטח (τ _W) הוא מקורב על ידי.:
   
   שם μ הוא צמיגות של המדיום, ω היא המהירות הזוויתית של החרוט, ו - α היא זווית קונוס (0.5 מעלות). יישור קונוס עם מצע מותאם בתוך 0.05 ° פילוס דרך הדיוק ואת גובה הפער נקבע על 20 ± 10 מיקרומטר באמצעות מד עומק למזער וריאציה ההיקפי ו רדיאלי ב τ _W. המכשיר קיבל תוקף על מנת להבטיח זרימה למינרית מאפיינים. הסרה גאמות מהמכשיר ולהתכונן ניתוח של הידבקות מונוציטים.

3. ייצור של PDMS Microfluidic הקאמרית

1. להשיג עובש אב המספר הרצוי ערוץ microfluidic וגובה ערוץ בהתאם ליישום. מאפייני העיצוב המסוים של פרוטוקול זה מפורטים בטבלה 1. שיטה ליצירת אלה כבר מתועד היטב בספרות. ¹ בקצרה, רשת של תעלות נועד באמצעות תוכנות CAD (Autodesk Inventor) והודפס ב 5000 dpi על שקיפות. Photoresist שלילית (SU8) הוא הסתובב על גבי פרוסות סיליקון בעובי של 100 מיקרומטר. שקיפות המאוחסן ונחשפו לאור UV. ללא polymerized photoresist מוסר על מנת ליצור את המאסטר העתק חיובי.
2. כדי להפוך את תמהיל PDMS פתרון בסיס סיליקון עם סיליקון ריפוי סוכן 10:01 לפי משקל בסירה לשקול ומערבבים עם pipet סרולוגית 5 מ"ל. להיזהר לא לגרד את הקירותשל הספינה שוקלים להימנע מהוספת פתיתי פלסטיק לפתרון.
3. מניחים את פרוסות שני צלחת פטרי 100x15mm ויוצקים את הפתרון PDMS לתוך צלחת.
4. לכסות את התבשיל ומניחים אותו לתוך מיכל ריק במשך 15 דקות כדי להסיר בועות. אחרי 15 דקות לקחת את צלחת פטרי החוצה להסיר בועות עודף ידי בעדינות נושבת באוויר מעל פני השטח.
5. מניחים צלחת פטרי בתנור במשך שעה 1 ב 70 ° C. הסר את הצלחת לגזור לתאי microfluidic באמצעות סכין חדה.

4. הרכבה של התקן על מיקרוסקופ

1. הפעל את מקור האור אל מיקרוסקופ הפוכה ולהגדיר תנור ל 37 ° C. צרף צינורות כדי מזרק 10 מ"ל וממלאים מים מזוקקים כך יש בועות לא. הנח את המזרק משאבת מזרק ספיקת סט לגרום אס הקיר של דיין ^1/2 ס"מ. הלחץ גזירה הקיר (τ _W) שנוצר לאורך קו האמצע של הערוץ הוא מקורב באמצעות תקןהמשוואה עבור חדר מקבילות צלחת זרימה:
   
   שם μ הוא צמיגות של המדיום, ש הוא שיעור זרימת נפח, h הוא גובה הערוץ, ו-W הוא רוחב הערוץ. הערה: מאז הערוצים הם בעלי רוחב סופי בפועל τ _W תשתנה בהתאם W תלוי ערוץ יחס הממדים, ומדידות הם נמנעו על 25% הקרוב הקירות הצדדיים. ^1,7
2. מניחים PDMS קאמרית במים ולהשתמש micropipette 100μl להוציא אוויר מן הערוצים בודדים. צרף מתאם ואקום לחדר לוודא כי השסתום מבוטלת.
3. מניחים צלחת פטרי עם monolayer HAEC על המטרה. מניחים את החדר PDMS על צלחת פטרי ובזהירות תניח אותו על monolayer HAEC תוך הבטחת כי לא ליצור בועות אוויר בין ההתקן לבין monolayer. סובבו את שסתום כך ואקום על וחדר מחובר כהלכה.
חותכים 19 מחטים מד להקהות כזה שיש רק 5 מ"מ של השמאל מתכת. מלאו את מיכל פלסטיק עם חיץ והכניסו הכניסה לחדר PDMS. חזור על הפעולה עבור מספר מתאים של ערוצי לשמש. צרף צינורות מ משאבות המזרק יוצא PDMS הערוץ.

5. הדבקה Assay מונוציטים תחת מאמץ גזירה

1. להשעות THP-1 תאים ב 2x10 ⁶ תאים למ"ל ב HBSS + Ca ^{2 +} / ^{2 +} Mg HSA + 0.1%. הפעל THP-1 תאים על ידי דוגרים עם מקדם-1 נגזרות סטרומה (SDF-1, 50 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
2. הפעל את משאבת מזרק להקים זרם, ולאחר מכן להוסיף 50 μl של השעיה תא למאגר ללא החדרת בועות אוויר. לאחר זרימה מפותחת במלואה, להתחיל רכישת נתונים.
3. לרוץ 5 דק 'בקצב זרימה מתאימה, הוספת המאגר למאגר אם הפתרון מקבל נמוך. ממשיכים לזרום אל תוך המאגר הערוצים כדי לשטוף את כל התאים מאוגד בנחל זרימה.

6. רכישת נתונים וניתוח

1. לרכישת התמונה sequences דיגיטליים לאחר 3 מסגרות לשניה 2 דקות לאחר זרימה מפותחת לאורך ציר האורך של הערוץ ב -3 מקומות הערוץ, נזהר שלא להקליט מיד לאחר הכניסה או היציאה לפני יציאות או 25% בצד הקרוב קירות.
2. ספור את מספר התאים שנעצרו בכל תחום על ידי זיהוי שלב המראה בהיר שלהם במישור מרחק זהה monolayer.
3. תא מעצר המשרד מוגדר על ידי התנועה <½ קוטר של תא 10. נתונים ממוצעים על פני 3 שדות אקראיים / ערוץ ולכמת באמצעות תוכנת ImageJ.

7. נציג תוצאות

למרות האנדותל בכלי הדם נחשפת אחיד אגוניסטים התורמים דלקת מערכתית, טרשת עורקים היא מחלה מיקוד המפתחת מעדיפים באתרים של הפרעה בזרימת בעורקים, לסבך את ההטרוגניות המרחבית בתפקוד האנדותל. ⁸ 9, 10 TNF-α גורם לתגובה היטב מאופיין של הנציבות האירופית, הכוללת את ויסות של מולקולות הידבקות התא (CAMS למשל: VCAM-1, ICAM-1, E-selectin) ו כמוקינים כי מונוציטים לגייס מהמחזור, סימן ההיכר של הנגע טרשת עורקים מוקדמת ¹¹ ופרמטרים המודינמיים הוא הרגולטור חשוב של הפנוטיפ דלקתית האנדותל ¹² מתח גבוה גזירה גודל (HSS.. למשל 15 dynes / cm ²⁾ או מאמץ גזירה pulsatile (PSS, למשל 15 ± 5 dynes / ² ס"מ) קשורה לאתרים של התנגדות טרשת עורקים בעורקים למטה המסדירים TNF-α-Induced תגובות. לעומת זאת, בסדר גודל נמוך גזירה מתח (LSS, למשל 2 dynes / cm ²⁾ או oscillatory גזירה (OSS, למשל 0 5 ± dynes / ² ס"מ), האופייניים לאתרים רגישים in vivo, להחמיר cytokine-Induced דלקת. ^{13, 14} microfluidic שלנו התקנים PDMS לספק פלטפורמה לביצוע מחקרים מכניסטית לבחון את ההשערות הקשורות סופרפוזיציה של מתח חילוף החומרים עם גורמים הידרודינמית בוויסות של תפקוד האנדותל והפתולוגיה. השירות צדדיות של הגישה באה לידי ביטוי באופן נרחב דרך את התוצאות הבאות מייצגות.

באיור 1. מאמץ גזירה דיפרנציאלי מודולציה THP-1 הידבקות התא TNF-אלפא monolayers אנדותל מודלק. נתונים אלה נרכשו באמצעות פרוטוקול מפורט לעיל ותיעד בווידיאו. Monolayers HAEC נחשפו בעת ובעונה אחת מינון נמוך של ציטוקינים דלקתיים TNF-α (0.5 ng / ml, EC ~ ₅₀ עבור VCAM-1 את ויסות) ואו HSS (15 dynes / cm ²⁾ או OSS (0 ± 5 dynes / ² ס"מ, 1 הרץ) ב CSD מותאם אישית עבור שעות 4 כמו descriהמיטה בפרוטוקול מפורט. THP-1 תא המעצר היה לכמת תחת זרימת גזירה בתא זרימת PDMS. קו זה תא המחקה את הפנוטיפ של מונוציטים אדם נבחר שחזור שלו וקלות השימוש. HSS נחלש את התגובה הדלקתית לעומת OSS, וכתוצאה מכך ירד מעצר-1 THP התא. הנתונים נותחו על ידי הסטודנטים של מבחן t ו מיוצגים ממוצע ± SEM של 3 ניסויים בלתי תלויים. עיבוד באישור DeVerse et al. ⁵

את הנתונים הבאים ממחישים את צדדיות של הגישה שלנו באמצעות דוגמאות מן העבודה לאור שלנו. יציאות מן הפרוטוקול הנ"ל מסומנים לפי העניין.

איור 2. אפנון של ביטוי ציטוקינים הנגרמת-1 VCAM וגיוס מונוציטים ב שיפוע מאמץ גזירה. א) monolayers HAEC היו מגורה עם TNF-α (0.3 ng / ml) עבור 4 שעות תחת פלוw ב VMMC תוכנן בהתבסס על התיאוריה Hele, שו זרימה. ¹⁵ ירידה ליניארית בעוצמת SS לאורך קו האמצע של ערוץ הושגה על ידי עיצוב הצדדיים של החדר יעלה בקנה אחד עם מייעלת הזרימה 2 קיפאון ממדית ועיצוב בסוף הערוץ להתאים את ISO-פוטנציאליים הקווים. הלחץ גזירה הקיר (τ _W) שנוצר לאורך קו האמצע של ערוץ זה במרחק צירית מהכניסה (x) נתון על ידי:

שם μ הוא צמיגות של המדיום, ש הוא שיעור זרימת נפח, h הוא גובה התעלה, w ₁ היא הכניסה את רוחב הערוץ, ו-L הוא אורך הערוץ הכולל. Q נבחרה כדי ליצור שיפוע בסדר גודל SS מ 16 dynes / ² ס"מ על כניסת עד 0 בנקודת קיפאון "" הפרוקסימלי רק כדי outleלא. B)-C) VCAM-1 הביטוי נמדד באתרו על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באמצעות נוגדנים מצומדות על נקודות קוונטיות והציג כמו עוצמת הקרינה אחוז החציוני (MFI) לחוק הפיקוח סטטי unstimulated. אס לא לווסת את רמת הבסיס של VCAM-1, שהוא נמוך HAEC unstimulated (משולשים אפורים). עם זאת, VCAM-1 ביטוי מוגבר יחסית TNF-α על הבהירויות LSS, לשיא ב ~ 2 dynes / ² ס"מ ולחזור הבסיס TNF-α או מתחת בכל הבהירויות גזירה> dynes ^5/2 ס"מ (ריבועים שחורים). ד) מונוציטים (10 ⁶ / מ"ל) היו perfused ב 2 dynes / ² ס"מ על 5 דקות בכל ערוצי הזרימה במקביל על monolayers preconditioned כמו). גיוס מונוציטים כדי האנדותל בקורלציה כמותית על גודל נתון מאמץ גזירה עם הביטוי VCAM-1. יש לציין, את היכולת לחקור VCAM-1 ביטוי וגיוס מונוציטים עם רזולוציה מרחבית קנס monolayeמחקר גילה שינויים משמעותיים על פני טווח צר גודל אס כי לא יהיה מוערך על ידי יישום רק כמה ערכים בדידים של גזירה בניסויים נפרדים. הנתונים נותחו על ידי ANOVA צעדים חזר והפרשי שהוערכו על ידי ניומן-Keuls posttest, * p <0.05 מ TNF-α בתנאים סטטיים. הנתונים הם ממוצע ± SEM מ 3-6 ניסויים בלתי תלויים. עיבוד באישור Tsou et al. ²

איור 3. הטריגליצרידים עתירי ליפופרוטאין (TGRL) לווסת ציטוקינים-Induced דלקת ביחס בסרום התורמות רמות טריגליצרידים ו VCAM-1 הביטוי. Monolayers HAEC היו מגורה עם TNF-α (0.3 ng / ml) עבור 4 שעות בו זמנית עם TGRL (10 מ"ג / ד"ל ApoB) מבודד בבני אדם לאחר הארוחה שומן גבוהה בתרבות סטטי.) VCAM-1 הביטוי נמדד בנפרד על ידי cytometry לזרום EC מושעהו הידבקות מונוציטים לכמת באמצעות VMMC כמתואר בפרוטוקול מפורט. הנתונים מוצגים כשינוי% מ TNF-α. מעצרו מונוציטים משתנה ביחס ישר ביטוי האנדותל VCAM-1, אשר הגדילו באופן ישיר מרמת טריגליצרידים בדם התורם. ב ') מעצרו של מונוציטים משנה של הפרו דלקתיים תורמים בוטל בנוכחות נוגדנים VCAM 1-חוסם. משמעות נקבע על ידי זיווג הסטודנטים של מבחן t, כלומר ± SEM מ 3-5 ניסויים בלתי תלויים. עיבוד באישור וואנג et al. ⁴

דיון

אנו מתארים את השימוש במכשירים microfluidic PDMS להערכה על שבב של הפנוטיפ דלקתי האנדותל באמצעות הדמיה בזמן אמת הביטוי CAM ו הידבקות מונוציטים. היתרון העיקרי של הגישה שלנו טמון ביכולת לכמת את התוצאות הקשורות בתפקוד האנדותל בתאים שנחשפו מתווכים דלקתיים כגון ציטוקינים שומנים תזונתיים בתנאים מוגדרים הידרודינמית ומשקפות מאמץ גזירה בכלי atherogenic. VMMC להקל על השימוש כמויות קטנות של חומרים כימיים או חומרים שעשויים להיות בהיצע מוגבל ויש להם את היתרונות נוסף של להיות זול, להתאמה אישית מק...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פריט	חברה	מספר קטלוגי
100 x 20 מ"מ צלחות פטרי	BD פלקון	353003
95% אתנול	EMD כימיקלים	EX0290-1
DPBS	Cellgro	21-031-CV
הקלד לי זנב עכברוש קולגן נגזר	Gibco	A10483-01
אדם לתאי אנדותל העורקים	Genlantis	PH30405A
אנטיביוטיקה Antimycotic פתרון	Invitrogen	15240-062
אנדותל BulletKit	Lonza	CC-4176
הבסיס אנדותל Media-2	Lonza	CC-3156
10 מ"ל מזרקים	BD פלקון	309604
פוליאוריתן צינורות	Tygon	ABW0001
ליבוביץ, 15 מדיה	Gibco	11415-069
Sylgard 184 אלסטומר סיליקון בסיס	Dow Corning	184
Sylgard 184 אלסטומר סיליקון אשפרה הסוכן	Dow Corning	184
SU8 photoresist ופלה מאסטר	UC Davis פאן מעבדה	N / A
Eclipse TE200 מיקרוסקופ הפוך	ניקון	Eclipse TE200
מזרק משאבה	הרווארד Apparatus	PHD2000
19 המזרק מחט מד	קנדל	8881
THP-1 תא Monocytic קו	ATCC	TIB-202
HBSS (הנקס שנאגרו תמיסת מלח) עם Ca 2 + / Mg 2 +	Gibco	14025-092
הגידול גורם נמק אלפא (TNF-α)	מחקר ופיתוח מערכות	210-TA-010
פקטור נגזר סטרומה - 1 (SDF-1)	מחקר ופיתוח מערכות	350-NS-010
RPMI 1640	Cellgro	10-040-CV
האדם אלבומין בסרום (HSA)	ZLB בהרינג	NDC 0053-7680-32