חדרי זרימת microfluidic חרוט על ידי photolithography מפוברק מ PDMS מוחלים לחקור התוצאות התפקודיות הקשורות בתפקוד EC ודלקת. בניסוי מייצג, את היכולת של מאמץ גזירה ההפרש לווסת הידבקות התא monocytic כדי הפעלת ציטוקינים EC monolayers באה לידי ביטוי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
על שבב phenotyping דלקתיות האנדותל
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
Atherogenesis הוא potentiated על ידי הפרעות מטבוליות שתורמים למדינה מוגברת של דלקת מערכתית וכתוצאה מכך תפקוד האנדותל. עם זאת, שינויים תפקודיים מוקדמים האנדותל מסמנים כי רמת הסיכון של הפרט לא מוערכים ישירות קלינית לעזור האסטרטגיה מדריך טיפולי. יתר על כן, ויסות דלקת ידי ופרמטרים המודינמיים מקומיים תורם ההפצה הלא אקראית המרחבי של טרשת עורקים, אך המנגנונים קשה להתוות in vivo. אנו מתארים גישה מבוססת מעבדה על שבב כדי ההפרעות כמותית assay חילוף החומרים של אירועים דלקת בתאי אנדותל אנושיים (EC) ומונוציטים בתנאים תזרים מדויקות. שיטות סטנדרטיות של ליתוגרפיה רך משמשים microfabricate כלי הדם לתאי microfluidic כוזב (VMMC), אשר קשורים ישירות בתרבית monolayers EC. 1 מכשירים אלה יש את היתרון של שימוש בכמויות קטנות של חומרים כימיים תוךמתן במה הדמיה ישירות את האירועים דלקת קרום בבית של EC נחשף לשדה מוגדר היטב גזירה. יש לנו מיושם בהצלחה את המכשירים האלו לחקור ציטוקינים-2, שומנים בדם 3, 4 ו - 5 RAGE-Induced דלקת האנושי אבי העורקים EC (HAEC). כאן אנו מתעדים את השימוש VMMC לתא assay מתגלגל monocytic (THP-1) ומעצר על monolayers HAEC כי הם מותנים על פי מאפיינים גזירה דיפרנציאלי והופעל על ידי ציטוקינים דלקתיים TNF-α. מחקרים כגון אלה מספקים תובנה מכניסטית לתוך atherosusceptibility תחת גורמי סיכון מטבוליים.
פרוטוקול
1. התא התרבות הכנת התשתית
- חותכים 3 אינץ' מצעים מעגליות של 100 x 20 מאכל רקמת התרבות מ"מ (BD פלקון) באמצעות מחרטה. לעקר מצעים ידי והשקיעה אתנול 70%. מקום בצלחת פטרי ומעיל עם קולגן 4 מ"ל סוג אני (100 מיקרוגרם / מ"ל) עבור שעות 1 בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף עם 4 x 1 מ"ל PBS.
- להשעות אדם לתאי אנדותל אבי העורקים (HAEC, מעבר 4-6) בשעה 6.5x10 5 תאים למ"ל וזרעי על ידי יישום 1 מ"ל ישירות המצע. מקום 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור ולאפשר התאים להיצמד למצע עבור שעה 1. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מתארים את השימוש במכשירים microfluidic PDMS להערכה על שבב של הפנוטיפ דלקתי האנדותל באמצעות הדמיה בזמן אמת הביטוי CAM ו הידבקות מונוציטים. היתרון העיקרי של הגישה שלנו טמון ביכולת לכמת את התוצאות הקשורות בתפקוד האנדותל בתאים שנחשפו מתווכים דלקתיים כגון ציטוקינים שומנים תזונתיים בתנאים מוגדרים הידרודינמית ומשקפות מאמץ גזירה בכלי atherogenic. VMMC להקל על השימוש כמויות קטנות של חומרים כימיים או חומרים שעשויים להיות בהיצע מוגבל ויש להם את היתרונות נוסף של להיות זול, להתאמה אישית מק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגוד עניינים הצהיר.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NHLBI מענק R01 HL082689 לסקוט א סיימון אנתוני ג Passerini.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פריט | חברה | מספר קטלוגי | |
| 100 x 20 מ"מ צלחות פטרי | BD פלקון | 353003 | |
| 95% אתנול | EMD כימיקלים | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| הקלד לי זנב עכברוש קולגן נגזר | Gibco | A10483-01 | |
| אדם לתאי אנדותל העורקים | Genlantis | PH30405A | |
| אנטיביוטיקה Antimycotic פתרון | Invitrogen | 15240-062 | |
| אנדותל BulletKit | Lonza | CC-4176 | |
| הבסיס אנדותל Media-2 | Lonza | CC-3156 | |
| 10 מ"ל מזרקים | BD פלקון | 309604 | |
| פוליאוריתן צינורות | Tygon | ABW0001 | |
| ליבוביץ, 15 מדיה | Gibco | 11415-069 | |
| Sylgard 184 אלסטומר סיליקון בסיס | Dow Corning | 184 | |
| Sylgard 184 אלסטומר סיליקון אשפרה הסוכן | Dow Corning | 184 | |
| SU8 photoresist ופלה מאסטר | UC Davis פאן מעבדה | N / A | |
| Eclipse TE200 מיקרוסקופ הפוך | ניקון | Eclipse TE200 | |
| מזרק משאבה | הרווארד Apparatus | PHD2000 | |
| 19 המזרק מחט מד | קנדל | 8881 | |
| THP-1 תא Monocytic קו | ATCC | TIB-202 | |
| HBSS (הנקס שנאגרו תמיסת מלח) עם Ca 2 + / Mg 2 + | Gibco | 14025-092 | |
| הגידול גורם נמק אלפא (TNF-α) | מחקר ופיתוח מערכות | 210-TA-010 | |
| פקטור נגזר סטרומה - 1 (SDF-1) | מחקר ופיתוח מערכות | 350-NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | |
| האדם אלבומין בסרום (HSA) | ZLB בהרינג | NDC 0053-7680-32 |
טבלה 2. חומרים כימיים ספציפיים וציוד.
מקורות
- Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response. Lab Chip. 7, 448-456 (2007).
- Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
