מאמר שיטה

טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

DOI:

10.3791/4204

⸱

28 באוגוסט 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Texas Medical Branch , 2Department of Neuroscience and Cell Biology, University of Texas Medical Branch

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה לטיהור בקנה מידה גדולה של התחום התאי APP (AICD) מתוארת. גם אנו מתארים שיטה כדי לגרום במבחנה צבירת AICD והדמיה על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. בשיטות המתוארות שימושיות לאפיון ביוכימי / המבני של AICD ואת ההשפעות של מלווים מולקולריים על הצבירה שלו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבון מבשר עמילואיד (APP) הוא חלבון הטרנסממברני אני סוג קשור בפתוגנזה של המחלה (לספירה) אלצהיימר. APP מאופיין בתחום תאי גדול ותחום cytosolic קצר כינה התחום התאי APP (AICD). במהלך התבגרות דרך מסלול ההפרשה, APP ניתן בקע ידי פרוטאזות המכונות α, β, וγ-secretases 1. מחשוף פרוטאוליטי רציף של APP עם β-γ וsecretases מוביל לייצור של פפטיד קטן פרוטאוליטי, Aβ כינה, שהוא amyloidogenic ומרכיב הליבה של פלאק סנילי. AICD גם משוחרר מהקרום לאחר עיבוד סקרטאז, ובאמצעות אינטראקציות עם Fe65 וTip60, יכולה translocate לגרעין להשתתף בויסות שעתוק של גני המטרה מרובים 2,3. אינטראקציות בין חלבונים המעורבים AICD עשויות להשפיע על סחר, עיבוד, ופונקציות סלולריות של הולוגרמות APP וC-terminברי al. אנחנו הראינו לאחרונה שAICD יכול המצרפי במבחנה, ותהליך זה מעוכב על ידי ubiquilin-1 מלווה AD-מעורב מולקולרי 4. באופן עקבי עם ממצאים אלה, AICD חשף תחומים הידרופובי והוא מהותי מופרע במבחנת 5,6, אולם זה מקבל מבנה שניוני יציב כאשר חייב Fe65 7. אנחנו הצענו שubiquilin-1 מונע אינטראקציות בין intramolecular ולא תקינות של AICD, מניעת צבירה במבחנה בתאים שלמים 4. בעוד שרוב המחקרים מתמקדים בתפקידו של APP בפתוגנזה של ספירה, את התפקיד של AICD בתהליך זה אינו ברור. ביטוי של AICD הוכח לגרום לאפופטוזיס 8, לווסת את מסלולי איתות 9, ולהסדיר סיד איתות 10. על הביטוי של AICD וFe65 במודל עכבר מהונדס גורם אלצהיימר כמו 11 פתולוגיה, ולאחרונה AICD זוהה בחזייהבlysates ידי מערבי סופג בעת שימוש בטכניקות אחזור אנטיגן מתאימות 12. כדי להקל על מחקרים מבניים, ביוכימי, וbiophysical של AICD, פתח הליך כדי לייצר כמויות גדולות של חלבון recombinantly AICD הטהור ביותר. בנוסף, אנו מתארים שיטה לזירוז בצבירת תרמית מבחנה של AICD וניתוח על ידי מיקרוסקופ כוח האטומי. בשיטות המתוארות שימושיות לאפיון ביוכימי, biophysical, ומבני של AICD ואת ההשפעות של מלווים מולקולריים על צבירת AICD.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ביטוי של רקומביננטי דומיין התאי APP (AICD)

  1. Transform E. coli להתאמץ BL21 עם AICD אדם (שאריות 649-695 של APP, עצבי איזופורם מספור) משובט לתוך וקטור pGEX-4T-1 (GE Healthcare). הווקטור הזה יבטא AICD כמחצית C-המסוף של חלבון היתוך של-transferase גלוטתיון S (GST). וקטור זה גם מקודד רצף מחשוף תרומבין כדי להקל על הסרת מחצית GST. פרטים של שיבוט AICD לpGEX-4T-1 ניתן למצוא בפרסום הקודם שלנו 4.
  2. ממושבה אחת, לחסן 10 מ"ל של מרק LB עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל), ו דגירת הלילה בש....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה גבשנו הליך לקבלת AICD הטהור ביותר עבור ניתוחים מבניים, biophysical, וביוכימיים. הליך זה אינו דורש ציוד מתוחכם כרומטוגרפיה ולכן הוא נגיש לרוב המעבדות. קבוצות אחרות לא מטוהרות AICD 5-7,16, כולל GST-AICD 17-19, לניתוחים ביוכימיים / מבניים. חסרונות לפרוטוקולים קודמים כוללים מסיסות ירודה של 16 AICD, פחות מטוהר אידיאלי 17, ודרישה להרחקת גודל 16 או הפוך שלב כרומטוגרפיה 6,20. כך, הפרוטוקול המתואר כאן צריך מאוד .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לד"ר הואי ג'נג (יילור לרפואה) לAPP cDNA. עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (עף), קרן ג'ון סילי הזכרון הקרן למחקר ביו (עף), וז'אן וג ויליאם ד ויליס Neuroscience Research קרן (ESS). JMB הוא חוקר בתכנית למלגת מחקר Translational וחבר באוניברסיטת טקסס רפואית סניף קלוד E. פלפל ישן יותר עצמאות מרכז האמריקנים (נתמך על ידי מענקי NIH UL1RR029876 וP30-AG-024832, בהתאמה).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות
pGEX-4T-1 GE Healthcare 28-9545-49
תרומבין GE Healthcare 27-0846-01
אמפיצילין הפישר סיינטיפיק BP1760
מגיב assay חלבון ברדפורד Bio-Rad 500-0002
Coomassie כחול Bio-Rad 161-0786
IPTG (thiogalactopyranoside איזופרופיל-beta-D) סיגמה אולדריץ I6758
גלוטתיון-agarose סיגמה אולדריץ G4510
p-aminobenzamidine-agarose סיגמה אולדריץ A7155
קוקטייל מעכב פרוטאז מלא רוש 11836170001
קלטות דיאליזת Slide-A-Lyzer Thermo Scientific 66380
עמודות כרומטוגרפיה מדעי אוורגרין 208-3367-050
מתחלב Avestin, Inc EmulsiFlex-C3 מומלץ ביותר
אפנדורף Thermomixer אפנדורף 022670107
דיסקים יציצו טד פלה 50-12
cantilevers AFM ברוקר MSNL-10
WSxM תוכנה Nanotec N / Free הורדה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease. Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).
  2. Chang, K. A., Suh, Y. H. Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

thrombinGSTMolecular ChaperoneWestern Blotting

מאמרים קשורים