טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

סיכום

שיטה לטיהור בקנה מידה גדולה של התחום התאי APP (AICD) מתוארת. גם אנו מתארים שיטה כדי לגרום במבחנה צבירת AICD והדמיה על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. בשיטות המתוארות שימושיות לאפיון ביוכימי / המבני של AICD ואת ההשפעות של מלווים מולקולריים על הצבירה שלו.

תקציר

חלבון מבשר עמילואיד (APP) הוא חלבון הטרנסממברני אני סוג קשור בפתוגנזה של המחלה (לספירה) אלצהיימר. APP מאופיין בתחום תאי גדול ותחום cytosolic קצר כינה התחום התאי APP (AICD). במהלך התבגרות דרך מסלול ההפרשה, APP ניתן בקע ידי פרוטאזות המכונות α, β, וγ-secretases ^1. מחשוף פרוטאוליטי רציף של APP עם β-γ וsecretases מוביל לייצור של פפטיד קטן פרוטאוליטי, Aβ כינה, שהוא amyloidogenic ומרכיב הליבה של פלאק סנילי. AICD גם משוחרר מהקרום לאחר עיבוד סקרטאז, ובאמצעות אינטראקציות עם Fe65 וTip60, יכולה translocate לגרעין להשתתף בויסות שעתוק של גני המטרה מרובים ^2,3. אינטראקציות בין חלבונים המעורבים AICD עשויות להשפיע על סחר, עיבוד, ופונקציות סלולריות של הולוגרמות APP וC-terminברי al. אנחנו הראינו לאחרונה שAICD יכול המצרפי במבחנה, ותהליך זה מעוכב על ידי ubiquilin-1 מלווה AD-מעורב מולקולרי ^4. באופן עקבי עם ממצאים אלה, AICD חשף תחומים הידרופובי והוא מהותי מופרע במבחנת ^5,6, אולם זה מקבל מבנה שניוני יציב כאשר חייב Fe65 ^7. אנחנו הצענו שubiquilin-1 מונע אינטראקציות בין intramolecular ולא תקינות של AICD, מניעת צבירה במבחנה בתאים שלמים ^4. בעוד שרוב המחקרים מתמקדים בתפקידו של APP בפתוגנזה של ספירה, את התפקיד של AICD בתהליך זה אינו ברור. ביטוי של AICD הוכח לגרום לאפופטוזיס ^8, לווסת את מסלולי איתות ^9, ולהסדיר סיד איתות ^10. על הביטוי של AICD וFe65 במודל עכבר מהונדס גורם אלצהיימר כמו ¹¹ פתולוגיה, ולאחרונה AICD זוהה בחזייהבlysates ידי מערבי סופג בעת שימוש בטכניקות אחזור אנטיגן מתאימות ^12. כדי להקל על מחקרים מבניים, ביוכימי, וbiophysical של AICD, פתח הליך כדי לייצר כמויות גדולות של חלבון recombinantly AICD הטהור ביותר. בנוסף, אנו מתארים שיטה לזירוז בצבירת תרמית מבחנה של AICD וניתוח על ידי מיקרוסקופ כוח האטומי. בשיטות המתוארות שימושיות לאפיון ביוכימי, biophysical, ומבני של AICD ואת ההשפעות של מלווים מולקולריים על צבירת AICD.

פרוטוקול

1. ביטוי של רקומביננטי דומיין התאי APP (AICD)

1. Transform E. coli להתאמץ BL21 עם AICD אדם (שאריות 649-695 של APP, עצבי איזופורם מספור) משובט לתוך וקטור pGEX-4T-1 (GE Healthcare). הווקטור הזה יבטא AICD כמחצית C-המסוף של חלבון היתוך של-transferase גלוטתיון S (GST). וקטור זה גם מקודד רצף מחשוף תרומבין כדי להקל על הסרת מחצית GST. פרטים של שיבוט AICD לpGEX-4T-1 ניתן למצוא בפרסום הקודם שלנו ^4.
2. ממושבה אחת, לחסן 10 מ"ל של מרק LB עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל), ו דגירת הלילה בשעת 37 ° C עם רעד בגוף נמרץ.
3. למחרת בבוקר, לחסן LB 400 מ"ל / אמפיצילין בבקבוק 1 ליטר עם 5 מ"ל של תרבות הלילה.
4. לדגור על 37 ° C עם הרעד הנמרץ עד הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר הגיע 0.4-0.6. זה יהיה בדרך כלל לוקח 2-2.5 שעות.

> תוכן "בשלב זה עשוי להיות רצוי להוציא מדגם קטן (~ 10 μl) לעקוב טיהור על ידי SDS-PAGE (ראה איור 1 א ', ב'). כל שלב טיהור הבאה צריך גם להסיר aliquot קטן לניתוח על ידי SDS-PAGE.

5. לגרום לביטוי GST-AICD ידי הוספת 0.4 מ"מ של איזופרופיל-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG). לדגור על 37 ° C עם הרעד נמרץ במשך 5 שעות.
6. צנטריפוגה תאי XG ב 6000 במשך 15 דקות ב 4 ° C. תא הגלולה יכולה להיות מאוחסנת ב-80 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים, בשלב זה של ההליך.

2. טיהור של GST-AICD

1. הכן את חיץ תמוגה מ"ל 50 כדלקמן: 1 המ"מ dithiothreitol, 1mm ethylenediaminetetraacetic החומצה (EDTA), 0.1% Triton-x100, פלואוריד 1 מ"מ phenylmethylsulfonyl (PMSF), קוקטייל מעכב פרוטאז שלם (רוש מדע יישומים), ונאגר מלוח פוספט. צ'יל על קרח.
2. הפשר גלולת חיידקים (אם הוקפא בעבר) עלקרח.

בשלב זה, זה קריטי, כי כל הצעדים נעשים ב 4 ° C כדי להגביל proteolysis. כל הצינורות, חוצצים, ומגיב אחרים צריכים להיות מראש מצוננים. אם באמצעות עיתונות או מתחלב לתמוגה צרפתית, אלה צריכים להיות מראש מצוננים גם.

3. יסודיות resuspend גלולת חיידקים ב20 מ"ל של חיץ תמוגה. שילוב של vortexing וטחינה דקה עם פיפטה 10 מ"ל על קרח יבטיח resuspension המלא של הגלולה.
4. להעביר את התאים חיידקיים באמצעות resuspended מתחלב (לדוגמה, Avestin EmulsiFlex-C3) או תא לחץ צרפתי, מראש מצוננים ל4 מעלות צלזיוס ב30,000 psi. תעבור דרך lysate מתחלב בפעם שנייה. איסוף lysate לתוך צינור מראש מקורר 50 מ"ל.

היתרון העיקרי של שני המכשירים האלה הוא שהם למזער חימום של המדגם. הטכניקה הנפוצה של sonication מפיק חום משמעותי בקצה של החללית וsonicationיכול לגרום לצבירה של חלבונים רקומביננטיים.

5. צנטריפוגה lysate ב15000 XG למשך 30 דקות. להפריד ולשמור את supernatant לתוך צינור מראש מקורר 50 מ"ל.
6. הוסף 500 μl של slurry 50% מגלוטתיון-agarose (סיגמא אולדריץ). סובב למשך 30 דקות ב 4 ° C. בעוד המדגם מסתובב, לעשות חיץ elution טרי: 50 mM טריס 7.8, 0.1% Triton-x100, 0.5 המ"מ dithiothreitol, 10 מ"מ גלוטתיון המופחת.

הצעד היחיד של הפרוטוקול שמתבצע בטמפרטורת חדר הוא צעד elution. לכן, חיץ elution נשמר בטמפרטורת חדר. חיץ elution צריך להיות מוכן טרי.

7. יוצק lysate ותרחיף ל" עמודת כרומטוגרפיה פנויה 5 עם קלקר (90-130 מיקרומטר) מסננים גסים (מדעי אוורגרין). לשטוף את העמודה 5 פעמים עם 3 מ"ל של פוספט נאגר מלוח.
8. מכסה את החלק התחתון של העמודה ולהוסיף 500 μl של חיץ elution טמפרטורת חדר. מכסה את החלק העליון שלטור ולסובב למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. איסוף eluate לתוך צינור microfuge מצונן 1.5 מ"ל. חזור elution עוד פעמים (1.5 eluate הכולל מ"ל).
9. דיאליזת eluate בקרום 10,000 משקל מולקולרי הפסקת דיאליזה (למשל, Thermo Scientific קלטות Slide-A-Lyzer דיאליזה) ב 4 ליטר של פוספט נאגרה מלוחה הלילה ב 4 ° C. הדיאליזה כנגד 4 ליטר נוסף של פוספט נאגרה מלוחה ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ביום המחרת.
10. הסר את החלבון מקלטת הדיאליזה ולבצע בדיקת חלבון כימות לקביעת תשואה של GST-AICD. טיהור טיפוסית מ400 מ"ל של התרבות תגרום לתשואות של> 20 מ"ג של חלבון מטוהר בריכוזים של 10-20 מ"ג / מ"ל. Aliquot החלבון לתוך 200 aliquots והקפאה μl ב -80 ° C.

3. מחשוף של תרומבין GST-AICD וטיהור AICD

1. 200 μl ההפשרה של מטוהרי GST-AICD ולהוסיף 20 μl של thromb 1 U / μlפנימה דגירת הלילה בשעת 37 ° C.

האיכות והטוהר של תרומבין משתנים באופן ניכר בין יצרנים, ויכולות להיות מקור משמעותי של זיהום. אנו משתמשים בתרומבין מGE Healthcare (ראה טבלה של חומרים כימיים). לאחר דגירת הלילה,> 95% מחלבון ההיתוך יש בקע (1B איור).

2. אחרי הלילה עם מחשוף תרומבין, סביר להניח שחלק של AICD המשוחרר עבר צבירה והפתרון יכול להופיע מעונן. נקה את החומר מצטבר ידי צנטריפוגה ב20000 XG למשך 30 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant לתוך צינור microfuge מראש מצונן.
3. הוסף 50 μl של 50% גלוטתיון-agarose slurry ו50% μl 50 p-aminobenzamidine-agarose slurry להסיר GST ותרומבין, בהתאמה. דגירה עם רוטציה למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
4. צנטריפוגה בקצרה למשקעים את חרוזי agarose, ולהסיר את supernatant לתוך צינור טרי. חלץ tהוא GST ארבע פעמים יותר עם גלוטתיון-agarose. חילוץ יחיד עם p-aminobenzamidine-agarose מספיק כדי להסיר את 20 U של תרומבין.
5. בצע בדיקת quantitation חלבון על 5 μl של AICD המטוהרים. תשואות אופייניות מתרבות מ"ל 400 הן 50-100 מיקרוגרם בריכוז של 0.2-0.5 מ"ג / מ"ל. תשואות גבוהות יותר הן אפשריות על ידי ביקוע בכמויות גדולות של GST-AICD.

המטוהר AICD צריך להיות מוכן טרי לאפיון ביוכימי / biophysical. חומרים שאינם בשימוש אמורים להיות מושלכים. אפשר גם להתרכז AICD ידי lyophilizing המדגם וresuspending בנפח קטן יותר של ⁶ חיץ. אם גילוי AICD דורש סופגים (כגון לאחר מלכודת מסנן או assay כתם הנקודה), אחזור אנטיגן על הקרום צריך להתבצע כפי שמתואר על ידי Pimplikar ^ו12 Suryanarayana.

4. צבירת AICD למיקרוסקופי כוח אטומי (AFM)

1. דלל טרי AICD בעמ hosphate נאגר מלוח לריכוז של 0.1 מ"ג / מ"ל ​​בנפח סופי של 15 μl. בשלב זה, תרכובות שונות ו / או חלבונים ניתן להוסיף על מנת לקבוע אם הם מעכבים צבירת AICD. לדוגמה, יש לנו הראינו כי ריכוזי equimolar של ubiquilin-1 למנוע צבירה של AICD בassay ⁴ זה.

אפשר גם לאמצעי תגובה גדולה יותר הכולל לניסויים ביוכימיים כגון מבחני מלכודת סינון ופיזור אור ^4. היינו לנו הצלחה בביצוע מבחני מלכודת סינון על תערובות תגובה גדולה כמו 400 μl עם AICD דילול לריכוזים נמוכים כמו 1 מיקרומטר.

2. לגרום להצטברות תרמית על ידי דוגר את הדגימות ב 43 ° C עם הרעד ב800 סל"ד באפנדורף Thermomixer עבור 48 שעות. טמפרטורה זו נבחרה על בסיס מבחנים שבוחנים מלווה צבירת התרמית של synthase מודל מלווה מצע ציטראט ^4,13.

> צבירה תרמית היא שיטה נפוצה לגרום למעבר המבני של חלבון מילידי מבנה שאינו ילידים (שהיא בדרך כלל גיליון ביתא עשיר) אשר גורם להיווצרות של אגרגטים מולקולאריים. צבירה תרמית משמשת גם כדי לבחון את תפקודו של מלווים מולקולריים, שגוננו מגזרים הידרופובי מ טביעת אינטראקציות מולקולאריים בלתי הולמות (ובכך לעכב או למנוע צבירת תרמית).

3. דלל את המדגם 20-לקפל במי deionized ו2 μl המקום אל תציץ טרי בקע. ייבש את הדגימה בdessicator בן לילה. יהיה צורך לקבוע באופן אמפירי הדילול האופטימלי להדמיה, וכך כמה דילולים נעים בין 10 - ל 100-קיפול יהיו זהירים.
4. דמיינו AICD מצטבר באמצעות הפעלת AFM במצב הקשה ^14. את cantilevers משמש הם מנופים מצופים זהב מייקר חד ניטריד (MSNL, ברוקר) עם רדיוס קצה נומינלי של 2 ננומטר. טיפוסי קשה אמפליטודות durבאמצעות הדמיה היא 10-20 ננומטר בתדר התהודה של cantilevers (30-50 קילוהרץ).

מצאנו כי איכות תמונה וחדות של אגרגטים חלבון שונים תלויה בכח המופעל ואת משך הניסוי. כדי למזער את הפרעות מדגם על ידי הקצה, שמרנו את הכח המופעל נמוך יחסית על ידי שמירה על יחס קבוע של מעל 95% והגבלת הסריקה של כל דגימה לדקות 5-10. עיבוד תמונה בוצע עם WSxM תוכנה (Nanotec). עיבוד תמונה סטנדרטי הורכב ממטוס החיסור והשטחה. המעבדות שלנו משתמשות ב" הבית נבנה ^"15 AFM interfaced למערכת מסחרית סריקת בדיקת מיקרוסקופ שליטה (Nanotec).

5. נציג תוצאות

הביטוי וההעשרה יחסית של GST-AICD מוצג באיור 1 א. לאחר תמוגה, רוב חלבון ההיתוך נמצא בחלק המסיס, ולכן חילוץ מinclusiעל גופו לא נדרש. חומר eluted מעמודת agarose גלוטתיון הוא> 95% טהורים. בהכנה מוצגת באיור 1, הריכוז של חלבון eluted מהעמודה היה 14.5 מ"ג / מ"ל, והתשואה הייתה 22 מ"ג (מתרבות מוצא של 400 מ"ל). מחשוף של 200 μl הכנת הלילה עם 20 U של תרומבין זה הביא לכמעט 100% ממחשוף חלבון ההיתוך (1B איור). הסכום של תרומבין המשמש הוא נמוך מספיק כדי לא להתגלות על ידי צביעה הכחולה Coomassie (ראה מסלול, 1B "בקע" איור). הסרת תרומבין וGST ביאה לירידה בחלק מחומר, אולם זה היה> 90% טהור עם תשואה בהכנת השיעורים של 70 מיקרוגרם של AICD בריכוז של 0.35 מ"ג / מ"ל. התרשים 1C מציג את תרשים הזרימה לצבירה של AICD וניתוח שלאחר מכן. אגרגטים AICD צפו בי ידי AFM הם בדרך כלל אליפטית / אמורפי, וטווח בגודל 50-100 ננומטר (1D איור, F). מצטברחומר הוא לא ניתן לגילוי כאשר סכום equimolar של מלווה ubiquilin-1 מתווסף לתגובת הצבירה (האיור 1E) ^4.

איור 1. טיהור וצבירה של AICD.) מכתימה Coomassie כחול של דגימות שנאספו בכל שלב של תהליך הטיהור. לדגימות uninduced ומושרות, 20 μl של חיידקים כלל היה לרוץ על ג'ל. לשבריר supernatant, 5 μl של lysate (מנפח כולל של 20 מ"ל) היה לרוץ על ג'ל. לשבריר הגלול, הגלולה הייתה resuspended ב 20 מ"ל של חיץ תמוגה, ו 5 μl של חומר זה היה sonicated בsonicator אמבט מים למשך 30 דקות ב 4 ° C לפני העמיס על ג'ל. לflowthrough, 5 μl היה לרוץ על ג'ל. סכומי eluate הועמסו על ג'ל מצוינים. B) ג'ל הצבעוני הכחול Coomassie של uncleaved ובקע GST-AICD (2 μl) ו1 ו 5 & מ 'u; l מטוהרי AICD. ג) תרשים זרימה של טיהור AICD, צבירה, וניתוח. D, E) תמונה של נציג AFM מצטבר תרמית AICD בהעדר (ד ') והנוכחות (ה) של המלווה המולקולרי ubiquilin-1. F) היסטוגרמה של התפלגות הגודל של אגרגטים AICD.

דיון

בפרוטוקול זה גבשנו הליך לקבלת AICD הטהור ביותר עבור ניתוחים מבניים, biophysical, וביוכימיים. הליך זה אינו דורש ציוד מתוחכם כרומטוגרפיה ולכן הוא נגיש לרוב המעבדות. קבוצות אחרות לא מטוהרות AICD ^5-7,16, כולל GST-AICD ^17-19, לניתוחים ביוכימיים / מבניים. חסרונות לפרוטוקולים קודמים כוללים מסיסות ירודה של ¹⁶ AICD, פחות מטוהר אידיאלי ^17, ודרישה להרחקת גודל ¹⁶ או הפוך שלב כרומטוגרפיה ^6,20. כך, הפרוטוקול המתואר כאן צריך מאוד ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
pGEX-4T-1	GE Healthcare	28-9545-49
תרומבין	GE Healthcare	27-0846-01
אמפיצילין	הפישר סיינטיפיק	BP1760
מגיב assay חלבון ברדפורד	Bio-Rad	500-0002
Coomassie כחול	Bio-Rad	161-0786
IPTG (thiogalactopyranoside איזופרופיל-beta-D)	סיגמה אולדריץ	I6758
גלוטתיון-agarose	סיגמה אולדריץ	G4510
p-aminobenzamidine-agarose	סיגמה אולדריץ	A7155
קוקטייל מעכב פרוטאז מלא	רוש	11836170001
קלטות דיאליזת Slide-A-Lyzer	Thermo Scientific	66380
עמודות כרומטוגרפיה	מדעי אוורגרין	208-3367-050
מתחלב	Avestin, Inc	EmulsiFlex-C3	מומלץ ביותר
אפנדורף Thermomixer	אפנדורף	022670107
דיסקים יציצו	טד פלה	50-12
cantilevers AFM	ברוקר	MSNL-10
WSxM תוכנה	Nanotec	N /	Free הורדה