הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שלפוחיות עור Autoantibody-Induced granulocyte תלויים

10.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4250

⸱

12 באוקטובר 2012

 ,  , 
1Department of Dermatology, University of Freiburg , 2Kepler High School Freiburg, 3Centre for Biological Signalling Studies (BIOSS), University of Freiburg

במאמר זה

סיכום

במודל של בעלי החיים המתוארים בעבודה הנוכחית שלנו, מטוהרי נוגדני IgG נגד מתיחה של 200 חומצות אמינו (aa 757-967) של קולגן VII מוזרקים שוב ושוב לעכברים להתרבות פנוטיפ שלפוחיות כמו גם histo וimmunopathological תכונות אופייניות לאדם epidermolysis ולוזה acquisita (EBA) 1.

תקציר

תופעות אוטואימוניות להתרחש אצל אנשים בריאים, אבל כאשר סובלנות עצמית נכשלה, התגובה אוטואימונית עלולה לגרום לפתולוגיה ספציפית. לדברי Witebsky של נחות היסוד, אחד מהקריטריונים באבחון מחלה אוטואימונית כהיא השעתוק של המחלה בחיות מעבדה על ידי ההעברה הפסיבית של נוגדנים עצמיים. לepidermolysis ולוזה acquisita (EBA), מחל אוטואימונית איבר ספציפי לאבטיפוס של קרום עור ורירי, מספר מודלים ניסיוניים שהוקמו לאחרונה. במודל של בעלי החיים המתוארים בעבודה הנוכחית שלנו, מטוהרי נוגדני IgG נגד מתיחה של 200 חומצות אמינו (aa 757-967) של קולגן VII מוזרקים שוב ושוב לעכברים להתרבות פנוטיפ שלפוחיות כמו גם histo וimmunopathological תכונות אופייניות לאדם 1 EBA. מחלה נפוצה במלוא מובן מילה נתפסת בדרך כלל 5-6 ימים לאחר הזריקה הראשונה והיקף המחלה בקורלציה עם המינון של c מנוהלollagen השביעי ספציפי IgG. הניזק לרקמות (היווצרות שלפוחית) בEBA הניסיוני בהתאם לגיוס וההפעלה של גרנולוציטים ידי נוגדנים עצמיים רקמות בכריכת 2, -4. לכן, מודל זה מאפשר לנתיחה של המסלול הדלקתי granulocyte התלוי המעורבים בניזק לרקמה אוטואימונית, כמודל מתרבה רק שלב T תא העצמאי של התגובה אוטואימונית efferent. יתר על כן, הערך שלו מודגש על ידי מספר המחקרים הממחישים את פוטנציאל שלפוחית ​​וישכנע של נוגדנים עצמיים בגוף חי וחוקרים את מנגנון היווצרות הכיב בEBA 1,3, -6. לבסוף, מודל זה יהיה מאוד להקל על הפיתוח של טיפולים חדשים נגד הדלקת במחל autoantibody מושרות. בסך הכל, מודל חית ההעברה הפסיבית של EBA הוא מודל מחלה נגישה ומאלף ויסייע לחוקרים לנתח לא רק פתוגנזה EBA אבל לענות בסיסי ביולוגי וקלינישאלות אוטואימוניות חיוניות.

פרוטוקול

1. הכנת הנוגדנים פתוגניים

הערה: טיהור וריכוז של הנוגדנים צריכות להתבצע באותו היום, כפי שנוגדנים אינם להיות מאוחסנים ב0.1 מ 'גליצין pH 2.5-3 (חיץ elution) במשך הלילה (ON).

טיהור זיקה של IgG: 25 מ"ל של שימוש בסרום ארנבת חיסוני:

  1. הפשר סרום הארנב על ב 4 ° C, לערבב אותו עם 01:01 1xPBS (ריצת חיץ) וחובצה את זה ב1260 XG למשך 10 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לחלופין, צעד סינון עם מסנן נייר יכול להיכלל לאחר צנטריפוגה במקרה הסרום הוא שומן.
  2. בינתיים, לשטוף את חלבון G מטריצה ​​מלאת עמודה עם 10 כרכי מיטה (נפח המיטה = נפח מטריצה) של 1XPBS (ריצת חיץ).
  3. החל מדוללים ומסונן סרום לעמודה ודגירה 1 שעה על הפלטפורמה מתנדנדת בטמפרטורת חדר (RT).
  4. אסוף את הזרימה באמצעות (FT) בצינור 50 מיליליטר Flacon. אל תמחק אותו עד הריכוזוכייל של המטוהרים IgG ידוע.
  5. לשטוף מטריצה ​​עם 5 כרכי מיטה של ​​1XPBS ובינתיים להכין 50 צינורות מ"ל פלקון לאיסוף שבריר IgG eluted. חיץ פיפטה 1 מיליליטר חומציות נטרול: 1 ז TRIS pH 10 בכל צינור (שיעור של חיץ 1:20 TRIS יחסית לכמות eluate שתיגבה בדרך אחרת).
  6. החל חיץ 100-150 מ"ל elution: 0.1 מ 'גליצין pH 2.5-3 לעמודה ולאסוף חלק 50 מ"ל (הים). הפוך את צינור 2-3x, למדוד את רמת החומציות ולהוסיף חיץ נטרול עד שהגעת לרמת החומציות 7.2-7.4.
  7. לאסוף כמה טיפין של eluate IgG ובאמצעות חיץ elution כetalon למדוד OD ב 280 ננומטר. אם OD הוא <איסוף עצירה 0.1.
  8. להתחדש מטריצת G חלבון ולאחסן אותו בהתאם להוראות היצרן.

ריכוזיות לפי ultrafiltration עם צינורות Amicon:

  1. שטוף Amicon Ultra (15 מ"ל / 30KDa) צינורות ultrafiltration עם 1XPBS ידי צנטריפוגה דקות 15-20ב3220 XG ב 4 ° C. השלך את FT מAmicon.
  2. מלא את Amicons עם 15 מ"ל של שבריר IgG eluted וצנטריפוגות ל25-30 דקות ב 3220 XG ו 4 מעלות צלזיוס; זמן צנטריפוגה תמיד תלוי בתכולת החלבון של eluate.
  3. השלך FT ולחזור ultrafiltration עד שאין לך חלק eluted עזב.
  4. שטוף IgG המרוכז בהרחבה, פעמים, עם 25-30 דקות 1XPBS ידי צנטריפוגה.
  5. אסוף את הפתרון "הדביק", הצהבהב נוגדנים מAmicon המסנן בנפח סופי של 1,500-2,000 μl של 1XPBS.
  6. ריכוז אמצעי להתכונן IgG באמצעות ספקטרופוטומטר או NanoDrop:
    קונצרט כלשהו. (מ"ג / מ"ל) = A (280 ננומטר) X פקטור דילול / 1,4
  7. לשטוף ולאחסן את Amicons בעקבות הוראות היצרן.

2. הזרקת קולגן VII הספציפי IgG לעכברים

לפני שתתחיל בהליך הניסוי בפועל, לוודא שהפר הניסיוניtocol כתוב ואת כל החומרים מוכנים לניסוי.

  1. הכן את גיליונות נתונים עבור ניקוד המחלה, ELISAs, immunofluorescence (IF) הניתוח וmyeloperoxidase (MPO) assay 4.
  2. תייג את צינורות דם ואיברים, cryomolds כמו גם היסטולוגיה העיבוד והטבעת קלטות.
  3. פתרוני הנוגדנים צריכים להיות מוכנים טריים או מופשר ממניות ומאופיינות ביחס לתגובתיות שלהם (אם כייל ידי מיקרוסקופי ו / או ELISA). פתרון הנוגדן המסונן סטרילי צריך להיות מדולל ב PBS באופן שהמינון הנדרש להזרקה נע בין 250-1000 μl. ודא שיש לך מספיק נוגדנים כדי לבצע את הניסוי כולו.
  4. הכן טרי קרישה: הפרין 20 U / מ"ל ​​ו -8.7 מ"ג / המ"ל קטמין / תערובת 1.3 מ"ג / מיליליטר xylazine להרדמה. כאשר להקריב את העכברים שכותרת צינורות עם פורמלדהיד 3.7% מוכנים.
  5. לעקר מכשירי ניתוח (אזמל, מספריים, צבע עדין והכמתמ"כforcipes ED) ולהכין את מזרקים (מזרקי אינסולין, 1 ו 2 מזרקי מ"ל), מחטים, מצלמה דיגיטלית וכרטיס זיכרון נוסף.

הערה: בצע את כל ההליכים על עכברים מסוממים קטמין / או xylazine isoflurane isoflurane הוא האופציה המועדפת להרדמת בדיקות העור היומיות, כמו עכברים להתאושש במהירות.. עם זאת, בעת צילום תמונות, קטמין 87 מ"ג / ק"ג וxylazine 13 מ"ג / ק"ג בדרך כלל מוזרקת מתחת לעור. להמתת חסד מינון קטמין / xylazine גדל ל קטמין 130 מ"ג / ק"ג וxylazine 20 מ"ג / ק"ג.

  1. בדקו את החיות כבר סומנו למצבו הבריאותי, העור והמראה הכללי שלהם פרווה, לשקול אותם ולמדוד את עובי האוזן שלהם (תמיד מקל על אותה האוזן).
  2. הרשמת ערכים ושינויים בגיליון ההערכה הקלינית שנצפו.
  3. לאסוף 20-30 μl (2-3 טיפין) דם מוריד הזנב במזרק המכיל את אותו הנפח של קרישה.
  4. לחטא את הפרווה ועור באמצעות אתנול 80%.
  5. הזרק פתרון הנוגדן תת עורי לחלק האחורי באמצעות מזרק אינסולין. (עבור אתרים מסוימים (לדוגמה, האוזניים) רק בנפחים קטנים (10-50 μl) הם ריאליים כדי להיות מוזרק.)

זריקות יש לחזור כל יום שני, 4 פעמים. BALB / ג וC57BL6 עכברים של משקל גוף של כ 20 גרם להתחיל לפתח את מחל 3-4 ימים לאחר שהממשל הראשון של 400-500 עד 750 מיקרוגרם נוגדנים עצמיים / g משקל גוף / הזרקה.

כשסיים את הניסוי:

  1. לשים את העכברים תחת הרדמה עמוקה על ידי הזרקת 130 מ"ג / ק"ג ו 20 מ"ג / ק"ג תת עורי קטמין / xylazine, לגרום לדימום המחודש מהווריד הנבוב האחורית ולחתוך את הלב.
  2. איסוף איברים / דגימות רקמות כגון עור: זנבות, אוזן, דם וושט ולשים אותם בצינורות שכותרתו בעבר ופורמלדהיד% PBS או 3.7 מלאים.

כאשר חוזריםמעבדה:

  1. צנטריפוגה הדם ב1200 XG, 10 דקות ב RT לפלזמה נפרדת, להעביר את הפלזמה לצינורות שכותרתו כראוי ולאחסן אותם בהתאם.
  2. שבץ עור הביופסיה בטמפרטורה בינונית Cut אופטימלי באמצעות cryomolds, כראוי למותג, ולאחסן אותם ב-80 ° C.
  3. מניח את דגימות הרקמה שנועדו ליסטולוגיה בתבניות הטבעת התוויות ולשמור אותם בפורמלין 3.7% עד הטבעת פרפין.

3. הערכה קלינית של חומרת מחלה

עכברים יש לבחון מדי יום לנגעים בעור ובריריות והממצאים צריכים להיות מוקלטים באמצעות טפסים מתאימים. הקריטריונים להמתת החסד מוקדמת הם נגעי עור המשפיעים יותר, כי 20% משטח הגוף וירידה במשקל של 5-10% ממשקל הגוף בשלושה ימים רצופים, ספירה לציון מחלה של 5 (טבלה 1).

  1. הנח את העכבר על בטנו. התחל עם אזור הראש, כלומר עם הזכותאוזן ולבדוק לשלפוחיות, שחיקות, קרום בפנימי, כמו גם בצד החיצוני. תמשיך באותה הדרך עם אוזן השמאל.
  2. עיני ימין ושמאל נשלטות סימנים של אודם, התקרחות, שחיקה ו / או קרום.
  3. אזור חוטם מצח והם עברו דרך הבאה, ממשיכים בחלק הגחוני של החוטם, בשפות ובקרום הרירי של הפה.
  4. בחן את הרגל הימנית הקדמית החל מהכפה, נע כלפי מעלה; לעבור לרגל הקדמית השמאלית. הליך אותו דבר עם רגליו האחוריות הימניות ושמאליות.
  5. צחצח דרך הפרווה בצוואר ובגב האזור עם מלקחי נקודה עדינים מעוקלים.
  6. הפך את העכבר על גבה ולבדוק את חלק הגחון, כמו גם את צדדי הגחון של גפיים באותו אופן כמו בעבר.
  7. בדקו את הזנב.
  8. קח תמונות של חלקי גוף הרלוונטיים שבו העכברים לפתח מחלה. יש לשים לב לכמות והאיכות של תמונות.
  9. לחשב את ציוני מחלה הקליניות.

4. בדיקת דגימות עור ופלזמה

  1. היכון, חנות, ו / או לעבד את כל הרקמות שנאספו על פי התכנית.
  2. לחתוך חלקי רקמה קפוא לאם זיהוי של נוגדני ארנבת ורכיבי מערכה משלימה עכבר.
  3. לנתח את תכולת החלבון ואנזים השונה (בדיקת MPO) של תמציות איברי רקמות ו / או קפוא.
  4. סעיף פרפין מוטבע רקמות וכתם עם H & E כדי להמחיש את מידת ניזק לרקמות.
  5. נתח את הפלזמה על ידי ELISA, immunoblot.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההעברה הפסיבית של אנטיגן ספציפיות נוגדני תוצאות במחלה מלאת מפוצץ בעכברים, המזכירים ברמות קליניות, היסטולוגית וimmunopathological EBA האנושי. שלפוחיות, קרומיים, השחיקות וההתקרחות יתפתחו באוזניים, הזרבובית, הרגליים, כפות הרגליים, גב ומסביב לעיניים של העכברים. הסימנים הקליניים הראשונים של המחלה ככל הנראה יופיעו באוזניים ו / או באזור הראש. תצהיר של הארנב IgG הספציפי, ועכבר המשלים C3 הוא זוהה על ידי ישיר אם בצומת אפידרמיס העור בcryosections של עור perilesional. בשלפוחיות בעור lesional ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההעברה הפסיבית של נוגדנים עצמיים לחיות ניסוי היא גישה עיקרית להוכחת פתוגניות 7, -12. מודלים של בעלי חיים שהושגו באמצעות שיטה זו, בנוסף להיות עדות העקיפה לאוטואימוניות 13, לאפשר את חקירתו של שלב efferent של המנגנון הפתוגני. מודל ההעברה הפסיבית של נוגדני עור המושרה granulocyte תלוי שלפוחיות epidermolysis ולוזה acquisita (EBA) שמש לנתח את המנגנונים של ניזק לרקמה בדלקות עור אוטואימוניות. התבררתי גם, כמחלת מודל להפליא מאלפת ללמוד יסוד ביולוגי וקליניים, היבטים מכרי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

החוקרים מכירים בתמיכה על ידי מענקים מForschungsgemeinschaft דויטשה SI-1281/4-1 וBIOSS מהפקולטה לרפואה באוניברסיטת פרייבורג (לCS).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות
אנטיגן רקומביננטי קידוד פלסמידים לצורות רקומביננטי של קולגן VII העכברי זמין המחבר המקביל.
סרום ארנבת חיסוני www.eurogentec.com היו לנו ארנבים לבנים בניו זילנד חוסנו 200 מיקרוגרם של אנטיגן, 3 פעמים במרווחים של שבועות 2. לשם כך יש לנו להשתמש בשירותיו של Eurogentec SA, בלגיה.
החלבון G agarose רוש יישומי מדע 11243233001
עכברי BALB / ג צ'ארלס ריבר מעבדות
מתחם אוקטובר, רקמות-Tek סאקורה Finetek 4583 אוקטובר, טמפרטורה אופטימלית חיתוך
Cryomold הסטנדרטי סאקורה Finetek 4557 25 מ"מ × 20 מ"מ × 5 מ"מ
Cryomold ביניים סאקורה Finetek 4566 15 מ"מ × 15 מ"מ × 5 מ"מ
Uni-Link-Einbettkassette ר 'Langenbrinck 09-0503 עיבוד היסטולוגיה וקלטות הטבעה
Spezial-Tatowierfarbe שוורץ ח Hauptnerund & ריצ'רד Herberholz GmbH & Co KG 71492000 קעקוע דבק
Tatowierzange TZ1 EBECO א Becker & Co GmbH קעקוע מכשיר
הפארין קרל רוט GmbH & Co 7692.1
פורמלדהיד 37% קרל רוט GmbH & Co 7386
קטמין hydrochloride סיגמה אולדריץ Chemie GmbH K2753-1G
hydrochloride Xylazine סיגמה אולדריץ Chemie GmbH X1251-1G
סטרילי PBS Biochrom L182-50
מצלמה דיגיטלית ניקון Coolpix 5400
מזרק מונע יחידת מסנן 0.45 מיקרומטר Millipore
Caliper Mitutoyo 7309 1667338 Farnell (מפיץ)
גיליון ניקוד מחלה הדוגמא enclosed

מקורות

  1. Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen. J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).
  2. Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 225, 401-413 (2011).
  3. Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. PI3Kβ plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes. Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).
  4. Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage. J. Pathol. 212, 56-65 (2007).
  5. Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).
  6. Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).
  7. Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).
  8. Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme. Science. 286, 1732-1735 (1999).
  9. Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., Wölfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. The flavonoid luteolin inhibits Fcγ-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice. PLoS One. 7, e31066(2012).
  10. Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180. J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).
  11. Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease. N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).
  12. Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse. Science. 190, 397-399 (1975).
  13. Rose, N. R., Bona, C. Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited. Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).
  14. Sitaru, C. Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita. Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).
  15. Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Bröcker, E. B., Zillikens, D. Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin. Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).
  16. Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice. Immunol. Lett. , (2012).
  17. Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 224, 234-244 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

VII
שלפוחיות עור Autoantibody-Induced granulocyte תלויים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.