בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry

Summary

אנו מציגים שיטת זרימת cytometry מבוסס לבחון התפתחות תא T In vivo באמצעות מניפולציות גנטיות בעכברי wildtype או רקע רצפטור תא T מהונדס.

Abstract

מערכת חיסונית בריאה דורשת שתאי T מגיבים לאנטיגנים זרים, בעוד שנשארו סובלני לאנטיגנים עצמיים. סידור אקראי של הקולטן התא T (TCR) α ולוקוסי β יוצר רפרטואר תאי T עם מגוון עצום בהספציפיות אנטיגן, הן עצמי וזרות. בחירת הרפרטואר במהלך פיתוח בבלוטת התימוס היא קריטית ליצירת תאי T בטוחים ושימושיים. פגמים בבחירה הרתי לתרום להתפתחות של הפרעות אוטואימוניות וכשל חיסוניים ^1-4.

אבות תאי T מכניסים את התימוס כthymocytes (DN) השלילי כפול שלא מבטא CD4 או CD8 עמיתים לקולטנים. ביטוי של αβTCR ושני עמיתים לקולטנים מתרחש בשלב החיובי הכפול (DP). אינטראקציה של αβTCR עם (pMHC) הציג עצמי פפטיד-MHC על ידי תאים הרתי קובעת את גורלו של thymocyte DP. אינטראקציות זיקה גבוהות להוביל לבחירה וelimina שליליתtion של thymocytes העצמי תגובתי. תוצאה נמוכה זיקת גומלין בבחירה והתפתחות חיוביות של CD4 או CD8 (SP) תאי T חיוביים יחידים המסוגלים לזהות אנטיגנים זרים שהוצגו על ידי ^5-MHC עצמי.

סלקציה חיובית ניתן ללמוד בעכברים עם רפרטואר polyclonal (wildtype) TCR ידי התבוננות הדור של תאי T בשלים. עם זאת, הם לא אידיאליים למחקר של סלקציה שלילית, הכולל מחיקה של אוכלוסיות קטנות אנטיגן ספציפיים. מערכות מודל רבות שמשו ללמוד סלקציה שלילית אך נבדל ביכולתם לסכם אירועים פיסיולוגיים ^6. לדוגמה, בגירוי במבחנה של thymocytes חסר את הסביבה הרתי כי הוא מעורב באופן אינטימי בבחירה, ואילו ממשל של אנטיגן אקסוגני יכול להוביל למחיקה הלא ספציפית של thymocytes ^7-9. נכון לעכשיו, את הכלים הטובים ביותר ללימוד בסלקציה שלילית vivo הם עכברים שמבטאים transgספציפי enic TCR לאנטיגן עצמי אנדוגני. עם זאת, רבי מודלים קלסיים TCR המהונדסים מאופיינים בביטוי המוקדם של שרשרת TCRα המהונדסת בשלב DN, וכתוצאה ממוקדמת סלקציה שלילית. המעבדה שלנו פתחה מודל ^CD4 ח.י., בי המהונדס ח.י. TCRα מתבטא בתנאים בשלב DP, המאפשר סלקציה שלילית להתרחש במהלך עקורים למעבר SP כפי שמתרחש בעכברי wildtype ^10.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול זרימה cytometry מבוסס לבחון סלקציה חיובית ושלילית הרתי במודל עכבר ^CD4 ח.י.. בעוד סלקציה שלילית בעכברי ח.י. ^CD4 היא פיזיולוגית מאוד, שיטות אלה יכולים להיות מיושמים גם על מודלים מהונדסים TCR אחרים. אנחנו גם נציג אסטרטגיות כלליות לניתוח סלקציה חיובית ברפרטואר מתאים לכל עכברי מניפולציות גנטיות polyclonal.

Protocol

ראה איור 1 עבור מערך כולל של פרוטוקול הניסוי.

1. בתור

1. מסך מקום סטרילי פלדת רשת לצלחת 60 x 15 מ"מ פטרי. יחידה אחת נדרשה לדגימת רקמה.
2. הוסף 5 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) לכל מנה. שמור מנות על קרח.
3. להרדים עכברים עם CO _2.
4. עכבר מאובטח למשטח חיתוך, צד הגחוני פונה כלפי מעלה. עכבר תרסיס עם את....

Results

במודלים פיסיולוגיים TCR מהונדסים ועכברי WT, סלקציה חיובית מתחילה בשלב ^הבהיר DP לפני המעבר לשלב ^המשעמם עקורים לאחר מפגש אנטיגן. thymocytes ^המשעמם העקור לאחר מכן זן מסוג CD4 ⁺ שלב מעבר ^lo CD8 לפני שהפך thymocytes CD8SP (האיור 2B) CD4SP או. thymocytes SP הבוגר מאופיין בביטוי TCR גבוה ואובדן CD24 (האיור 2C). בעוד CD8 ידי CD4 פרופיל יכול לחשוף ליקויים בסלקציה חיובית, בחינת TCRβ ידי CD69 או CD5 יכול.......

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן יכול לשמש לבדיקת סלקציה חיובית ושלילית בעכברים מהונדסים TCR הלא TCR מהונדס ו. פרוטוקול זה מתאר את ההכתמה של אנטיגנים על פני שטח. לניתוח נוסף של מנגנונים מולקולריים, לעתים קרובות יש צורך לבצע צביעה תאית. אנו משתמשים BD Biosciences קיט Cytofix / Cytoperm עבור רוב החלבונים תאיים וערכת כתמי Foxp3 Biosciences BD לגורמי שעתוק. אנחנו בדרך כלל לרכוש הדגימות שלנו מייד לאחר צביעה. עם זאת, דגימות ניתן לאחסן לילה במאגר FACS עם פורמלדהיד 1% ב 4 ° C בחושך. להיות מודע לכך כמה.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
תמיסת המלח המאוזן של האנק HyClone	Thermo Scientific	SH30030.02
מסכי רשת מתכת	Cedarlane	CX-0080-E-01
צלחות פטרי (60 מ"מ x 15)	הפישר סיינטיפיק	877221
מזרקים (3 מ"ל)	BD Biosciences	309657
צינורות חרוטים (15 מ"ל)	Sarstedt	62.554.205
מיקרוסקופ	Zeiss - פרימו סטאר	415500-00XX-000
Hemocytometer	אוסרמדעי	3110
צלחת 96-היטב	Sarstedt	82.1582.001
פיפטה הרבה ערוצים	Fisherbrand	21-377-829
עוברי עגל בסרום	Paa	A15-701
נאגר מלוח פוספט	הפישר סיינטיפיק	SH3025802
יזיד הנתרן	IT ייקר הכימי ושות	V015-05
FCR מגיב חסימה			השיבוט 2.4G2
אנטי עכבר ח.י. TCR	eBioscience	* XX-9930-YY	השיבוט T3.70
CD4 נגד עכבר	eBioscience	* XX-0042-YY	שיבוט RM4-5
NTI עכבר CD8α	eBioscience	* XX-0081-YY	שיבוט 53-6.7
Anti-CD24 עכבר	eBioscience	* XX-0242-YY	שיבוט M1/69
TCRβ נגד עכבר	eBioscience	* XX-5961-YY	שיבוט H57-597
Anti-CD69 עכבר Biotinylated	eBioscience	13-0691-י.י. *	השיבוט H1.2F3
אנטי עכבר CD5 Biotinylated	eBioscience	13-0051-י.י. *	שיבוט 53-7.3
Streptavidin	eBioscience	* XX-4217-YY
cytometer זרימה	Biosciences BD - קנטו FACS	338962
FACS צינורות	BD Biosciences	352052
תוכנת ניתוח cytometry זרימה	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7 / 9
HyClone RPMI - 1640 בינוני	Thermo Scientific	SH30027.01
			* XX משתנה לפי fluorochrome וי.י. משתנים לפי גודל בקבוקון.