הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הנדסת רקמות של המעי בדגם Murine

15.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4279

⸱

1 בדצמבר 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Hospital Los Angeles, Division of Pediatric Surgery, Saban Research Institute, Keck School of Medicine of the University of Southern California

במאמר זה

סיכום

מאמר זה ולהציג את הווידאו הנלווה הפרוטוקול שלנו ליצירת רקמות מהונדסות מעי בעכבר, באמצעות גישת organoid יחידות על פיגום.

תקציר

מעי דק רקמה מהונדסת (Tesi) בהצלחה שמש כדי להציל את לואיס חולדות לאחר כריתת מעי דק מסיבית, וכתוצאה מכך חזר למשקלים לפני ניתוח תוך 40 יום. 1 בבני אדם, כריתת מעי דק מסיבית יכולה לגרום לתסמונת מעי קצרה, malabsorptive פונקציונלי המדינה שמעניקה תחלואה משמעותית, תמותה ועלויות שירותי בריאות, כולל תלות Parenteral תזונה, אי ספיקת כבד ושחמת כבד, ואת הצורך בהשתלת איברי multivisceral. 2 במאמר זה, אנו מתארים ולתעד בפרוטוקול שלנו ליצירת רקמות מהונדסות מעי במודל של עכברים עם גישה רבה תאית organoid יחידות על פיגום. יחידות Organoid הן אגרגטים תאיים הנגזרים מהמעי המכילים אלמנטים הן ריריים וmesenchymal, 3 קשר בין המשמר את הנישה של תאי גזע במעי. 4 במחקר מתמשך ובעתיד, את המעבר שלנו לטכניקההעכבר יאפשר חקירה של התהליכים המעורבים בהיווצרות Tesi על ידי ניצול הכלים המהונדסים הזמינים במין זה. 5 הזמינות של זני עכברי מדוכאי חיסון גם תאפשר לנו ליישם את הטכניקה לרקמת מעי אנושית ולייעל את היווצרות Tesi האנושי xenograft עכבר לפני המעבר שלו לבני אדם. השיטה שלנו מעסיקה (GMP) ריאגנטים וחומרים שכבר אושרו לשימוש בחולים אנושיים, ולכן מציעים יתרון משמעותי על פני גישות המסתמכות על רקמות חי decellularized ייצור נאות. המטרה הסופית של שיטה זו היא התרגום שלה לבני אדם כאסטרטגיה טיפולית רפואת רגנרטיבית לתסמונת מעי קצרה.

פרוטוקול

1. הכנת יחידות Organoid

  1. המכשירים מתאימים לנתיחת עכבר (מספריים ומלקחיים) צריכים להיות מעוקרים על ידי חיטוי.
  2. הומני להרדים את עכבר התורם על פי פרוטוקולי IACUC מקומיים. ודא כי בעל החיים מתים לפני שימשיכו.
  3. לעשות חתך קו אמצע כדי לקבל גישה לחלל הצפק. שולי עור יכולים להשתקף כנדרשים כדי לשפר את החשיפה.
  4. כסח את המעי הדק ומחלק אותו רק דיסטלי לרצועות של Treitz. הפרד את המעי הדק מלפדרו באמצעות נתיחה בוטה חדה ועדינה. זהה את צומת ileocecal ולחלק את 5 מ"מ המעי הדק הפרוקסימלי לזה.
  5. בעזרת מספריים, פתח את מעי אורכו לאורך גבול antimesenteric בצלחת פטרי עם 10 מ"ל 4 מעלות צלזיוס, מלוח "סטרילי הנקס נאגר (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X אנטיביוטיקה נגד פטריות (אנטי אנטי, Invitrogen) פתרון. נקה את הצואה מהמעי פתח עםתסיסה עדינה לאחר מכן להעביר מעי נפתח לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל עם 10 מ"ל של 4 מעלות צלזיוס, HBSS סטריליים / 1X אנטי אנטי.
  6. שטוף את המעי נפתח שלוש פעמים ב10 מ"ל של 4 מעלות צלזיוס, HBSS / 1X סטריליים אנטי אנטי במבחנה. כל שטיפה ניתן לבצע עם רעד קל של צינור המ"ל 15 למשך 30 שניות. אחרי שלחץ, רקמת המעי שוקע לתחתית של התחתית. השלך חומרים צפים, שהיא פסולת mesenchymal. הסר את פתרון הכביסה בזהירות עם pipet.
  7. ברר במעי השטוף בצלחת פטרי עם 10 מ"ל של 4 מעלות צלזיוס, HBSS סטריליים / 1X אנטי אנטי פחות מ 1 מ"מ ריבועים באמצעות מספריים. אסוף את החומר הטחון עם pipet אוטומטי ולמקם אותו לתוך מבחנה.
  8. צנטריפוגה הצינור ב 500 סל"ד לדקות 8. בטל supernatant, המכיל שומן וmesenchyme.
  9. לעכל את החומר טחון, שטוף עם 10 מ"ל של HBSS סטריליים / תוספת אנטי אנטי 1X 0.125 מ"ג / המ"ל dispase (Invitrogen) ו800 יחידות / מ 'סוג l collagenase 1 (וורטינגטון, לייקווד ניו ג'רזי). כדי להכין 40 מ"ל של תמיסת העיכול, לשקול את 5 מ"ג dispase, 142 מ"ג של collagenase, ולהוסיף עד HBSS סטריליים לנפח של 40 מ"ל. הכן את הפתרון זה עתה את כל יחידות דיור organoid זמן מוכנות, ולשמור ב 4 ° C עד מוכן לשימוש. הוסף פתרון העיכול ישירות לגלולה מצעד 1.8.
  10. דגירת מבחנה המכילה את החומר טחון, שטוף עם פתרון העיכול על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  11. תחזר את המבחנה ועוד לשבש את רקמת עיכול על ידי טחינה דקה עם pipet מ"ל 10. חזור על בין 20 ל 50 פעמים עד שמראה אחיד מתקבל.
  12. צנטריפוגה המבחנה למשך 5 דקות ב 800 סל"ד. בטל supernatant, המכיל תאים בודדים.
  13. עצור את תגובת העיכול עם 10 מ"ל של 4 מעלות צלזיוס שינוי הנשר הבינוני של סטרילי Dulbecco (DMEM, Invitrogen) בתוספת 10% בסרום, v / v חום מומת עוברי שור (HI-FBS, Invitrogen). Resuspend פלהt ולנער את הצינור.
  14. צנטריפוגה המבחנה למשך 5 דקות ב 800 סל"ד. הסר את supernatant זהירות עם pipet אוטומטי עד הטיפין האחרונות. השתמש pipet פלסטיק חד פעמי לטיפין האחרונות, כדי למנוע resuspending הגלולה.

2. טעינה של Polyglycolic חומצת הפיגום

  1. טופס, פיגומי 2-מ"מ ארוך 5-מ"מ קוטר חיצוני גליליים מחומצת polyglycolic הארוגה (עובי 2-מ"מ גיליון, 60 מ"ג צפיפות סנטימטר-3 בתפזורת; נקבוביים%> 95, סיבי קונקורדיה, RI קובנטרי) כפי שמתוארת במס. 4.
  2. לקצץ 2 מ"מ הדיסטלי של pipet microliter הפנוי 1000 קצה עם מספריים מוכנים עם אתנול 70% במים מזוקקים.
  3. הנח את הפיגום לתוך צלחת תרבות 4-כן. טען את יחידות organoid גבי הפיגום עם pipet microliter 1000, קודם ללום ואז על פני השטח החיצוניים. השתמש במלקחיים כדי להבטיח ציפוי של לומן. אל תפגעו או לפרוץ צורה הגלילית של הפולימר.

3. השתלה לעכבר מארח

  1. השתמש בעכבר המארח syngeneic באותו הרקע כתורם אם הוא זמין. אחרת, להעסיק סוכרתי nonobese immunocompromised / חמור בשילוב בעלי חי immunodeficient או NOD / SCID (ג'קסון מעבדות, סקרמנטו קליפורניה).
  2. לגרום להרדמה כללית עם isoflurane. גילוח, הכנה ולעטוף בבטנו של העכבר.
  3. לעשות חתך קו אמצע 5 מ"מ כדי לזכות בכניסה לחלל הצפק. זיהוי וכסח omentum יותר בזהירות. הנח את הפולימר הטעון על גבי omentum ולעטוף אותו ברקמות. אל תקרע omentum.
  4. אבטח את הפולימר לomentum עם תפר 5-0 monocryl. מחזיר בעדינות את omentum עם הפולימר העטוף בתנוחה אנטומית שלה.
  5. סגור את החתך בבטן בשכבות באמצעות תפרי vicryl 4-0. הפעל את סגירת השרירים ולדאוג שלא לפגוע באיברים הפנימיים בבטן מתחת לחתך. השתמש תפרים לעור.
  6. כאבים לאחר ניתוח לנהל עם 2 מ"ג / קילו ketoprofen (Ketofen, בריאות בעלי חי Fort Dodge) במים סטריליים כwheal סמוך לחתך תת עורי. בעלי חיים צריכים להיות מוערכים מדי יום ואם בעל החיים הוא מפגינים סימנים של כאב או מצוקה, מנה נוספת של ketoprofen יכולה להינתן ביום ניתוח לאחר 2. ביום שלאחר הניתוח השלישי, בעלי החיים צריכים להיות התאוששו לחלוטין ללא עדות לכאב או מצוקה. אם כאב או מצוקה ממשיך ביום ניתוח לאחר 3, זה נחשב נורמלי ויש להתייחס בהתאם לפרוטוקולי מתקן טיפול IACUC ובעלי חיים.
  7. אפשר העכבר כדי להתאושש ומעי רקמה המהונדס לגדול במשך ארבעה שבועות. תן גישה כרצונך חיה למכרסם צ'או (המעבדה דיאט 5001, מדד מנהלי רכש תזונה, סנט לואיס מיזורי) ומים עם מ"ג Septra 200 מ"ג / 5 מ"ל לכל 40 (היי טק Pharmacal, Amityville ניו יורק) בשעת 1:100 דילול.

4. קציר

  1. הומאנלי להרדימו מארח ארבעה שבועות לאחר השתלה.
  2. פתח מחדש את החתך המקורי ומשקף את עור cephalad כדי להקל על גישה לחלל הצפק.
  3. פתח את שכבת השריר ולזהות את מבנה רקמות המהונדסות כעולם של רקמה.
  4. קח את ההידבקויות למבנה מהקרביים intraabdominal באמצעות נתיחה חדה.
  5. תקן ההבניה בפורמלין לפרפין מאוחר הרכבה, או להשתמש ברקמה הטריה למבחנים ביוכימיים כגון PCR בזמן אמת או בידוד חלבון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מציג סכמה כללית לפרוטוקול המתועד כאן. התוצאה הסופית של פרוטוקול זה היא מבנה כדורי של גלובוס או מעי עכברי רקמות מהונדס עם לומן, ריריות, submucosa, ומקיף 2A muscularis. איור מראה גלובוס אופייני בהשוואה לפיגום פולימרים. 2B איור התחלה מציגה אותו המבנה bivalved חריפות לחשוף לומה. איור 3 מדגים קטע מוכתם eosin hematoxylin / פרפין רכוב צולב של מבנה מוצלח אופייני לאחר 4 שבועות של דגירה. במס. 4, שהיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מציגים פרוטוקול לייצור רקמת מעי מהונדס בעכבר באמצעות organoid גישת יחידות על פיגום. השלבים הקריטיים ביותר הם אלה של הכנת יחידות organoid. יש להקפיד לנקות כראוי ומכאני לעבד את הרקמה, אבל טיפול שווה יש להקפיד שלא לoverdigest או overtriturate יחידות organoid לאחר העיכול מתבצע (שלב 1.11). אם זה נעשה, יחידות organoid יכולות להיות מופחתות לתאים בודדים, אשר יכולה להיות שאבדו בsupernatant של 1.12 צעד, ולא סביר שישרוד כדי לייצר רקמת מעי מהונדס, כנישת תאי גזע מעיים לא יישמר בזה מקרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

טרייסי ג Grikscheit, אריק ר Barthel, ופרדריק ג'סאלה נתמכת על ידי המכון בקליפורניה הרגנרציה רפואה (CIRM), מספרי המענק RN2-00946-1 (TCG) וTG2-01168 (ארב, מדרשה). אליסון ל שפר הוא חברה של אוניברסיטת מנתחי Ethicon חוקר. Yashuhiro Torashima ממומן על ידי המלגה של בית החולים לילדים בלוס אנג'לס סבן מכון מחקר פיתוח הקריירה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות (אופציונלי)
HBSS Gibco 114170-112
אנטיביוטיקת Antimycotic 100X Invitrogen 15240-062
Dispase Gibco 17105-041
סוג collagenase 1 וורטינגטון LS004194
גלוקוז גבוהה DMEM 1X Gibco 11995-065
FBS המומת חום Invitrogen 16140-071
Biofelt 100% PGA קונקורדיה רפואית FELT01-1005 להכנת פולימר כמו במס.4
חומצת פולי-L-לקטית Durect B6002-1 להכנת פולימר כמו במס. 4
סוג אני קולגן, זנב חולדה סיגמה אולדריץ C3867-1VL להכנת פולימר כמו במס. 4
Ketoprofen 100 מ"ג / מ"ל לבריאות בעלי חי דודג' פורט 71-KETOI-100-50
LabDiet 5001 המכרסם צ'או LabDiet 5001
Septra 200/40 מ"ג מ"ג לכל 5 מ"ל, USP היי טק Pharmacal 50383-824-16
, USP isoflurane תרופות פניקס 57319-507-06

מקורות

  1. Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).
  2. Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).
  3. Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures. J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).
  4. Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse. Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).
  5. Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation. J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).
  6. Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection. Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).
  7. Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease. J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).
  8. Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).
  9. Shew, S. B. Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus. Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).
  10. Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).
  11. Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia. Surgery. , 121-239 (1997).
  12. Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome. J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).
  13. Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care. Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).
  14. Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. Intestinal and multivisceral transplantation in children. Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).
  15. Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. Current status of intestinal transplantation in children. J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מעי בהנדסת רקמותיחידות אורגנואידיםגישת פיגוםמודל עכבררקמת מעיפיגום פולימריעטיפת אומנטוםאנליזה היסטולוגיתבדיקות מולקולריותמאחס עם מערכת חיסונית מודכאת
הנדסת רקמות של המעי בדגם Murine
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.