העיצוב, הייצור וההרכבה של ממונע microdrive קל במיוחד הוא תאר. המכשיר מספק פתרון חסכוני וקל לשימוש, עבור הקלטות כרוניות של יחידות בודדות בחיות מתנהגות קטנות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תכנון והרכבה של Microdrive קל במיוחד ממונע להקלטות עצביות כרוניות בבעלי חיים קטנים
במאמר זה
סיכום
תקציר
היכולת כרונית להקליט מאוכלוסיות של נוירונים בחיות באופן חופשי מתנהגות הוכיחה כלי רבת ערך עבור לנתח את הפונקציה של מעגלים עצביים העומדים בבסיס מגוון רחב של התנהגויות טבעיות, כולל 1 ניווט, קבלת החלטות 2,3, והדור של רצפים מוטוריים מורכבים 4 , 5,6. התקדמות בעיבוד הדיוק אפשרה לייצור של מכשירים קלי משקל מתאימים להקלטות כרוניות בבעלי חיים קטנים, כגון עכברים וציפוריים שיר. היכולת להתאים את המיקום האלקטרודה עם מנועים קטנים הנשלטים מרחוק הגדילה עוד יותר את תשואת ההקלטה בהקשרים התנהגותיים שונים על ידי צמצום טיפול בעלי חיים. 6,7
כאן אנו מתארים פרוטוקול לבנות microdrive ממונע קל במיוחד עבור הקלטות כרוניות ארוכות טווח בבעלי חיים קטנים. העיצוב שלנו התפתח מגרסה 7 שפורסם קודם לכן, והותאם לקלויות שימוש והעלות effectiveness להיות מעשי יותר ונגיש למגוון רחב של חוקרים. עיצוב 8,9,10,11 זה מוכח מאפשר למיצוב בסדר, מרחוק של אלקטרודות על פני טווח של ~ 5 מ"מ ושוקל פחות מ 750 מ"ג כאשר הורכב במלואו. אנו מציגים את הפרוטוקול המלא ל איך לבנות ולהרכיב כוננים אלה, כוללים שרטוטי 3D CAD לכל רכיבי Microdrive המותאמים אישית.
פרוטוקול
1. סקירה כללית של רכיבים
- Microdrive שלם מורכב מכמה מרכיבים עיקריים (איור 1): מארז המשמש כמבנה לנסיעה, מנוע עם פיר פלט דק הליכים, הליכים שמעבורת נושאה את האלקטרודות ומספקת נקודת חיבור חשמל, ו Omnetics מחבר (או שווה ערך).
- המארז, מעבורת אלקטרודה, וצינורות הסעות אלקטרודה הם רכיבים מותאמים אישית שעוצבו תוך 3D CAD תוכנה (SolidWorks), ומכונה על ידי מכונאי דיוק מקומי. כל המרכיבים האחרים זמינים מסחרי.
- שלדה והסעה במכונה מpolyetherimide הקל (PEI), ואילו את צינורות ההסעות אלקטרודה נחתכים לגודל עם מחרטה מצינורות נירוסטת מזרק (0.0293 "OD x 0.00975" מזהה). למרות שניתן לחתוך רכיבים אלה מחומרים אחרים, מצאתי שPEI והנירוסטה יש את האיזון הנכון של machinability, כוח וw8 לבקשה שלנו.
- כדי להרכיב את הכונן, בקר מנוע, מסוגל ספינינג DC-מתח הנמוך מנוע הצעד, נדרש. אנו מעסיקים פתרון מותאם אישית המבוסס על מנוע IC נהג השלושה שלבים (פאולהבר BLD05002 הזמין מהיצרן) בשילוב עם הטיימר IC המספק timestep הקלט. מגוון רחב של פתרוני ה-off-מדף זמין גם (למשל פאולהבר MCBL05002 או סאטר מכשירי MP-285).
2. הכנה והרכבת מארז כונן
- עם חותכים אלכסוניים דקים, חתוך את פיני המגע בתחתית Omnetics (או שווה ערך) המחבר - 1.5 מ"מ לשורה האחורית, 1 מ"מ לשורה הראשונה (איור 2 א). כדי לשפר את עוצמת הקשר בין אפוקסי מארז הכונן והמחבר, השתמש באזמל כדי לחספס את המשטחים האחוריים של שני הרכיבים.
- באמצעות אזמל, לחתוך 4 קטעים ארוכים 15 מ"מ של צינורות polyimide (0.0113 "מזהה x 0.0133" OD) לשימוש כחוט ג.א.אידו. זהירות להבטיח את המארז בסגן קטן עם החלל הפתוח למטה (התרשים 2B). להשתמש בדבק cyanoacrylate לצרף את צינורות polyimide למארז. הם צריכים להניח בגובה פני השלדה האחורית ויהיו מקבילים בכיוון זה לזה כפי שמוצג באיור 2 ב.
- ברגע יבש, חתוך את polyimide צינורות לכ 6 מ"מ באורך ולהסיר את החלקים פסולת. הצינורות שנותרו צריכים להיות כ 3 מ"מ מהקצה התחתון של המארז.
- כדי להבטיח אישור מתאים להזדווגות עם headstage או כבלים, המחבר צריך להיות מותקן כמה מילימטרים מעל polyimide צינורות ולהיות מקבילים עם משטח המארז (איור 2 ב '). השתמש אפוקסי (Torr חותם) לבנות הדום קטן למחבר, הנח אותו על ראש עם השורה הקצרה של פינים עליונים, ולהוסיף עוד אפוקסי סביב המחבר. לא להמשיך עד אפוקסי רפא לגמרי.
- הסר את המארז מהסגן, להעביר ללנענע שמאפשר חיבור לבקר המנוע (כלומר, במקרה שלנו, זה פשוט לנענע מוט נוקשה עם Omnetics הזדווגות המחבר מודבק לצד אחד) ולהתמצא עם המשטח הקדמי של הכונן פונה כלפי מעלה. להנחות את חוטי המנוע דרך החור במארז והחלק את המנוע לחריץ בבסיס. המנוע וגל ההינע צריך להיות מקבילים למארז ויתאימו snuggly נגד תחתון והצד.
- אפוקסי המנוע לשלדה, נזהר שלא להכשיל גם את גל ההינע או החלל שבו תותקן האלקטרודות (ראה מיקום Torr חותם באיור 4). אפשר לרפא אפוקסי.
- סובב את המארז כך שהמחבר הוא נגיש. כדי לתמוך את חוטי מנוע ולמנוע שבירה בשוגג, להוסיף טיפה קטנה של אפוקסי מהיר סט את החוטים שבו הם עולים מהשלדה. Trim, רצועה, ולהלחים את החוטים לקשרים המתאימים במחבר (איור 2 א). בדוק את המנועלהבטיח סיבוב פיר חלק בשני הכיוונים.
3. עצרת הסעות אלקטרודה
- כדי לצמצם את הסיכון לחפצי תנועה מושרה בהקלטות, זה הכרחי כי מעבורת אלקטרודה להתאים מלבב במארז. בדוק את ההתאמה של המעבורת ידי להשחיל אותו על ציר המנוע ומפעיל אותו למעלה ולמטה לכל האורך של הפיר במהירות נמוכה. היזהר שלא לתקוע את המעבורת בנסיעה ובכך מניע מעל מנוע קל מאוד באופן קבוע לפגוע gearhead הפלסטיק בשלב זה. אם בעבר ציר מנוע מסתובב מפסיק להסתובב, gearhead עלול להינזק.
- אם ההסעות אינן פועלות בצורה חלקה במורד הפיר, לבדוק את משטחי שלדה ובורג הכונן לפסולת. הסר עם מלקחיים עדינים או באוויר דחוס, מעייל השחלה קצת שמן מינרלי אור ובדוק שוב את כושר המעבורת.
- אם המעבורת היא הדוקה מדי, להשתמש במלקחיים ואבן משחזת גרגרים עדינה להסרת חומר שיבוש הלוך ושובמ 'בצד של המעבורת. תשמרו על עצמך כדי להסיר את החומר באופן שווה.
- אם המעבורת היא רפויה מדי כך שהוא נוטה ומפטפטת במהלך נסיעה, להדביק פיסה קטנה של סרט שקיפות למעבורת כדי למלא את הפער בינו לבין משטח המארז.
- ברגע שהמעבורת כבר להתאים כראוי, הסר את ההסעות מהפיר ולחץ על אחד מצינורות נירוסטת הסעות לכל אחד מארבעת החורים הגדולים במעבורת. כל אחת צריך להיות מרוכז במעבורת עם הקצוות של כל הארבעה סומק הצינורות (איור 3). לאבטח אותם עם טיפה קטנה של דבק cyanoacrylate מוחלת על הבסיס של הצינור. להיות זהיר מאוד שלא לאפשר לדבק לעלות על קצות המעבורת או לחצוצרות.
- השחל את מעבורת האלקטרודה השלימה בחזרה על גל ההינע ולהביא אותו כל הדרך למטה עד לבסיס של השחלה.
4. Tube מדריך והתקנת אלקטרודה
- חותכים ארבעה 25 קטעים ארוכים של מ"מ polyimide טוביןגרם (0.0045 "מזהה x 0.006" OD) לשימוש כמדריכי אלקטרודות. בנוסף, חתוך ארבע אלקטרודות לסעיפי 40 מ"מ לשימוש כאלקטרודות דמה שמחזיקים את צינורות המדריך בעמדה במהלך עצרת. (שים לב שאלקטרודות דמה אלו הן להרכבה בלבד ולא ישמשו להקלטה, כך שאתה יכול לעשות השימוש חוזר באותם אלה עבור כל הרכבה.) הסט כל מקטע של צינור אל על לאלקטרודה כזה שמרחיבה את האלקטרודה ~ 10 מ"מ מעבר דמה קצה הצינורית.
- לארגן כל אחד מpolyimide צינורות בשלדה כפי שמוצג באיור 4 א. זה יגרום לקצוות של מדריכי אלקטרודה, שטוף עם זה ומיושר לבסיס של ציר המנוע, הושט לעבר הרכבת לאלקטרודה וההפך מסתיים מתכנס בתחתית הכונן. לערבב כמות קטנה של קוויק-יצוק ולהחיל כ 2 מ"מ מתחת לקצה העליון של מדריכי אלקטרודות. לאפשר לו להתייבש.
- הסר את האלקטרודות הדמה ולמקם מחדש את הקצוות החופשיים של האלקטרודה מנחה כגוןשהם יוצרים חבילה הדוקה בחלק התחתון של הכונן. זה עשוי להיות מועיל להשתמש בחוט דק כדי להחזיק אותם במקום זמני (איור 4 ב). תקן את המיקום החדש עם יותר Kwik-יצוק. לאפשר לו להתייבש.
- עם אזמל חד, חתוך את צינורות מדריך אלקטרודה שבו הם מרחיבים מעבר לתחתית microdrive. כאשר מושתלים, צינורות אלה ידריכו את האלקטרודות מהחלק התחתון של הכונן (מונח על הגולגולת) על פני השטח של המוח. לפיכך, באורך שצריכים להיות trimmed הצינורות תלויים באנטומיה של אתר ההשתלה (איור 5). לציפור שיר, זה עומד על כ 1.5 מ"מ.
- כדי להתחבר האלקטרודה למחבר, לחתוך עוד סעיף 30 מ"מ של חוט פלטינה מבודדת (0.003 "קוטר.) ולהפשיט 1 מ"מ של בידוד מקצה אחד. לרתך אותו לאחד מאות הסיכות במחבר. כופף את החוט מתחת המחבר ולדחוף אותו דרך אחד צינורות מדריך התיל. משוך את החוט להקניט ולעטוף איתו את החריץ במדריך לאהוא החלק עליון של המארז.
- עם מספריים או מספרי תיל דקים, לחתוך לאלקטרודה ~ 25 מ"מ באורך. תשמרו על עצמך לעשות את זה מבלי לכופף את האלקטרודה או פגיעה בקצה, אם אחד להתרחש, האלקטרודה לא ניתן להשתמש. עם מעבורת האלקטרודה כעת בחלק העליון של הפיר, הכנס אלקטרודה לתוך צינור polyimide ולמשוך אותו דרך צינור הנירוסטה במעבורת. מקם אותו כך שהקצה של האלקטרודה הוא מיושר עם הקצה התחתון של צינור polyimide. חתוך מ"מ אלקטרודה 1 לעיל צינור המעבורת.
- עם סט נאה של מלקחיים, להפשיט את הבידוד מעל 2 המ"מ האחרון של האלקטרודה ו2 המ"מ האחרון של חוט הפלטינה. שנה את המיקום האלקטרודה בצינור המעבורת, הכנס את חוט הפלטינה לתוך הצינור, ולהצמיד את שתיים יחד על ידי זזת קטע קצר 1 מ"מ של חוט טונגסטן (0.008 "קוטר) לתוך הצינור. זה צריך להיות צפוף שיספק הוא מכאני וחשמלי חיבור בין האלקטרודה והחוטים (איור3).
- הפעל את המעבורת מעלה ומטה לאורכו של ציר ההנעה כדי להבטיח המשך תנועה.
- חזור על 4.5-4.8 עד שכל האלקטרודות הותקנו.
- חותך ארוך סעיף 30 מ"מ של חוט כסף (0.005 "קוטר) לשימוש כחוט קרקע. רצועה 1 מ"מ של בידוד מקצה אחד והלחמה לפיני הקרקע.
5. הרכבה סופית והכנה טרום השרשה
- כדי להקטין את החיכוך של אלקטרודות נגד צינורות המדריך, למלא את צינורות מדריך עם שמן מינרלי אור. פעולת נימים מספיקה כדי למלא את הצינורות מטיפת שמן הממוקם בקצה אחד.
- כדי ליצור כיסוי מגן לרכב ואלקטרודות, לקצץ 12 מ"מ x 25 מ"מ המלבן של שקיפות ולקפל אותו לצורת U רחב. השתמש cyanoacrylate לדבק לכיסוי המשטחים החיצוניים של המארז (איור 6). לחתוך 15 מ"מ מלבן x 6 מ"מ של שקיפות ולהשתמש cyanoacrylate להדביק אותו סביב המחבר. כדי למנוע interference עם המחבר, שהקצה הארוך של השקיפות צריך להיות מיושר לקצה העליון של המחבר.
- לפני ההשתלה, לעקר את האלקטרודות וצינורות על ידי הורדת מדריך האלקטרודות המורחבת לפתרון 10:01 DI מי אקונומיקה למשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף ביסודיות עם מים סטריליים.
- לנענע דומה לזה המשמש בשלב 2.5 ניתן להשתמש כדי להחזיק microdrive במניפולטור stereotaxic במהלך השתלה.
6. נציג תוצאות
פרוטוקול זה דורש כ 5 שעות של ידות בזמן הרכבה עם 6-8 שעות נוספות וביניהם לאפוקסי והדבק להתייבש. עם זאת, ברגע שmicrodrive כבר התאסף בפעם הראשונה, זה יכול להיות מוכן לשימוש חוזר (כלומר, את האלקטרודות, צינורות מדריך אלקטרודה, וחוטי אלקטרודה ניתנים להחלפה) בפחות מ 2 שעות. האיכות והאופי של ההקלטות שהושגו על ידי ביצוע פרוטוקול זה תהיינה, כמובן, להיות בחלק תלוימטרת הקלטה, הבחירה של אלקטרודות, וכל עיבוד מבוצע בheadstage או במעלה הזרם של microdrive. מלבד זאת, ניתן להשיג הקלטות יציבות מחיה מתנהגת על טווח זמן של יותר מעשרה שבועות. דוגמאות להקלטות יחידה אחת מהגרעין החזק של archistriatum (ע"ר) בציפור שיר מתנהג מוצגות באיור 7 א; פעילות רבה יחידה מאותו האזור מוצגת באיור 7 ב.
איור 1. מודל 3D של התאסף הממונע microdrive. Microdrive מורכב ממספר מרכיבים עיקריים: (א) מרכב, (ii) עם מנוע פיר פלט הליכים, (iii) מעבורת אלקטרודה, (iv) צינורות הסעות, אלקטרודות (v), (vi) צינורות מדריך אלקטרודה, ו( ז ) מחבר.
איור 2.) מודל ותרשים חיבור למחבר. חוטים המנועיים ב, אני, אני. חוטים אלקטרודה: ג, ד, ה, ו. חוט קרקע: יא. כל הסיכות זמינות למכשור עזר אחרות. B) תמונה של המחבר מחוברת למארז עם Torr החותם אפוקסי. שים לב לתנוחה של שניהם ומחבר את צינורות מדריך התיל הבסיסיים. דבק cyanoacrylate מחזיק את צינורות המדריך במתייבש עמדה ברורה, ולכן, לא ניתן לראות בתמונה.
איור 3. הרכבת מעבורת אלקטרודה.
איור 4.) צינורות מדריך אלקטרודה הממוקמים במארז לפני החלת Kwik-יצוק. B) כדי להבטיח שאת האלקטרודות לצאת מתחתית הכונן במקביל, מביא קצה התחתון של צינורות המדריך לחבילה הדוקה לפני הוספת הטיפה האחרונה של קוויק-יצוק.
> 
איור 5. הסכום שאת צינורות המדריך אלקטרודה להרחיב מעבר התחתון של הכונן שצוין על ידי את האנטומיה של אתר ההשתלה. הדיאגרמה ממחישה את הממדים שרלוונטיים לקביעת האורך של הצינורות המובילים. להשתלה בציפור השיר, 1.5 מ"מ הוא מספיק.
איור 6. Microdrive הממונע סיים עם מגן מכסה מצורף.
איור 7. הקלטות נציג מהגרעין החזק של archistriatum (ע"ר) במתנהג הזברה פנקה. א) פעילות ביחידה אחת נרשמה עם 10MΩ אלקטרודות הפלטינה אירידיום. למעלה: ההקלטה למשל עשתה שבוע לאחר השתלה. תחתון: הקלטת דוגמה מאותה האלקטרודהכאמור, תשעה שבועות מאוחר יותר. ב) פעילות Multi-היחידה הקליטה עם אלקטרודות פלטינת 1MΩ. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
קבצים נוספים: שלדה, הסעות, וצינורות אלקטרודה נועדו עם תוכנות CAD SolidWorks 2010. חלק קבצים אלה מסופקים בשני קניינים (*. sldprt) והניטראלי ספק (*. IGES) התבניות וdimensioned שרטוטי ייצור מסופקים בפורמט PDF.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המובא כאן יביא מכשיר מסוגל הקלטות באיכות גבוהה עם ממצאי תנועה מינימאליים רק אם טיפול הולם היא נלקחה עם הבנייה. אם חשיבות קריטית ההתקף של המעבורת במארז: הדוקה מדי ואת הסיכון לעומס המנוע הוא גבוה; רופף מדי והסיכון לחפץ תנועה משמעותי הוא גבוהה. כושר אידיאלי יאפשר הסעה לנסוע לכל האורך של ציר ההברגה בלי לצאת הטיה של עמדה או פטפוטים.
הבחירה של אלקטרודות הקלטה היא דומה חשובה; הבחירה של חומר, עכבה, בידוד, ופרופ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי אסתר ויוסף Klingenstein הקרן, קרן מק 'נייט הקרן, וNINDS 1R01NS066408-01A1.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם פריט חברה מספר קטלוג תגובות | |||
| שלדה | מותאם אישית | גזור מPEI | |
| הסעות אלקטרודה | מותאם אישית | גזור מPEI | |
| צינורות תחבורה | מותאם אישית | גזור מנירוסטה | |
| מחבר | Omnetics | A7886-001 | Mates לA7877-001 |
| המוטור w / gearhead | פאולהבר | 0206--001-B-021-47: 1 | |
| מדריך Wire | חלקים קטנים, Inc | SWPT-0113-12 | |
| מדריך לאלקטרודה | חלקים קטנים, Inc | SWPT-0045-12 | |
| 10MΩ Pt-IR | Microprobes, Inc | PI2PT310.0H3 | |
| חוט פלטינה | AM מערכות | 772000 | לחוטים אלקטרודה |
| חוטי כסף | AM מערכות | 786000 | לחוט קרקע |
| תיל טונגסטן | AM מערכות | 797000 | לפינים אלקטרודה |
| שקיפות | 3M | AF4300 | |
| Torr חותם | ריאן | 9530001 | |
| Kwik-יצוק | WPI | KWIK-CAST | |
| Cyanoacrylate | Krazy דבק | KG517 | |
| אפוקסי Fast-Set | הארדמן | 04001 | |
| שמן מינרלי אור | סיגמא | M5310 | |
| כלור אקונומיקה | |||
| חותכים אלכסוניים | |||
| אזמל להב | |||
| מלקחיים | |||
| כונן לנענע | מותאם אישית | אפוקסי מחבר ההזדווגות למזרק או מקל | |
| סגן קטן |
מקורות
- O'Keefe, J., Dostrovsky, J. The hippocampus as a spatial map. Brain Research. 34, 171-175 (1971).
- Pennartz, C. M., Berke, J. D., Graybiel, A. M., Ito, R., Lansink, C. S., van der Meer, M., Redish, A. D., Smith, K. S., Voorn, P. Corticostriatal Interactions during Learning, Memory Processing, and Decision. 29, 12831-12838 (2009).
- Kepecs, A., Uchida, N., Zariwala, H., Mainen, Z. F. Neural correlates, computation, and behavioural impact of decision confidence. Nature. 455, 227-2231 (2008).
- Hahnloser, R. H. R., Kozhevnikov, A. A., Fee, M. S. An ultra-sparse code underlies the generation of neural sequences in a songbird. Nature. 419, 65-70 (2002).
- Leonardo, A., Fee, M. S. Ensemble Coding of Vocal Control in Birdsong. J. Neurosci. 25 (3), 652-661 (2005).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Fee, M. S., Leonardo, A. Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals. J. Neurosci. Methods. 112, 83-94 (2001).
- Ölveczky, B. P., Otchy, T. M., Goldberg, J. H., Aronov, D., Fee, M. S. Changes in the neural control of a complex motor sequence during learning. J. Neurophys. 106, 386-397 (2011).
- Otchy, T. M., Ölveczky, B. P. Effects of Sensory Experience on the Development and Maintenance of a Motor Program Underlying a Complex Motor Sequence. Soc. for Neurosci. Abstr. , (2011).
- Goldberg, J. H., Adler, A., Bergman, H., Fee, M. S. Singing-related neural activity distinguishes two putative pallidal cell types in the songbird basal ganglia: comparison to the primate internal and external pallidal segments. J. Neurosci. 30 (20), 7088-7098 (2010).
- Goldberg, J. H., Fee, M. S. Singing-related neural activity distinguishes four classes of putative striatal neurons in the songbird basal ganglia. J. Neurophys. 103 (4), 2002-2014 (2010).
- Venkatachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. Miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted microwire implantation for chronic recording from neocortex. J. Neurosci. Methods. 90, 37-46 (1999).
- Shirvalkar, P. R., Shapiro, M. L. Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze. J. Vis. Exp. (44), e2155(2010).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
