<em&gt; במבחנה</em&gt; הכנה להפקה והקלטה של ​​תוכניות רכב האכלה עם תנועות פיסיולוגיות<em&gt; Aplysia californica</em

סיכום

אנו מתארים טכניקת extracellularly להקליט ולעורר מעצבים, שרירים, ונוירונים בודדים מזוהים במבחנה בזמן לעורר והתבוננות סוגים שונים של התנהגויות האכלה במנגנון ההזנה של Aplysia.

תקציר

Multifunctionality, היכולת של מבנה היקפי אחד ליצירת התנהגויות מרובות, ברורות ^1, מאפשר לבעלי חיים במהירות להתאים את התנהגותם לשינוי הסביבה. הרכיכה הימית Aplysia californica מספק מערכת צייתנית לחקר multifunctionality. במהלך האכלה, Aplysia מייצר סוגים שונים של כמה התנהגויות באמצעות אותו מנגנון ההאכלה, מסת buccal. הגרעינים ששולטות התנהגויות אלו מכילים מספר גדולים, נוירונים שזוהו שיהיו נגישים למחקר אלקטרו. הפעילות של נוירונים אלה שתוארה בתוכניות מוטוריות שניתן לחלק לשני סוגים, תוכניות ingestive וegestive, בהתבסס על העיתוי של פעילות עצבית שסוגר יחסי גספר מזון לפעילות העצבית שמתמשך וחזר בו או גספר ^2. עם זאת, בגרעינים מבודדים, את תנועות השרירים כי תפקנה התנהגויות אלו נעדרות, מה שהופכים אותוקשה יותר להיות בטוח אם את התוכניות המוטוריות נצפו הן הקורלציה של התנהגויות אמיתיות. בהקלטות vivo, עצבים ושרירים הושגו מקביל להאכלת תוכניות ^2,3,4, אבל זה מאוד קשה ישירות להקליט מנוירונים בודדים ^5. בנוסף, in vivo, תוכניות ingestive ניתן חולקו לעקיצות ^ו1,2 סנוניות, הבחנה שהיא קשה לעשות בעבר תאר ביותר בהכנות מבחנה.

ההכנה ההמונית buccal המושעה (איור 1) מגשרת על הפער בין גרעינים מבודדים וחיות שלמות. בהכנה זו, התנהגויות ingestive - כולל הוא נושך ובליעה - והתנהגויות egestive (דחייה) יכולים להיות שהושרו, באותו הזמן, כפי שניתן נרשמו נוירונים בודדים ומהמגורה באמצעות אלקטרודות תאיות ^6. תנועות ההאכלה קשורים בהתנהגויות שונות אלה יכולים להיות recorטוליפ, לכימות, וקשור ישירות לתוכניות המוטוריות. את התוכניות המוטוריות בהכנת מסת buccal המושעה להיראות יותר דומה לאלו שנצפו בחי מאשר הם תוכניות מוטוריות שהושרו בגרעינים מבודדים. לפיכך, התוכניות המוטוריות בהכנה זו יכולות להיות קשורה באופן ישיר יותר להתנהגות בvivo; באותו הזמן, נוירונים בודדים הם נגישים יותר להקלטה וגירוי מאשר בבעלי חיים שלמים. בנוסף, כשלב ביניים בין גרעינים מבודדים וחיות שלמות, ממצאים ממסת buccal המושעה יכול לסייע בפרשנות של נתונים המתקבלים בהגדרות מופחתות גם יותר ושלמות יותר. ההכנה ההמונית buccal המושעה היא כלי שימושי לאפיון הבקרה העצבית של multifunctionality בAplysia.

פרוטוקול

1. הכנה של פתרונות

1. כדי להכין תמיסת מגנזיום כלוריד שהוא איזוטוני למי הים שבם מחזיקים בעלי החיים (~ 1000 millosmolar), לסמן את כד גדול ברמת עוצמת הקול הרצוי. ממלא את הכד במים מזוקקים לכ 80% מרמה זו, ולשקול את הכמות המתאימה של hexahydrate מגנזיום כלוריד כדי ליצור פתרון 333 מ"מ בנפח הסופי. הוסף מגנזיום כלוריד לקנקן, לסגור את המכסה ולנער במרץ עד מגנזיום כלוריד מומס באופן מלא, ולאחר מכן להוסיף מים מזוקקים עד הנפח הסופי הוא הגיע.
2. כדי להכין תמיסת מלח Aplysia, שוב לסמן כד גדול ברמה של הנפח הרצוי, ולמלא במים מזוקקים לכ 80% מרמה זו. הנח את הקנקן על צלחת ומערבבים, להציב שורה ומערבבים בקנקן, ולהפוך על הצלחת והמערבבים.
3. אחד אחד, לשקול החוצה ולהוסיף לקנקן את הכמויות המתאימות של החומרים הבאים כדי ליצור קון אלהcentrations בנפח הסופי: 460 מ"מ כלוריד הנתרן, אשלגן כלורי 10 מ"מימ, hexahydrate מגנזיום כלוריד mM 22, heptahydrate מגנזיום סולפט mM 33, dihydrate סידן כלוריד 10 מ"מימ, גלוקוז 10 מ"מימ, 10 מ"מ. מגבים
4. ברגע המומסים מתמוססים לגמרי, השתמש במד למדידת רמת חומציות-pH של התמיסה. לאט להוסיף הידרוקסיד 1 ז נתרן כדי להעלות את החומציות לערך סופי של 7.5. אם אתה מוסיף נתרן הידרוקסידי יותר מדי בטעות, ניתן להוסיף חומצה הידרוכלורית ז 1 להורדת החומציות.
5. הוסף מים מזוקקים עד הנפח הסופי הוא הגיע.
6. כדי להאט את התפתחות חיידקים, פתרוני חנות במקרר עד לצורך ניסוי. שימו לב שהטמפרטורה יכולה להשפיע על תוכניות מוטוריות Aplysia. אנחנו לא לפקח בקפידה טמפרטורה, אך לאחר השלמת ההתקנה, הכנות הן בדרך כלל טמפרטורת חדר סמוכה.

2. הכנת תבשיל הקלטה

1. במהלך הניסוי, מסת buccal תושעה בפתרון בסיבוב 100 מ"מ (קוטר) x 50 מ"מ (גובה) כלי פיירקס. מנה זו צריכה להיות חדר קדמי למסת buccal, אמצע משטח צר, גבוה שבו גרעיני הלחי מוצמדים Sylgard, ותא נפרד, מוגבה לאחור בי גנגליון המוח מבודד. חריץ בSylgard צריך לחבר את פלטפורמת גרעיני buccal לתא גנגליון המוחין. ראה איור 1, המתייחס לממדים המרכזיים שצוינו בעת בניית המנה.
2. כדי ליצור את המאכל הזה, יתחיל בסיבוב מנה 100 x 50 מ"מ פיירקס. הכן Sylgard ביצוע ההוראות שסופקו עם המוצר. בניית המנה תדרוש כמה שופכת של Sylgard, בין שSylgard יש לאפשר להגדרה.
3. המזיגה הראשונה היא ליצור רמה הגבוהה ביותר של Sylgard בצלחת, בקיר שבין תאי buccal והמוחין (ראה איור 1). לחסום את חלק זה של המנה מהמקטעים האחרים. פלסטלינה יכולה לשמש לבנייהקירות לחסימת חלקים. לקיר שטוח, חתיכת הקרטון יכול לשמש, עם גיבוי פלסטלינה. לקיר מעוגל (שמקטין את הגודל של התא המכיל את מרכז העצבים במוח), השתמש בפלסטלינה בלבד כבסיס לקיר. מעייל כל הקירות בניילון נצמד שבו הם יתקשרו Sylgard להסרה בקלות.
4. ברגע שהמקום לקיר שבין תאי buccal והמוחיים כבר נחסם כמתואר ב2.3, הבטחת חותמות הדוקות בקצוות כדי למזער את הדליפה, לשפוך Sylgard לתוך החלל הזה כמעט עד לקצה העליון של המנה. בואו סט Sylgard בן לילה, ולוודא כי הוא מוגדר באופן מלא לפני שימשיך. מניח את הצלחת במקום חם שיכול להביא את ההגדרה מהירה יותר.
5. בשלב בא, פלטפורמת גרעיני buccal ותא גנגליון מוח צריכה להיות שפך (שוב, ראה איור 1, המציג את מיקומי הגרעינים אלה בצלחת הושלמה). הסר את קירות חסימה הקודמים, וליצור קיר חדש דיעמדה 0.5 סנטימטרים מקיר Sylgard השטוח של החלק האמצעי כדי לחסום את פלטפורמת גרעיני buccal. אין חומות הן הכרחיות כדי ליצור את החדר האחורי שיחזיק את מרכז העצבים במוח. יוצק Sylgard בשני החלקים עד לגובה של כ 3 מ"מ מתחת לרמה העליונה. תא המוח צריך להיות רק מעט נמוך יותר מאשר פלטפורמת גרעיני buccal. שוב, בואו Sylgard להגדיר בן לילה.
6. לבסוף, יוצק את החדר הקדמי (כלומר, החדר שבו יושעה המוני buccal). אין חומות הן הכרחיות. יוצק לגובה המתאים כמפורט באיור 1.
7. השלב האחרון הוא סימן חריץ חיבור פלטפורמת הגרעינים buccal והתא במוח. עומק החריץ צריך להיות זהה לרמה של פלטפורמת גרעיני buccal. להב סכין מנתחים יכול לשמש כדי לחתוך את החריץ. איור 1 מדגים את הצלחת הושלמה.

3. הכנת האלקטרודה

1. משוך דואר תאיlectrodes מזכוכית נימים חד קנים באמצעות Flaming-בראון micropipette חולץ. קטרים ​​הפנימיים של אלקטרודות צריכים להיות בערך 40 מיקרומטר והתנגדויותיהם צריכות להיות כ -0.1 MΩ. עם נימת FT345B בחולץ, חולץ הגדרות התכנית הטיפוסית שלנו הן חום 480, משוך 50, 13 Vel, ושעה 20, אך שימו לב שההגדרות תהיינה שונות לחוטים שונים. תכנית זו יוצרת את האלקטרודות במשיכה אחת עם שום שלב אש ליטוש. לפני תחילת ניסוי, מילוי האלקטרודות התאית עם Aplysia מלוח.
2. צור אלקטרודות וו לעצבים ושרירי הקלטת ² בעקבות פרוטוקול דומה לזה שתואר על ידי Cullins וChiel ^4, פרט לכך שאלקטרודות בודדות לא צריכות להיות כרוכות זה בזה. את הצעדים ליצירת אלקטרודות אלה פעלו ב3.3-3.13.
3. לחתוך חתיכת חוט מצופה אמייל, קוטר 0.001 אינץ' נירוסטה באורך של כ 60 סנטימטרים. צרף כדור הפלסטלינהלכל קצה של החוט, להחזיק את החוט באוויר בנקודת האמצע שלה, ולסובב את שני כדורים של חימר חבוק לעטוף את החוטים זה סביב זה (זה מפחית ארעי capacitative).
4. החזק את שני קצותיו של הכבל יחד על ידי הצטרפות שני הכדורים של חימר לכדור אחד, וקלטת הקצה השני של החוט להשעות את החוט.
5. מעייל כל אורכו של חוט בדבק סיליקון משק בית על ידי נחת גוש של דבק על האגודל שלך, נוגע באגודל ואצבע המורה על החוט, ומפעיל אותם על החוט. בואו הדבק יתייבש בין הלילה.
6. לאחר שמתייבש הדבק, הנח את החוט על משטח שטוח תחת מיקרוסקופ לנתח משקף. חותך את קצה החוט שהיה בעבר באמצע, וכתוצאה מכך שני חוטים נפרדים מעווים יחד. זה האלקטרודה הפרש.
7. השתמש קלטת להחזיק אחד הקצוות של האלקטרודה במקום. שימוש במלקחיים לפשוט את הדבק ואמייל, להכין שני החוטים בקצה אחד יש כ 2 סנטימטר oו חוט חופשי עם כ 1 סנטימטר של החוט הופשט מאמייל. הלחמת סיכת זהב מחבר לכל אחד מהחוטים, וקלטת מעבדת מקום סביב הסיכות ללהפריד ביניהם.
8. בקצה השני של האלקטרודה, להכין את החוטים שיש על 3 מ"מ של חוט חופשי. הסרת האמייל מכ 1 את המ"מ האחרון של חוט אחד, וכופף את החוט הזה חזרה ואת הדרך. זה חוט ההפניה. זה קריטי, כי שני החוטים אין לי תיל חשוף נוגע זה בזה.
9. הסרת האמייל מהחוט השני את כל הדרך לדבק סיליקון. טוויסט החוט הזה לקרס וחותך אותו לאורך של כ 1 מ"מ. וו זה ייצרף לעצב או השריר. באמצעות וו קצר מספק יציבות גדולה יותר כאשר העצב הוא להיות מחובר לאלקטרודה.
10. השתמש מודד כדי לוודא שהאלקטרודה בנויה כהלכה ושלמה. מחבר זהב אחד צריך קריאת התנגדות של בערך 200-500 אוהם ביחס לקצה חוט אחד, וזהב האחר להתחבר או צריך להיות קריאה ביחס לחוט האחר דומה.
11. אם אין חיבור שלם על חוט אחד, זה עשוי להיות אפשרי לסוף מחדש להתפשט מחוט ולאחד מחדש הלחמה או שני המחברים המוזהבים ליצירת קשרים אלה. אם שני מחברי הזהב יש לו קשרים עם שני החוטים, האלקטרודה יכולה להיות שני חוטים חשופים ביצירת קשר. ייתכן שניתן יהיה לתקן את הקצה השני כדי לפתור את הבעיה, אחרת, את האלקטרודה אמורה להיות מושלכת.
12. חזור על התהליך עבור כאלקטרודות רבות כנחוצות לצורך הניסוי. אלקטרודות Hook ניתן שימוש חוזר מניסוי לניסוי על ידי חיתוך הקצה שמחובר לעצבים ויצירת ווים חדשים, עד החוט הופך קצר מדי אחרי שימושים רבים. בכל פעם שזה נעשה, להשתמש במודד כדי לוודא שהאלקטרודה היא ללא פגע.
13. כדי לעקוב אחר האלקטרודות השונה במהלך ניסויים, אלקטרודות מדבקות והכבלים שלהם. שימוש בצבעים שונים של קלטת מעבדה הוא מועיל.

s = "jove_title"> 4. Dissection בעלי החיים והכנה המונית buccal

1. בחר בעל חיים בריא של כ 200-300 משקל גרם. כאשר הציג עם אצות, בעלי החיים צריכים לייצר נושכים עם protractions החזק במרווחים קבועים של 3-5 שניות.
2. הנח את החיה במגש לנתח ולהרדים על ידי הזרקת תמיסת 50% משקל הגוף מגנזיום כלוריד איזוטוני. הפוך הזריקה הראשונה עם המזרק בכ 15-30 מעלות זווית, קרובה לאמצע ולכיוון הזנב של החיה. לאחר הזרקה, לעסות בעדינות את פני השטח של בעלי החיים להתפשט מגנזיום כלוריד. הפוך זריקות נוספות לפי צורך עם המזרק מצביע לעבר ראשו של בעל החיים.
3. לאחר החיה מפסיקה להגיב לגירויי מישוש עדינים, להצמיד את בעל חיים לצד המגש, הגבה למעלה, עם סיכה אחת בזנב וסיכה אחת בכל זרוע קדמית.
4. השתמש במלקחיים כדי לצבוט ולהרים את עורו של בעל החיים באמצע הראש, מאחורי rhinophores. MAKE חתך עטרה על ראשו של בעל החיים, ממש מאחורי מוחזקת הנקודה. ואז עושה חתך midsagittal הולך קדימה בבין rhinophores כלפי הפה, חשיפה המונית buccal.
5. השתמש במלקחיים כדי למשוך את קפל העור קרוב אליך ממסת buccal, ולחתוך את העצבים ורקמות חיבור שנצמד לדופן הגוף כדי להפריד דש זו של עור באופן מלא ממסת buccal. הקפד שלא סגר שום עצבים או רקמות פנימיות למסת buccal.
6. השתמש במלקחיים כדי לתפוס ולהחזיק את הוושט. חתך דרך הוושט האחורי לנקודה המוחזקת. משוך על הוושט להרים את מסת buccal כקיצוצים הבאים עשויים.
7. מאחורי מסת buccal, מוח, ריאות, וצורת גרעיני דוושת טבעת, עם גנגליון המוחין המחוברים לגרעיני buccal ידי קישורי ההמוחין-buccal (CBCs). אלה ישאירו גרעיני טבעת המחוברים למסת buccal, ולחתוך את כל העצבים מקרינים מגרעינים אלה לחלקים אחרים שלהגוף.
8. לחתוך את רקמות חיבור בכל רחבי ההמוניים buccal, ממשיך להרים את מסת buccal עד שזה הופך להיות פחות מחובר לגוף. ברגע שמסת buccal מצורפת רק בפה, הוושט ומסת buccal צריך להיות מוחזקים ישר למעלה.
9. לעשות חתך רק קדמי ללסתות כדי לשחרר את מסת buccal מהגוף סופי. מניח את מסת buccal בתמיסה של 50% פתרון איזוטוני מגנזיום כלוריד ו50% מלוחים Aplysia על מנת לשמור על הרדמה חלקית בזמן אלקטרודות מחוברות.
10. מניח את מסת buccal, עם פתרון, בצלחת פטרי עם תחתית Sylgard. הסר את גרעיני פלאורלי ודוושה על ידי חיתוך קשריהם לגנגליון המוחין. השאר את גנגליון המוחין המחוברים לגרעיני buccal ומסת buccal דרך קישורי ההמוחין-buccal (CBCs); לנתק את הקשרים אחרים בין גנגליון המוחין ומסת buccal. חתוך את הוושט ובלוטות רוק לאורכים קצרים כדי שלא גרםאח בדרך.

5. קובץ מצורף אלקטרודה הוק

1. להקלטה ולגירוי, אלקטרודות וו יכולות להיות מחוברות למספר עצבים ושרירים שונים, בהתאם לניסוי (איור 2).
2. כדי לאפיין את הדפוסים כפי שמודגם בvivo על ידי Cullins וChiel ^4, לצרף אלקטרודות לעצבי radular, I2 שרירים, ועצבי buccal 2 ו 3. יחד, קלטות אלה מראות את הפעילות של תאי עצב מוטורי לשריר הפנימי למסת buccal ^3,7,8 העיקרי, ולאפשר זיהוי של שלב הארכה מI2 ההקלטה ^3, שלב הנסיגה מן עצבי buccal 2 ו 3 קלטות ^{2 , 5,8,} ועיתוי של סגירת גספר המזון ^מ2 הקלטת עצב radular. צרף האלקטרודה קרס נוספת לסניף של 2 עצב buccal לגירוי דפוס. חיבור של אלקטרודות כדלקמן הליך דומה לזה demonstratאד על ידי Cullins וChiel ^4, והוא מתואר בשלבים הבאים.
3. עבור כל קובץ מצורף אלקטרודה, למקם את האלקטרודה במניפולטור גס. למניפולטור, קלטת מקל עץ עם קליפ תנין על הקצה ולהשתמש בקליפ להחזיק את הקצה של האלקטרודה. קליפ צריך לצרף לסעיף סיליקון המצופה של האלקטרודה, כ 1 סנטימטר לפני סוף ציפוי סיליקון. השתמש מניפולטור כדי למקם את האלקטרודה הוו ליד המוני buccal.
4. עם מסת buccal על צידו והניח על הצד של הצלחת ליציבות, תתחיל עם עצבי radular, המציג את הקובץ המצורף האלקטרודה הקשה ביותר. ישנן שתי אפשרויות לגישה לעצב הזה.
5. פרויקטי radular העצב מתחת לגנגליון buccal ועובר מתחת לשריר I2 בשני ענפים. ראשית, לראות אם עצב radular ניתן לגשת ללא חיתוך השרירים. להזיז קלות את הנדן הלבן מצרף גרעיני buccal לשריר I2; דo לא לחתוך את הנדן הזה. אם העצב הוא נגיש, להשתמש במלקחיים עם הנטייה לקצה קרס להרים סניף אחד של העצב.
6. אם עצב radular אינו נגיש באופן זה, אפשרות שנייה היא לאתר את העצב מתחת I2 השריר הרזה, ולעשות חתך קטן בI2 לחשוף את העצב. חתך זה צריך לעבור שתי שכבות של שרירים. השתמש במלקחיים המעוקלים לשלוף סניף של עצב radular מתחת לשריר.
7. השתמש מניפולטור למקם הקרס הסמוך לעצבים של האלקטרודה. כדי למקם את העצב אל הקרס, כדאי להחזיק את העצבים במלקחיים המעוקלים תוך שימוש בזוג נוסף של מלקחיים כדי ליצור הפרדה בין שני החצאים של העצב המוחזק.
8. לאחר העצב הוא מאובטח בוו, השתמש מניפולטור להרים את העצבים ממסת buccal עד שהוא מתוח, אבל לא להתמתח יתר על מידה.
9. קח Kimwipe ולסובב בחוזקה פינה אחת כדי ליצור פתיל קטן. השתמש פתיל זה להתייבשסוף האלקטרודה והקטע של עצבים שהוא מכור.
10. השתמש קבוצה נוספת של מלקחיים-קצה מעוגל ליישם טיפה של דבק סופר ג'ל המהיר לעצב המעוקל. בגין היישום בנקודת המגע בין חוט ועצב. ודא שהקרס מכוסה כולו בדבק, ושהקצה של חוט ההתייחסות אינו מכוסה בדבק (איור 3).
11. השתמש במזרק מצורף צינורות פוליאתילן ליישם פתרון מכלי ההגשה על הדבק, שיניעו את פני השטח של הדבק כדי להגדיר. הקפד לרחוץ ביסודיות את הדבק עם פתרון על מנת להבטיח כי הדבק מגדיר כראוי.
12. השתמש מניפולטור כדי לשחרר את המתח על העצב, ולאחר מכן שחרר את האלקטרודה מהסרטון. זה משלים את ההליך של הצמדת האלקטרודה קרס אחד.
13. האלקטרודה השריר I2 צריכה להיות מחוברת הבאה. אנו רושמים את פעילות EMG מI2 השריר ולא פעילות ENG מעצבי innervating משום שעצב I2 הוא מאוד SMAll וקשה לגישה במסת buccal ללא פגע. ליד עצב buccal 2, להשתמש במלקחיים המעוקלים להרים להקות אחד או שתיים של שריר I2, ולהשתמש בזוג נוסף של מלקחיים כדי לעזור להפריד ביניהם משאר השרירים. החלק מI2 נפרד צריך להיות דומה בעובי לעצב buccal 2 או 3. היזהר שלא מעל נפרד (שעשוי denervate שריר). צרף האלקטרודה וו עם אותו ההליך המשמש לעצב radular.
14. האלקטרודה הבאה לצרף היא שלסניף של עצב buccal 2. ענף זה יכול להיות מגורה חשמלי כדי לגרום מוטוריות תוכניות ^9. לפני עצב buccal 2 הולך מתחת I1 השריר בחריץ הרוחבי, עצב trifurcates; סניף הוא הסניף הראשון להתפצל. הסניפים הם די קטנים, ולכן הקובץ המצורף האלקטרודה צריך להיעשות בזהירות. בצע את אותו תהליך כדי לצרף את האלקטרודה.
15. עצבי buccal 2 ו 3 ניתן לגשת בקלות. בצע את אותו תהליך, מצרף elecבערך בחץ הדרך בין trodes גנגליון buccal והחריץ לרוחב.
16. כדי לסייע בהבחנת נוירונים עם תחזיות חד צדדיות לעומת דו צדדיות, זה גם שימושי לצרף אלקטרודות לעצבי buccal 2 ו 3 בצד השני של מסת buccal, כמו גם 2 סניף עצב buccal, כי נוירונים מסוימים מגיבים באופן שונה לעומת ipsilateral . נגדי BN2-גירוי.

6. מיצוב גנגליון ודליל הנדן

1. מסת buccal תועבר לסיבוב צלחת 100 x 50 מ"מ פיירקס תוארה בסעיף 2. ראה איור 1.
2. למרוח שכבה דקה של שומן ואקום לחריץ שבין תאי המוח וbuccal, תוך שימוש בטיפ pipet להרים גוש של שומן ואקום ופזר אותו על הרמה הגבוהה. אנחנו גילינו שגריז הוואקום ממזער זליגה טוב יותר וזלין. למלא את התא הקדמי עם מלח Aplysia. בזהירות להעביר את מסת buccal מצלחת פטרי לchamb הקדמיאה של הצלחת הגדולה הזה, כדי לוודא שאף אחד מהאלקטרודות משכו בחוזקה, שיכול לשבור את העצבים.
3. אם יש להעביר את התבשיל למשנה מיקרוסקופ לנתח המשקף לדילול הנדן, להיות מאוד זהיר עם אלקטרודות הקרס. קבוצת האלקטרודות בצד אחד של מסת buccal יחד, וגם הקבוצה את האלקטרודות בצד השני של מסת buccal יחד. זהירות להחזיק את האלקטרודות על ידי אחיזת קלטת המעבדה שמכסה את הפינים, שוב כדי לוודא שאף אחד מהאלקטרודות משכו בחוזקה.
4. כאשר המנה היא מיקומו תחת מיקרוסקופ, את האלקטרודות צריכה להיות עטופה בעדינות על צידי הצלחת והמנוחה על הרציף ליד הצלחת.
5. במהלך הפסקות ובין השלבים של הניסוי, לאוורר המלוח בתא ההמוני buccal באמצעות airstone אקווריום.
6. הצמד גנגליון המוחין בגב עם קישורי ההמוחין-buccal (CBCs), שעובר בחריץ. החל גרם ואקום יותרrease על CBCs, לאחר מכן להוסיף מלח Aplysia יותר לשני החלקים של הצלחת, כך הגרעינים הם שקועים לחלוטין. ודא כי הכמות של שומן ואקום הנוסף היא גבוהה יותר מהרמה של מי מלח בשני תאי המוח או buccal כך אין זליגה מתרחשת בין התאים. בשלב זה, מסת buccal צריכה לנוח בתחתית התא הקדמי כדי לא למשוך יותר מדי כוח על העצבים וגרעינים.
7. הצמד גרעיני buccal על פלטפורמת האמצע. כדי להימנע מניזק לעצבים שעדיין מחוברים למסת buccal, הנח פינים רק על הנדן בין שני עצבים. הוסף עוד שני פינים בצד של CBCs כדי למתוח ולעגן אותם.
8. להחזיק בדירת buccal הגרעינים או לסובב מבוססת על מיקומו של הנוירונים של עניין. כדי לסובב את גנגליון buccal, להשתמש במלקחיים עדינים לנדן לתפוס קצת עודף של CBC ולהצמיד אותו בין עצבי buccal 2 ו 3. אז רוב הגופות הסלולריות, כי הם בסמוך לחדר האחורי ולא יכול להיות easily לגשת מהחלק העליון של הגנגליון buccal ניתן לראות. לבסוף, להוסיף שני פינים בנדן של גנגליון הסמוך לצד ההמוני buccal כדי למזער את התנועה של גנגליון buccal buccal. ראה איור 4.
9. השתמש במלקחיים עדינים לתפוס את הנדן של גנגליון הסמוך לחדר האחורי buccal, ולאחר מכן לחתוך את הנדן העודף עם מספריים מצוינים בלי לחשוף את גופי התא. כדי למזער את הניזק, הוצא את כמות נדן הצורך לראות את גופי תאים בלבד.

7. גירוי והקלטה

1. לאחר הדילול של הנדן הושלם, לצרף את כל סיכות אלקטרודה לחוריהן בכבלים המחברים את המגברים. שוב, לוודא שהאלקטרודות לא משכה בחוזקה בעת עושה את זה. ודא שהאלקטרודות מחוברות נכונה לכבלים המתאימים להן וכי הקוטביות נכונה.
2. כדי לשטוף את כל מגנזיום כלוריד שנותר, החלף Aplysiמלח בתא ההמוני buccal עם מלח Aplysia טרי.
3. השחל תפר משי דרך הרקמות הרכות בחלק הקדמי של מסת buccal, anterodorsal לסחוס בלסת, ולהשתמש בשתי חתיכות של פלסטלינה לצרף תפר לקצה הצלחת, ובכך השעיית המונית buccal מהקצה הקדמי שלה. שים לב כי בסופו האחורי מושעה על ידי עצבי buccal המצורפים לגרעיני buccal.
4. מקם מניפולטור מחזיק האלקטרודה תאית זכוכית כך שקצה האלקטרודה קרובה גנגליון buccal.
5. כדי לאתר ולזהות נוירון, השתמש מניפולטור עדינות ללחוץ כלפי מטה את הקצה של האלקטרודה התאית על העורלה מעל נוירון סומה (איור 5). החל נוכחי מעורר, ולאחר מכן לעבור לערוץ שנמצא בשימוש כדי להלהיב את סומה למצב הקלטה כדי להקליט את הפעילות על האלקטרודה התאית ופעילות מקבילה על העצבים (איור 6). להתייחסלמפות שפורסמו גנגליון ותיאורי נוירון, כוללים תחזיות עצביות ועצבוב שרירים, (למשל ^7,8) לעזרה בזיהוי של תאי עצב.
6. להקלטת וידאו של תוכניות האכלה, עמדת מראה בצד של הצלחת, כך שהתצוגות הקדמיות והצדדיות של מסת buccal ניתן לראות בו זמנית (מיקום של המראה מוצג סכמטי באיור 1). מקם מצלמת וידאו קדמי ועם נוף צדדי בתחומו של נוף.
7. הקלטות וידאו ואלקטרו ניתן לסנכרן באמצעות שליחת TTL דופק לשניהם שעון אלקטרוני בתצוגה של המצלמה ולערוץ בAxoGraph, תכנית המחשב המשמשת להקלטה וניתוח נתוני אלקטרו. דופק זה מספק נקודת זמן שהיא בדיוק אותו הדבר בהקלטות AxoGraph ווידאו, אשר מבוססים על הקבצים שניתן לסנכרן.
8. לאחר נוירון ממוקם, פעילותו ניתן להקליט בהתנהגויות האכלה דמוית שונות, CA אשרn שהושר כמתואר להלן.
9. כדי לגרום לדחייה כמו תוכניות מוטוריות, לגרות BN2-עם שובל ארוך של 2 הרץ, 1 msec ⁹ קטניות (הניסיון שלנו הוא שהגירוי הזה אמין מייצר דפוסי egestive בהגדרה זו). דפוסים להמשיך לתקופת הגירוי ויכולים להימשך עד זמן קצר לאחר הגירוי מסתיים.
10. כדי לגרום לתוכנות מוטוריות נושך כמו ^12, מקום כמה גבישים של carbachol המוצק ישירות על גנגליון המוחין. לחלופין, אם ברמה מבוקרת של חשיפת carbachol היא צורך, להשתמש בפתרון של בין 1 ל 10 carbachol המ"מ Aplysia מלוח. ריכוזים גבוהים יותר עשויים להניב תגובות. דפוסים חוזרים בדרך כלל מתחילים בתוך 5 דקות, ועבר לבערך 10 עד 15 דקות לפני התחילה לרוץ למטה.
11. כדי לגרום לבליעה כמו תוכניות מוטוריות ^13, תחול carbachol, ולחכות עד שמסת buccal מייצרת נשיכות חזקות. ואז, במהלך נשיכה, הנח רצועהשל אצות (כיור מיובש) בפיו של בעל החיים כדי שradula תופס אצות הים (איור 7). רצועות הן בדרך כלל רחבות 0.5 סנטימטרים על 5 סנטימטר באורך.
12. לאחר הסדרה הראשונה של דפוסים carbachol מושרים, הוא לעתים קרובות ניתן לקבל תשובות carbachol נוספות. לשטוף ביסודיות את מלוח Aplysia בתא גנגליון המוחין, הסרה והחלפה המלוחה לפחות שלוש פעמים. חכה לפחות 20 דקות לפני מריחת carbachol שוב. מחכה עד 40 דקות עשויות להניב תוצאות אמינות יותר.

בשלב זה בארצות הברית, בעלי חיים חסרי חוליות אינם דורשים אישור רשמי על ידי שימוש בבעלי חיים מוסדיים ועדה וטיפול. עם זאת, אנו מבטיחים שכל הטיפולים של Aplysia למזער את הניזק וסבלו לבעלי החיים, וכי כל הניתוחים נעשים בעוד החיה היא מורדמת באופן מלא.

תוצאות

כאשר אלקטרודה חוץ-תאית ממוקמת מעל גוף התא (soma) של נוירון ומשמשת לגירוי הנוירון, ניתן להבחין בהתאמה של אחד-לאחד בין פולסים (spikes) בערוץ גוף התא לבין הפולסים בעצבים שאליהם הנוירון מקרין (איור 6, פנל שמאלי, גירוי של נוירון מזוהה B9). ערוץ גוף התא (הערוץ העליון) מוגדר למצב גירוי בעת הפעלת הזרם (זמן 1 באיור), ולאחר מכן מועבר במהירות למצב הקלטה (זמן 2). על ידי שמירה על מיקומה של האלקטרודה, ניתן להקליט את פעילות הנוירון במהלך תוכניות מוטוריות (איור 6, פנל ימני), יחד עם פעילות משריר I2, עצב ...

דיון

עבודה קודמת אפיינה תוכניות Aplysia מוטוריות בבעלי החיים השלמים ובהכנות מוקטנות, כגון גרעינים מבודדים. בחיה השלמה, למרות שהקלטות של נוירונים בודדים הושגו ^5, ניסויים כאלה הם קשים מאוד, ואלקטרודות לא ניתן להעביר מתא העצב לתא עצב במהלך האכלה. בגרעינים מבודדים, תנועות ההאכלה הנגרמות על ידי פעילות עצבית לא ניתן לצפות. ההכנה ההמונית buccal המושעה מגשרת על הפער בין שני הקטבים האלה.

תכשירים אחרים למחצה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן כלוריד	Fisher Scientific	S671	ביולוגי, מאושר
אשומ כלוריד	Fisher Scientific	P217	מאושר ACS
מגנזיום כלוריד הקסאהידראט	Acros Organics	19753	99%
מגנזיום סולפט הפטהידראט	Fisher Scientific	M63	מאושר ACS
סידן כלוריד דיהידראט	Fisher Scientifc	C79	מאושר ACS
גלוקוז (דקסטרוז)	Sigma-Aldrich	G7528	BioXtra
בופר MOPS	Acros Organics	17263	99%
קרבכול	Acros Organics	10824	99%
נתרן הידרוקסיד	Fisher Scientific	SS255	מאושר
חומצה הידרוכלורית	Fisher Scientific	SA49	מאושר
זכוכית קפילרית בעלת צינור יחיד	A-M Systems	6150
מכשיר משיכה של מיקרופיפטות Flaming-Brown דגם P-80/PC	Sutter Instruments		פילמנט בשימוש: FT345B
חוט פלדה אל-חלודה מצופה אמייל	California Fine Wire		0.001D, ציפוי h
דבק סיליקון ביתי II	GE
דבק מהיר Duro Quick-Gel	Henkel corp.
מגבר A-M Systems דגם 1700	A-M Systems		הגדרות סינון: 300-500 Hz עצבים, 10-500 Hz שריר I2
מגרה רב-ערוצית Pulsemaster	World Precision Instruments	A300
מבודד גירוי	World Precision Instruments	A360
AxoGraph X	AxoGraph Scientific
מונה סיכום Veeder-Root	Danaher	C342-0562
פיני חיבור מזהב	Bulgin	SA3148/1
שקעי חיבור מזהב	Bulgin	SA3149/1
אלסטומר סיליקון Sylgard 184	Dow Corning
צלוחית התגבשות 100 x 50 mm	Pyrex
גריז לוואקום גבוה	Dow Corning
טיפים לפיפטה	Fisher Scientific	21-375D
פיני Minutien	Fine Science Tools	26002-10
פלסטלינה	Sargent Art	22-4400
תשורי משי	Ethicon	K89OH
משאבת אוויר Whisper	Tetra	77849
צינורית אקווריום	Eheim	7783	12/16 mm
אבן אוויר Elite	Hagen	A962
מספרי קפיץ Vannas	Fine Science Tools	15000-08
פינצטה עדינה Dumont #5	Fine Science Tools	11254-20
אצות ים Yaki Sushi Nori	Rhee Bros
נייר ניגוב Kimwipes	Kimberly-Clark	34155