דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

סיכום

פרוטוקולים להתמיינות עצבית של תאי גזע האנושי pluripotent (hPSCs) הם לעתים קרובות זמן רבים ודורשים מיומנויות סלולריות תרבות משמעותיות. הנה, יש לנו מותאם הליך בידול מולקולה מבוססת קטן לפורמט צלחת multititre, המאפשר לדור פשוט, מהיר ויעיל של תאי עצב אנושי באופן מבוקר.

תקציר

פרוטוקולים קיימים לדור של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם (hPSCs) הם לעתים קרובות מייגעים שבהם נהלים רבים שלבים המעורבים הבידוד וההתרחבות של תאים מבשרים עצביים, לפני ההתמיינות סופנית. בהשוואה לגישות זמן רב אלה, שמצאנו לאחרונה כי עיכוב משותף של שלושה מסלולי איתות, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 וFGF / ERK, מקדם אינדוקציה מהירה של neuroectoderm מhPSCs, ואחריו בידול מיידי לנוירונים פונקציונלי. הנה, יש לנו הנוהל שלנו הותאמו לפורמט צלחת multititre רומן, כדי לשפר עוד יותר את השחזור שלה וכדי לעשות את זה תואם עם יישומי אמצע תפוקה. היא כוללת ארבעה ימים של היווצרות neuroectoderm בתחומים צפים (גופי embryoid), ואחריו ארבעה ימים נוספים של בידול לנוירונים בתנאי חסיד. רוב התאים שהושגו עם פרוטוקול זה להיראות נוירונים חושיים דו קוטביים. יתר על כן,ההליך הוא יעיל ביותר, אינו דורש מיומנויות מומחה מסוימות, והוא מבוסס על מדיום הגדרה כימית פשוט עם מולקולות קטנות חסכוניות. בשל תכונות אלה, ההליך עשוי לשמש כפלטפורמה שימושית לחקירה פונקציונלית נוספת וגם להקרנה מבוססת תאים מתקרב דורש נוירונים חושיים אדם או נוירונים מכל סוג.

מבוא

hPSCs, המהווים עוברי מופקים תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע pluripotent מושרים (hiPSCs), הוא משמעות pluripotent שהם יכולים להצמיח שושלות תאים שונות במבחנת ^1-2. סוגי תאים מובחנים רבים שנגזרים מhESCs עד כה, תומכים ברעיון כי התאים הללו מהווים כלים חשובים למחקר מדעי וגישות הקרנה מבוססות תאים, והבטחה עבור תרופות מבוססות תאים.

פרוטוקולי בידול עצביים לhESCs הם בדרך כלל מורכבים ודורשים זמן רבים כפי שהם לעתים קרובות מבוססים על גורל 1 התרמה כולל עצבי, ואחרי בידוד ידני של אבות עצביים, ובידול מסוף רציף שסוג נוירון עניין מסוים ^3-6. בהקשר מסוים, מורכבות זו אינה מפתיעה ובלתי נמנעת בהתחשב בכך שפרוטוקולי בידול מכוון כגון מדינה-of-the-art נוטים לחקות שלבי התפתחות אנושית מוקדמת, whicח הוא בעצמו מורכב ביותר. מצד השני, היא עשויה בחלקו גם משקפת חוסר ההבנה שלנו את התהליכים המולקולריים שבבסיס, וכתוצאה מפרוטוקולי בידול, כי הם עדיין רחוקים מלהיות מותאמים באופן מלא.

בכל קשור להמרה של hPSCs עבר התמיינות לneuroectoderm, פרה et al. מצא כי דיכוי איתות BMP / SMAD1/5/8 משפר השראה עצבית של ⁷ hESCs. יתר על כן, איון של SMAD2 / 3 איתות הוכח לקדם היווצרות neuroectoderm ^8. בהתאם לכך, בשילוב של איון שני מסלולים אלה נוטה להוביל להשראה עצבית יעילה יותר של hPSCs ^4,9. לאחרונה, שהראינו כי מסלול איתות שלישית, FGF / ERK, משמש כמדכא חזקה של את הצעדים הראשונים של מחויבות neuroectodermal בhESCs. מנגד, דיכוי סימולטני של כל שלושה מסלולים אלו מובילים להמרה כמעט הומוגנית של hESCs לneuroectoderm עםבארבעה ימים בלבד ^10. לאחר מכן, בידול מסוף היעיל ביותר לנוירונים פונקציונלי נצפה בתוך שמונה ימים. הנוירונים שהושגו היו עשויים להיות נוירונים חושיים של מערכת עצבים ההיקפית, שעשוי בחלקו להסביר הגזירה המהירה שלהם ^10. ליקויים בתחזוקת נוירון חושית נחשבים סיבה להפרעות אדם מסוימות, כגון ¹¹ דיסאוטונומיה משפחתית. לדוגמנות מחלות כאלה המבוססים על טכנולוגית hiPSC ^12, לאפיון פונקציונלי נוסף, כמו גם למטרות שימושיות שלא דורשים כל סוג מסוים של תאי עצב, הליך הבחנה זו עשויה להציג בסיס שימושי.

עם זאת, אסטרטגית הבידול העסקנו היווצרות מעורבת של גופים עובריים (EBS) במקור מגושים של מושבות hESC ^10, וזה הביאה די מידת ההטרוגניות לגבי גדלי EB, והופיעה גם להתפשר יעילות היווצרות תא עצב בחלק ceקווי LL. יתר על כן, בשל ההטרוגניות בגדלי EB, היכולת השיטתית כדי לבחון השפעות של גורמי גדילה נוספים או מולקולות קטנות במהלך ואחרי היווצרות נוירון נראה היה מבולבלת במקצת.

בדו"ח זה, התאמן ההליך הקודם שלנו לטכניקה בינונית תפוקה תואמת, נאלצה צבירה מבוססת לייצר EBS באופן מאוד גודל מבוקר, כפי שהראה גם בהקשרים אחרים ^13. כתוצאה מכך, נוצר EBS בבארות בצורת V של צלחות גם 96-הועברו לקובץ מצורף בצורת U נמוך במיוחד 96-גם צלחות, ליזום היווצרות neuroectoderm בהשעיה. ארבעה ימים לאחר מכן, EBS יכול להיות מצופה מהוליד הנוירונים נבדלים סופנים ביעילות גבוהה והומוגניות. לחלופין, יום-4 EBS היו ניתק לתוך תאים בודדים ומצופה כאמורים, אשר הביא monolayers צפיפות הנמוכה של תאי עצב אנושיים. תוצאות עקביות וכך התקבלו הרבה באופן עצמאי 2 דהקווים מבוקעים hESC, HuES6 וNCL3.

כתנאי מוקדם, היווצרות EB המוצלחת הייתה בהחלט תלויה בשימוש בפולימר סינטטי, אלכוהול פוליוויניל (PVA), יחד עם מעכב ROCK Y-27632 הידועים כדי לקדם הישרדות hESC ^13-14. כתוצאה מכך, ההומוגניות של EBS נוצרה ב96-V-צלחות היה משופר באופן משמעותי בהשוואה להיווצרות של EBS כתרבויות המוניות המבוססות על טכניקות פיצול אקראיות. מערכת זו ובכך מספקת פלטפורמה השתפרה באופן משמעותי להיווצרות neuroectoderm בתרבות השעיה, ואחרי היווצרות נוירון מבוקרת מאוד בתנאי חסיד.

פרוטוקול

1. הכנת הצלחות Matrigel מצופות ומדיה

1. הכנת Matrigel הצלחות Matrigel המצופה כבר מצא להיות מצע מועדף לצירופה של הבחנת EBS וגם מקדמת היעילה התולדה של נוירונים ^מ10 אלה.
   1. 10 מיליליטר הפשרה של Matrigel הלילה על קרח.
   2. למחרת, מדלל דמוי הג'לי Matrigel עם שני כרכים של DMEM/F-12 קר כקרח ולהכין aliquots של 1 מ"ל ב15 צינורות חרוטי מ"ל prechilled אשר עשוי להיות מאוחסן קפוא ב -20 ° C.
   3. החלט על פורמט צלחת להתמיינות עצבית. לדוגמה, כנקודת התחלה, אנו ממליצים לבצע סבב ראשוני של בידול בפורמט 12-כן. טרום מגניבות ארבע צלחות 12-גם ב 4 ° C. ממס aliquot אחד Matrigel הקפוא על ידי הוספת 9 מ"ל של DMEM/F-12 מראש מצונן ואחרי pipetting מעלה ומטה עד שכל Matrigel prediluted כבר הפשיר ונמס.
   4. אז, להעביר את התוכן לתוך צינור חדש מ"ל 50 המכיל 15 מ"ל של DMEM/F-12 על קרח (דילול סופי Matrigel: 1:75). לאחר מכן יש להוסיף 0.5 מ"ל של Matrigel המדולל לכל אחד גם מהצלחות מראש המקוררות 12-כן. לעטוף צלחות עם Parafilm ולתת לעמוד בRT בן הלילה.
   5. למחרת, להעביר צלחות עד 4 ° C. צלחות מצופות יכולות להיות מאוחסנות במשך מספר שבועות לפני השימוש.
2. כלי תקשורת

בינוני היווצרות EB (~ 15 מ"ל צורך לבצע בידול באחד צלחת 96 היטב - ראה טבלה 1 וסכימה באיור 2):
DMEM/F-12 עם 0.4% (PVA)
1x N2
1x B27
0.05% BSA
20 ng / ml FGF2
10 מיקרומטר Y-27632
1x PenStrepGln

בידול בינוני (~ 30 מ"ל הצורך לבצע בידול באחד צלחת 96 היטב, ואחרי היווצרות נוירון בצלחת Matrigel מצופית 1 12-כן, ראה טבלה 1):
DMEM/F-12
1x N2
1x B27
0.05% BSA
0.5 מיקרומטר PD0325901
15 SB431542 מיקרומטר
Dorsomorphin מיקרומטר 0.5
1x PenStrepGln

2. גיבוש EB כפייה

1. לגדול בתנאי hPSCs מזין נטולי המועדפים שלך. אנו משתמשים במדיום MEF ממוזג על צלחות Matrigel מצופות 6-כן ^15. עם זאת, מערכות תרבות אחרות כגון מדיה ביתית או מסחרית שהוגדרה צריכות גם לעבוד. בעת התחלת ניסוי בידול, hPSCs צריך להיות תת confluent ופעילה הולכים וגדל.
2. מכאני להסיר מושבות ספונטניות נבדלות באמצעות קצה פיפטה פלסטיק סטרילי תחת מיקרוסקופ סטריאו.
3. שטוף מושבות עברו התמיינות נותרת באמצעות PBS ולעכל לתאים בודדים באמצעות Accutase המכיל 1X Y-27632. תאים גלולים בודדים על ידי צנטריפוגה XG ב 200 במשך 2 דקות, resuspend בנפח קטן של מדיום EB היווצרות ולקבוע titre תא באמצעות hematocytometer.
4. הוסף aliquot של תאים כדיהבינוני נותר EB היווצרות כדי לגרום titre בין 40,000 ל 80,000 תאים למ"ל.
5. באמצעות פיפטה רב, להעביר 100 μl להיטב לצלחת 96V בתחתית, וכתוצאה מכך 4,000 עד 8,000 תאים לכל היטב. ספין הצלחת 96-גם בצנטריפוגה צלחת נדנדה החוצה ב 400 XG ל1 דקות כדי לאסוף תאים בחלק התחתון של הבארות, ולהעביר לתא תרבות חממה. EBS יהווה בין הלילה, כפי שמוצג באיור 1.

3. אינדוקצית Neuroectoderm

1. למחרת (יום 0), לאסוף EBS מצלחת 96V תחת מיקרוסקופ והעברת סטריאו בנפח קטן לתוך צלחת חיידקים 3.5 סנטימטר המכיל 2 מ"ל של מדיום בידול. עדינות להתסיס את המנה לכמה שניות כדי לשטוף את EBS.
2. הוסף 100 μl של מדיום התמיינות לטובה של U-תחתון נמוך במיוחד-96-מצורף צלחת היטב. תחת stereomicroscope, ההעברה EBS בנפחים קטנים מתבשיל הכביסה ל96U הבארות (EB אחד לכולנוLL). צלחת המקום 96U לתוך תא תרבות החממה במשך 4 ימים כדי לאפשר היווצרות neuroectoderm.

4. גיבוש Neuron

1. ביום 4, להכין תבשיל כביסה כמו בשלב 3.1 ובנוסף להחליף DMEM/F-12 בצלחת שחוממה מראש Matrigel מצופת 12-היטב על ידי מדיום התמיינות (1 מ"ל לטוב).
2. ציפוי של EBS
   1. איסוף EBS מצלחת 96U, לשטוף אלה כאמורים לעיל, ובזהירות זרעם אחד אחד לתוך בארות של צלחת Matrigel המצופית 12-היטב (כ 8 EBS לטוב): EBS צריך להיות מופץ באופן שווה בתוך הבארות כדי לאפשר תולדה של הפרעה נוירונים במשך הימים הקרובים (ראה "היום 5" תמונה באיור 2).
   2. לפני ההעברה של גב הצלחת 12-גם לתוך החממה, תאפשר EBS לרפיון לצרף עבור סביב 10 דקות ב RT. ואז, להעביר צלחת 12-היטב בזהירות לתא תרבות חממה. הנוירונים יצמחו מEBS מצופה בצורה רדיאלית בתוך 4 הימים הבאים, כפי שshown באיור 2 ("יום 8" תמונה מהימין).

5. גיבוש נוירון כmonolayers

1. כחלופה למדרגות נקודה 4), ביום 4 להליך, לאסוף EBS לתוך צלחת חיידקים 3.5 סנטימטר המכיל 2 מ"ל של מדיום התמיינות, ולאחר מכן להעביר את EBS בנפח קטן לצלחת המכילה PBS, ולאחר מכן אל מנה נוספת המכילה Accutase.
2. תן לעכל לתאים בודדים, צנטריפוגה XG ב 200 במשך 2 דקות, resuspend בנפח קטן של מדיום בידול ולקבוע titre תא באמצעות hematocytometer. התאם titre ל1-2x10 ⁶ תאים למ"ל באמצעות מדיום התמיינות (ללא Y-27632).
3. תאים את הצלחת בצלחת שחוממה מראש Matrigel מצופית 12-כן (1 מ"ל לטוב), והעברה לתא תרבות חממה. היווצרות נוירון כmonolayers נצפתה בין ימים 7 עד 8 ​​(האיור 3C). יש לציין, עם זאת, כי גרסה זו של monolayerהנוהל אינו מותאם באופן מלא בכל קשור להישרדות תא ומצע המתאים ביותר.

תוצאות

בדו"ח הקודם שלנו, בקו אחד עם רבים אחרים, EBS מhPSCs יכול להיות שנוצר פשוט על ידי replating אגרגטים בזמן חלוקה שגרתית של hPSCs למאכלים-התקשרות נמוכה ^10. בדרך כלל זה גורם הפצה רחבה של גדלים וכתוצאה EB (האיור 1C, למעלה). בעיה נוספת שנובעת מכך היא שמרה EBS בהשעיה נוטה לצבור אחד עם שני, מה שמוביל להטרוגניות גבוהה אף יותר של גדלי EB. כדי להתגבר על בעיות אלו, ולכן אנו מנסים ליצור EBS על ידי ציפוי hPSCs היחיד להתקשרות נמוכה בארות של צלחות multititre (אי...

דיון

רוב פרוטוקולי בידול מעורבי היווצרות EB מhPSCs, כולל ההליך שלנו שפורסם בעבר ^10, מבוססים על קצירה ידנית או בסיוע של האנזים hESCs כאגרגטים, שמוביל בהכרח להטרוגניות בגדלי EB. עובדה זו מובילה לשונות ביעילות בידול עם כמה שורות תאים, ובכך הופך את הניתוח שיטתי קשה, במיוחד בקנה מידת תפוקה בינוני. יתר על כן, נתיחה ידנית היא עתירה עבודה שפוגעת בעצמו יכולת רחבה.

לעומת זאת, בשיטה המתוארת כאן מבוססת על היווצרות EB מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
Matrigel HC	הקיטון דיקינסון	354263	ראה טקסט לפרטים על הטיפול
DMEM/F-12	חי טכנולוגיות	21331-020
פולי (ויניל אלכוהול)	סיגמא	363170	ממס ב 0.4% בDMEM/F-12 באמצעות waterbath קולי / למנוע התחממות יתר / יכול להיות כל זמן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות
מוסף N2	חי טכנולוגיות	17502-048	100X, לאחסן aliquots הקפוא
B27 מוסף	חי טכנולוגיות	12587-010	, חנות 50x כaliquots קפוא
שור הסרום אלבומין	סיגמא	A1595	10% = 500X, חנות כaliquots קפוא
L-גלוטמין עם פניצילין / סטרפטומיצין	Paa	P11-013	או שווה ערך
FGF2	Peprotech	100-18B	להמס ב10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב0.1% BSA / PBS =, חנות 1000x כaliquots קפוא
ROCK המעכב Y-27632	abcamBiochemicals	עולים-129	ממס ב 10 המ"מ DMSO =, חנות 1000x כaliquots קפוא
PBS	Paa	H15-002	או שווה ערך
Accutase	Paa	L11-007
96-גם צלחות V-תחתונות	Nunc	277143
PD0325901	אקסון Medchem	אקסון 1408	להמס ב0.5 מ"מ בDMSO =, חנות 1000x כaliquots קפוא
SB431542	abcamBiochemicals	עולים-163	להמס ב15 מ"מ בDMSO =, חנות 1000x כaliquots קפוא
Dorsomorphin	סנט קרוז	SC-200689	להמס ב0.5 מ"מ בDMSO =, חנות 1000x כaliquots קפוא
צלחות התקשרות נמוכות במיוחד תחתונות U-96-היטב	קורנינג	7007
נוגדן טובולין בטא שלישי (עכבר)	סיגמא	T8660	להשתמש ב1:1000
נוגדן טובולין בטא שלישי (ארנב)	Covance	PRB-435P	להשתמש ב1:2000
נוגדן BRN3A (POU4F1)	סנט קרוז	SC-8429	להשתמש ב1:500
			טבלת 1. </ Strong> ריאגנטים וציוד ספציפיים.