כאן אנו מציגים שיטה להפעלה פוטו-אקטיבית של חלבוני פלואורסצנציה הניתנים להמרה פוטו-כימית (PCFPs) בעובר דג זבוב חי, ומעקב המשך אחר החלבון שהומר בנקודות זמן ספציפיות במהלך ההתפתחות. מתודולוגיה זו מאפשרת ניטור של אירועים ביולוגיים תאיים העומדים בבסיס תהליכי התפתחות שונים באורגניזם חולייר חי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה
במאמר זה
סיכום
תקציר
העתק embryogenesis הוא תהליך דינמי שניתן לחקורו בצורה הטובה ביותר באמצעות טכניקות המאפשרות תיעוד של שינויים התפתחותיים in vivo. השימוש בחלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית התגלה כאסטרטגיה בעלת ערך להבהרה של תהליכים מורפוגנטיים דינמיים בעודם מתרחשים באורגניזם שלם. במהלך העשור האחרון, פיתוחם של חלבונים פלואורסצנטיים המופעלים על ידי אור (photoactivatable) וניתנים להמרה פוטוכימית (photoconvertible) פתח את האפשרות לחקור את גורלן של תתי-אוכלוסיות מובחנות של חלבונים מסומנים1. בניגוד לחלבונים המופעלים על ידי אור, חלבונים פלואורסצנטיים ניתנים להמרה פוטוכימית (PCFPs) ניתנים למעקב ולדימות בקלות במצב הפליטה הטבעי שלהם לפני ההמרה הפוטוכימית, מה שמקל על זיהוי ובחירת אזורים באמצעות בדיקה אופטית. PCFPs, כגון Kaede2, KikGR3, Dendra4 ו-EosFP5, יכולים להשתנות מירוק לגוון אדום בעקבות חשיפה לאור UV או לאור כחול, וזאת בשל רצף טריפפטיד His-Tyr-Gly היוצר כרומופור ירוק שניתן להמיר באופן פוטוכימי לכרומופור אדום על ידי β-elimination המזורז על ידי אור והרחבה עוקבת של מערכת π-conjugated3. PCFPs והוריאנטים מונומריים שלהם הם כלים שימושיים למעקב אחר תאים6-10 וללימוד דינמיקה של חלבונים11-14, בהתאמה. בשנים האחרונות, PCFPs בוטאו במודלים שונים של בעלי חיים, כגון דג זברה (zebrafish)6, תרנגולת7,8 ועכבר9,10, לצורך מעקב אחר גורל תאים. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול להמרה פוטוכימית ספציפית לתאים של PCFPs בעובר דג זברה חי, ומעקב המשך אחר חלבונים שעברו המרה בשלבים התפתחותיים מאוחרים יותר. מתודולוגיה זו מאפשרת לחקור, באופן ספציפי לרקמה, אירועים ביולוגיים של תאים העומדים בבסיס המורפוגנזה במודל בעל החיים של דג הזברה.
פרוטוקול
1. השגת עוברים עבור בדיקת הפוטו-המרה
בביצוע הכלאה פנימית של דגי זברה טרנסגניים המבטאים PCFP, נבחרים העוברים הזוהרים ביותר, שהם הומוזיגוטים, והם גדלים בטמפרטורה של 28.5 °C עד לשלב העוברי הרצוי15.
הערה 1: סבב בחירה מקדמי זה יאפשר סריקה של עוברים בעוצמת לייזר נמוכה, ובכך למנוע פוטוטוקסיות ופוטובליצ'ינג.
הערה 2: אנו ממליצים להשתמש בתאורה בעוצמה נמוכה בעת הדמיון של עוברים ולשמור אותם בתנאי חשיכה, בשל הרגישות הגבוהה של PCFPs, כגון Kaede ו-KikGR, לחשיפה לאור, כולל אור יום.
2. הטמעה
- בתוך כלי זכוכית המכיל מי-ביצים, בצעו דה-כוריאונציה (הסרת מעטפת הביצה) לעוברים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי באמצעות פינצטה.
- הרדימו את העוברים על ידי העברת עובר שעבר דה-כוריאונציה לתוך תמיסת Tricaine בריכוז 0.16 mg/ml (3-amino benzoic acidethylester, Sigma-Aldrich) (40μl של תמיסת מקור בריכוז 4 mg/ml בתוך 1 ml של תווך E3 1X).
הערה 1: העבירו את העוברים באמצעות פיפטה מזכוכית או פיפטה עם קצה חתוך (P1000) כדי למזער את הסיכון לפגיעה בעוברים.
הערה 2: אין לחשוף עוברים צעירים לאחר הסרת הדכוריון (dechorionated) לאוויר או להעלותם לממשק המים/אוויר, מכיוון שהביצים נסדקות בקלות תחת מאמץ מכני.
- העבירו את העובר המורדם למכסה של כלי תרבית ושמרו על העובר בנפח המינימלי האפשרי של תוצר.
- העבירו את העובר אל תוך אגרוז על ידי שאיבה של העובר עם אגרוז בעל טמפרטורת התכה נמוכה של 1% (LMA, Lonza) בטמפרטורה של 30 °C המכיל 0.16 mg/ml Tricaine, והניחו אותו על זכוכית הכיסוי של כלי תרבית בעל תחתית מזכוכית כיסוי (MatTek Corp. Ashland MA USA). לאחר מכן, כווןו את העובר בעזרת טיפ פלסטי חלק (למשל טיפ של Microloader Pipette חתוך, Eppendorf) וכאשר ה-LMA התבלגט, כסו את האגרוז בתמיסת 0.16 mg/ml Tricaine.
הערה 1: יש להמיס 1% LMA ב-60 °C ולשמור על האגרוז המומס ב-30 °C.
3. פוטו-המרה
- באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך המצויד במקור לייזר של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו-561 ננומטר, כגון Zeiss LSM 710, הדמיאו את הדגימה באמצעות סריקת z-Stack המכסה את כל מבנה הדגימה שתוכנן לעבור פוטו-המרה ומעקב מאוחר יותר באמצעות לייזר של 488 ננומטר (כלומר, לייזר Ar בהספק 30 mW, בעוצמה של 5-7%, גלאי המכוון ל-493-540 nm) ולייזר 561 nm (כלומר, לייזר DPSS 561 בהספק 10 mW, בעוצמה של 7-9%, גלאי המכוון ל-587-651) לסריקת הרקמה/איבר לאיתור פלואורסצנציה ירוקה ואדומה של החלבונים העוברים פוטו-המרה, בהתאמה.
הערה 1: עבור הסריקה לפני הפוטו-המרה (photoconversion), השתמשנו בעדשה אובייקטיבית Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
הערה 2: סרקו תמיד לבדיקת פלואורסצנציה אדומה לפני הניסוי כדי לשלול נוכחות של PCFP שהומר לאדום באופן מקרי.
- בחרו בכלי ה-Time series והגדירו 2 מחזורים ללא מרווח (אחד עבור שלב טרום-הפוטוקונוורסיה ואחד עבור שלב פוסט-הפוטוקונוורסיה).
- בחרו בכלי ה-Regions והגדירו אזור עניין (ROI) אחד או יותר לצורך פוטוקונוורסיה.
הערה 1: אנו ממליצים לקבוע תחילה את רמת הדיוק שבה האזור שהומר בפועל פוטו-כימית על ידי הלייזר הסורק ב-ROI תואם ל-ROI שנבחר בתוכנה, וזאת על ידי מדידת שטח הרקמה/תאים שהומרו פוטו-כימית בכל שלושת הצירים (בכיווני xy ו-z) בדגימה מקובעת שבה לא צפויה תנועה של תאים או חלבונים. עבור ההגדרות המתוארות ביישום זה, ה-ROI תאם את האזור שהומר פוטו-כימית בדיוק רב, אך הדבר תלוי בעדשה שנעשה בה שימוש ובכמות הלייזר שהופעלה לצורך ההמרה הפוטו-כימית. ניתן לצמצם את גודל ה-ROI לגודלו של תא בודד, בהתאם לממספר האפרטורה (numerical aperture) של העדשה, למקדם הזום ולכמות אור הלייזר שנעשה בה שימוש להמרה הפוטו-כימית.
- בחרו בכלי ה-Bleaching והגדירו את תחילת ההבהרה לאחר סריקה 1 מתוך 2. השתמשנו בלייזר דיודה של 30 mW באורך גל של 405 nm לצורך פוטו-המרה, וביצענו אופטימיזציה קפדנית כדי להגיע לכמות המינימלית של אור לייזר הדרושה להמרה מלאה; דבר זה הושג בעיקר על ידי שינוי עצימות אור הלייזר, מספר סבבי הסריקה של ה-ROI וזמן הפיקסל (כלומר, מהירות הסריקה).
הערה 1: לצורך המרת פוטונים (photoconversion) השתמשנו בעדשת אובייקטיב Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
הערה 2: יש לקבוע את הספק הלייזר ואת מספר החזרות באופן אמפירי עבור כל הגדרה ניסיונית, ולוודא שהם מבטיחים פוטוקונברסיה מלאה מ-PCFP ירוק לאדום בתוך ה-ROI, תוך שימוש בכמות המינימלית הדרושה של אור לייזר כדי להפחית פוטוטוקסיות. אנו ממליצים להתחיל את הבדיקות באמצעות הספק לייזר נמוך (למשל> 3 %, המקביל ל-0.03 mW במישור העדשה) בשילוב עם מספר נמוך של חזרות (למשל> 20), ולאחר מכן להעלות את הספק הלייזר עד להשגת פוטוקונברסיה מלאה, שבניסיונינו הושגה בהספק לייזר של 10% (המקביל ל-0.1 mW במישור העדשה). תחת תנאים אלו, כל העוברים שנבדקו שרדו את תוכנית הטיפול. עם זאת, הבחנו כי קרום החלמון רגיש לפולסי לייזר ועלול להינזק בקלות, דבר הגורם למות העובר. מסיבה זו, פוטוקונברסיה עלולה לגרום לתמותת עוברים אם מיקום רקמת המטרה קרוב לגוף החלמון.
- סרוק את הדגימה ב-z-Stack באמצעות לייזרים של 488 nm ו-561 nm כדי להדמיא את הפלואורסצנציה הירוקה שנותרה ואת הפלואורסצנציה האדומה של ה-PCFP שעברה פוטו-המרה.
הערה 1: עבור הסריקה לאחר הפוטו-המרה, השתמשנו ב-Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
4. הוצאת העובר מהאגרוז
- יש לשפוך את התמיסה ולהוציא בזהירות את העובר מה-1% LMA בעזרת מחט או טיפ פלסטיק חלק.
- יש להחזיק את העובר במי ביצים (egg water) בחושך בטמפרטורה של 28.5 °C עד לשלב ההתפתחות הרצוי.
הערה 1: חשוב שהעוברים ימשיכו להתפתח במי ביצים, במיוחד במהלך הימים הראשונים של ההתפתחות בזמן התארכות גוף העובר. למעשה, רקמות/איברים עובריים מסוימים משנים את מיקומם במהלך ההתפתחות, ולכן דורשים אוריינטציות ספציפיות במהלך ההטמעה, התלויות ברקמה/באיבר הספציפי הנבדקים ובשלב ההתפתחות הרצוי לניתוח.
5. הטמעה מחדש
- המשיכו כפי שמתואר בסעיף 2.) של פרוטוקול זה.
6. מעקב אחר רקמה שעברה פוטו-המרה בשלבים עובריים מאוחרים יותר
- סריקה של אזור העניין (z-Stack) באמצעות לייזרים של 488 nm ו-561 nm עבור אותות פלואורסצנציה ירוקים ואדומים, בהתאמה.
הערה 1: עבור הסריקה x שעות לאחר הפוטו-המרה, השתמשנו בעדשת Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
הערה 2: מאחר שפרוטוקול זה אינו משפיע על ההתפתחות התקינה של העובר, ניתן לצפות בעובר שעבר המרה פוטונית בשלבי התפתחות מאוחרים יותר (לשם כך, יש לפעול לפי ההנחיות בסעיפים 4 - 6).
7. תוצאות מייצגות
דוגמה לבדיקת פוטו-המרה (photoconversion assay) מוצגת ב-איור 1. עקבנו אחר תאי אנדותל במהלך התפתחות דגי zebrafish (לסקירה של האנטומיה הווסקולרית של דג zebrafish מתפתח, ראו16). בהתאם לכך, השתמשנו בקו דג zebrafish Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 המבטא KikGR בתוך גרעיני תאי אנדותל17. עוברים הומוזיגוטים המבטאים את החלבון בעוצמה גבוהה גודלו ב-28.5 °C עד 48 שעות לאחר ההפריה (hpf). לאחר הסרת המעטפת (dechorionation), העוברים הורדמו והוטמעו ב-LMA, כאשר הצד הקדמי-גבי של העובר מופנה כלפי זכוכית המכסה לצורך ויזואליזציה טובה יותר של כלי הדם בראש. השתמשנו במיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך (Zeiss LSM 710 Meta) המצויד בלייזרים הפועלים ב-405 nm, 488 nm ו-561 nm, ובעדשה מסוג Plan Apochromat 20x/NA 0.8 עבור בדיקת הפוטו-המרה ומעקב נוסף אחר החלבון שעבר פוטו-המרה. כפי שמוצג ב-איור 1A, לפני הפוטו-המרה, KikGR בוטה בתוך רקמת אנדותל וניתן היה לזהותו רק כפלואורסצנציה ירוקה באמצעות לייזר Argon של 488 nm. סריקות ביקורת עם לייזר DPSS 561-10 של 561 nm עבור פלואורסצנציה אדומה לא זיהו KikGR שעבר פוטו-המרה לפני תהליך הפוטו-המרה (איור 1A). לאחר מכן, ה-ROI עבר פוטו-המרה מלאה באמצעות לייזר Diode של 405 nm (בעוצמה של 10%, 20 חזרות), וכלי הדם בראש נסרקו שוב באמצעות לייזרים של 488 nm ו-561 nm (איור 1B). כפי שמוצג ב-איור 1B, KikGR ירוק עבר המרה מלאה לאדום בתוך ה-ROI. לאחר בדיקת הפוטו-המרה, העובר הוצא מהאגרוז וגודל ב-28.5 °C במי ביצים. לבסוף, העובר נצפה שוב 24 שעות לאחר הפוטו-המרה, סביב 72 hpf, כדי לעקוב אחר תאי האנדותל שעברו פוטו-המרה בשלבים מאוחרים יותר (איור 1C). לשם כך, העובר הוטמע ב-LMA, והדגימה נסרקה שוב באמצעות לייזרים של 488 nm ו-561 nm. כפי שמוצג ב-איור 1C, בתוך רקמת אנדותל הנובעת מה-ROI שעבר פוטו-המרה, נצפו חלבוני KikGR שעברו פוטו-המרה ושאינם כאלה, וזאת בשל היציבות של KikGR שעבר פוטו-המרה לפלואורסצנציה אדומה וסינתזה מחדש של KikGR ירוק חדש שלא עבר פוטו-המרה.
איור 1. פוטו-המרה של KikGR במהלך התפתחות zebrafish. (A,B) אזור ספציפי של כלי הדם האנדותליאליים בראש עבר פוטו-המרה ב-48 hpf בעוברים טרנסגניים Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 ו-(C) נצפה שוב 24 שעות לאחר הפוטו-המרה (סביב 72 hpf). מוצגים הערוצים של פלואורסצנציית KikGR (ירוק), KikGR שעבר פוטו-המרה (אדום) וערוצים ממוזגים (merged). עיגולים מקווקווים מסמנים את ה-ROI לפני, אחרי ו-24 שעות לאחר הפוטו-המרה. התמונות הן במבט גבי של עובר ה-zebrafish, כאשר החלק הקדמי (anterior) נמצא בתחתית. סרגי קנה מידה: 50 μm.
| חלבון (ראשי תיבות) | עירור (nm) | פליטה (nm) | מקדם כיבוי (EC) | ניצולת קוונטית (QY) | מבנה רבעוני | בהירות | יישום | סימוכין |
| Kaede_G | 508 | 518 | 99 | 0.9 | טטramer | 259 | מעקב אחר תאים | 2,6 |
| Kaede_R | 572 | 580 | 60 | 0.3 | טטramer | 59 | ||
| KikGR_G | 507 | 517 | 54 | 0.7 | טטramer | 112 | מעקב אחר תאים | 3,6,8-10 |
| KikGR_R | 583 | 593 | 35 | 0.6 | טטramer | 68 | ||
| mKikGR_G | 505 | 515 | 49 | 0.7 | מונומר | 101 | מעקב דינמי, דימויי רזולוציה-על | 13 |
| mKikGR_R | 580 | 591 | 28 | 0.6 | מונומר | 53 | ||
| EosFP_G | 506 | 516 | 72 | 0.7 | טטramer | 150 | מעקב אחר תאים | 5,20 |
| EosFP_R | 571 | 581 | 41 | 0.5 | טטramer | 67 | ||
| tdEos_G | 506 | 516 | 34 | 0.7 | דימר טנדמי | 165 | דימויי רזולוציה-על | 12,14,21 |
| tdEos_R | 569 | 581 | 33 | 0.6 | דימר טנדמי | 59 | ||
| mEos2_G | 506 | 519 | 56 | 0.7 | מונומר | 140 | מעקב דינמי, דימויי רזולוציה-על | 11,18 |
| mEos2_R | 573 | 584 | 46 | 0.7 | מונומר | 90 | ||
| Dendra2_G | 490 | 507 | 45 | 0.5 | מונומר | 67 | מעקב דינמי, דימויי רזולוציה-על | 4,11 |
| Dendra2_R | 553 | 573 | 35 | 0.55 | מונומר | 57 |
טבלה I. תכונות של חלבונים פלואורסצנטיים ניתנים להמרה פוטוכימית (photoconvertable). בטבלה מוצגים השם הנפוץ ו/או ראשי התיבות עבור כל PCFP, אורכי גל שיא של עירור (Ex) ופליטה (Em), מקדמי כיבוי מולריים (EC, 10-3 M-1 cm-1), נבחרות קוונטית (QY), מבנה רבעוני רלוונטי פיזיולוגית, בהירות יחסית (כאחוז מ-EGFP), יישום ומקורות. הטבלה עובדה מתוך Day and Davidson, 20101.
| PCFP | Zebrafish transgenic lines | Source |
| Kaede | Tg(elavl3:Kaede)rw0130a | Okamoto Lab |
| Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede) | ||
| Tg(ins:Kaede) | ||
| Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede) | ||
| Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ | ZIRC | |
| Tg(myl7:kaede) | ||
| Tg(olig2:Kaede) | ||
| Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t | ZIRC | |
| Tg(UAS:Kaede)rk8 | ZIRC | |
| Tg(vsx2:Kaede)nns2 | Higashijima Lab | |
| KikGR | Tg(kdrl:nlsKikGR) | |
| Tg(krt4:NTR-KikGR) | ||
| Tg(myl7:nlsKikGR) | ||
| Tg(sox10:KikGR) | ||
| Tg(UAS:KikGR) | ||
| EosFP | Tg(sox10:EosFP) | |
| Tg(sox10:nlsEosFP) | ||
| Dendra | Tg(-8mpx:Dendra2) | |
| Tg(UAS:Dendra-kras) |
טבלה II. קווי Zebrafish טרנסגניים המבטאים PCFP. נתונים שהושגו ממאגר המידע של Zebrafish Model Organism Database (ZFIN, http://zfin.org/). זמינות הקווים ב-Zebrafish International Resource Center (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/) מצוינת בטבלה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בשנים האחרונות פותחו מודלים של בעלי חיים טרנסגניים לביטוי של חלבונים בעלי יכולת המרה פוטו-כימית (photoconvertible proteins) כגון Kaede או KikGR. בעלי חיים אלה מתפתחים באופן תקין, מה שמעיד כי לחלבונים אלו אין השפעות רעילות על ההתפתחות העוברית. הדיווח הראשון על בדיקת המרה פוטו-כימית למעקב אחר תאים בעוברים של בעלי חיים בוצע על ידי Hatta ועמיתיו, באמצעות הזרקת mRNA או DNA המקודדים ל-Kaede לעוברי דגי זהב בשלב התא הבודד לצורך ביטוי רחב (ubiquitous expression), או באמצעות ביטוי של Kaede ו-KikGR ברקמה עצבית באמצעות מערכת Gal4-UA...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לא הצהירו על ניגודי עניינים.
תודות
אנו מודים לד"ר Ian C. Scott על אספקת קו דגי הזברה הטרנסגני Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 בבית החולים לילדים חולים (Hospital for Sick Children) בטורונטו, קנדה. אנו מודים למרכז המיקרוסקופיה הקונפוקלית ודו-פוטונית (Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine) ولد"ר Zoltan Cseresnyes, על סיוע טכני מצוין ותמיכה כללית בדימיון. S.A.-S. נתמכת על ידי מלגת Heisenberg של ה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). עבודה זו נתמכה על ידי מענק DFG מספר SE2016/7-1.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חומרים: | |||
| ציוד נחוץ לגידול דגים ואיסוף ביצים (ראו את ה-Zebrafish Book22 לפרטים). | |||
| סטריאומיקרוסקופ | Leica | Lecia MZ6 Stereomicroscope | מצויד בלייזר הפועל ב-488 nm |
| מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקאלי | Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | מצויד בלייזרים הפועלים ב-488 nm, 561 nm, ו-405 nm |
| בלוק חימום | |||
| זוג פינצטות Dumont #5 | |||
| צלחת תרבית בעלת תחתית של זכוכית כיסוי | MatTek Corp | Ashland MA USA | |
| טיפים לפיפט Microloader | Eppendorf | ||
| ורטקס | |||
| מחטים | |||
| ריאגנטים: | |||
| תווך מי ביצים | |||
| 60 μg/ml מלחים של Instant Ocean ב-ddH2O | |||
| תווך E3 | |||
| 5 mM NaCl | |||
| 0.17 mM KCl | |||
| 0.33 mM CaCl2 | |||
| 0.33 mM MgSO4 | |||
| 0.00001% (w/v) Methylene Blue | |||
| תמיסת מלאי Tricaine בריכוז 4 mg/ml | |||
| 400 mg Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | ||
| 97.9 ml ddH2O | |||
| 2.1 ml 1M Tris (pH9) | |||
| כוון ל-pH 7, חלק לאליקוטות ושמור ב- -20 °C | |||
| 1% LMA (אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה, Lonza) | |||
| 1g LMA/100 ml תווך E3 1X | |||
| חלק לאליקוטות ושמור ב- 4 °C |
מקורות
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).
- Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
- Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR. Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).
- Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development. Genesis. 49, 591-598 (2011).
- Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes. BMC Cell Biol. 11, 15(2010).
- Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944(2008).
- Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility. Traffic. 11, 782-799 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).
- Lazic, S., Scott, I. C. Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish. Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
- Godinho, L. Live imaging of zebrafish development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).
- Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest. Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).
- Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications. Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
