מאמר שיטה

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

DOI:

10.3791/4350

⸱

28 בספטמבר 2012

 ,  , 
1Max Delbrück Center for Molecular Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה למתג פוטו-אקטיבי של חלבונים פלואורסצנטיים הניתנים להמרה (PCFPs) בעובר דג הזברה החי ומעקב נוסף אחר חלבון מומר בנקודות זמן ספציפיות במהלך ההתפתחות. מתודולוגיה זו מאפשרת ניטור של אירועים ביולוגיים בתא העומדים בבסיס תהליכי התפתחות שונים באורגניזם חי של בעלי חוליות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אמבריוגנזה היא תהליך דינמי שנחקר בצורה הטובה ביותר על ידי שימוש בטכניקות המאפשרות תיעוד של שינויים התפתחותיים in vivo. השימוש בחלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית הוכיח אסטרטגיה רבת ערך להבהרת תהליכים מורפוגנטיים דינמיים כפי שהם מתרחשים באורגניזם השלם. במהלך העשור האחרון, הפיתוח של חלבונים פלואורסצנטיים הניתנים לפוטו-אקטיביים וניתנים להמרה פתח את האפשרות לחקור את גורלן של תת-אוכלוסיות בדידות של חלבונים מתויגים1. בניגוד לחלבונים הניתנים להפעלה פוטו-אקטיבית, חלבונים פלואורסצנטיים הניתנים להמרה (PCFPs) ניתנים למעקב והדמיה בקלות במצב הפליטה המקורי שלהם לפני המרת האור, מה שמקל על זיהוי ובחירת אזורים על ידי בדיקה אופטית. PCFPs, כגון Kaede2, KikGR3, Dendra4 ו-EosFP5, ניתנים להסטה מירוק לאדום עם חשיפה לאור UV או כחול עקב רצף טריפפטיד His-Tyr-Gly היוצר כרומופור ירוק שניתן להמיר לאדום על ידי חיסול β מזורז אור והרחבה לאחר מכן של מערכת מצומדתπ 3. PCFPs והגרסאות המונומריות שלהם הם כלים שימושיים למעקב אחר תאים6-10 ולחקר דינמיקת חלבונים11-14, בהתאמה. במהלך השנים האחרונות, PCFPs באו לידי ביטוי במודלים שונים של בעלי חיים, כגון דג זברה6, עוף7,8 ועכבר9,10 למעקב אחר גורל התא. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול להמרת פוטו ספציפית לתא של PCFPs בעובר דג הזברה החי ומעקב נוסף אחר חלבונים שהומרו באור בשלבי התפתחות מאוחרים יותר. מתודולוגיה זו מאפשרת לחקור, באופן ספציפי לרקמה, אירועים ביולוגיים של תאים העומדים בבסיס מורפוגנזה במודל בעלי החיים של דג הזברה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. השגת עוברים לבדיקת ההמרה לאור

עם הכלאה של דג זברה טרנסגני המבטא PCFP, נבחרים העוברים הבהירים ביותר, שהם עוברים הומוזיגוטיים, וגדלים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עד לשלבהעוברי הרצוי 15.

הערה 1: בחירה מוקדמת זו תאפשר סריקת עוברים בעלי עוצמת לייזר נמוכה ובכך תמנע פוטוטוקסיות ופוטו-הלבנה.

הערה 2: אנו מציעים להשתמש באור בעוצמה נמוכה בעת הדמיית עוברים ולשמור אותם בתנאי חושך עקב רגישות גבוהה של PCFPs, כגון Kaede ו-KikGR, לחשיפה לאור כולל אור יום.

2. הטמעה

  1. במיכל זכוכית עם מי ביצה, הפחיתו עוברים תחת סטריאומיקרוסקופ באמצעות מלקחיים.
  2. הרדמת עוברים על ידי העברת עובר מפורק לתמיסת טריקאין של 0.16 מ"ג/מ"ל טריקאין (3-אמינו בנזואית חומצה אתילסטר, סיגמא-אולדריץ') (40 מיקרוליטר של תמיסת מלאי של 4 מ"ג/מ"ל ב-1 מ"ל של E3 בינוני 1X).

הערה 1: העברת עוברים עם פיפטה מזכוכית או קצה חתוך (P1000) כדי למזער את הסיכון לפגיעה בעוברים.

הערה 2: אין לחשוף עוברים צעירים לאוויר או להרים אותם לממשק מים/אוויר, מכיוון שהביצים נקרעות בקלות כאשר הן נתונות ללחץ מכני.

  1. העבירו את העובר המורדם על כיסוי צלחת תרבית ושמרו על העובר בנפח המדיום הקטן ביותר האפשרי.
  2. העבירו את העובר לאגרוז על ידי פיפטינג העובר עם אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה של 1% (LMA, Lonza) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס המכילה 0.16 מ"ג/מ"ל טריקאין, והניחו אותו על זכוכית הכיסוי של צלחת תרבית עם תחתית זכוכית כיסוי (MatTek Corp. Ashland, MA USA). לאחר מכן, כוונו את העובר בעזרת קצה פלסטיק חלק (למשל קצה פיפטה Microloader חתוך, Eppendorf) וכאשר ה-LMA התפלמר, כסו את האגרוז בתמיסת טריקאין של 0.16 מ"ג/מ"ל.

הערה 1: ממיסים 1% LMA ב-60 מעלות צלזיוס ושומרים על אגרוז מומס ב-30 מעלות צלזיוס.

3. המרת תמונות

  1. במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך המצויד במקור לייזר של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו-561 ננומטר, כגון Zeiss LSM 710, דמיין את הדגימה על ידי סריקת z-Stack המכסה את כל מבנה הדגימה להמרה ומעקב מאוחר יותר באמצעות לייזר 488 ננומטר (כלומר, לייזר Ar 30 mW, בעוצמה של 5-7%, גלאי מוגדר ב-493-540 ננומטר) ולייזר 561 ננומטר (כלומר.לייזר DPSS 561 של 10 mW, בעוצמה של 7-9%, גלאי מוגדר ב-587-651) כדי לסרוק את הרקמה/איבר לאיתור הקרינה הירוקה והאדומה של החלבונים הניתנים להמרה לאור, בהתאמה.

הערה 1: עבור הסריקה לפני המרת התמונות, השתמשנו במטרה Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

הערה 2: סרוק תמיד את הקרינה האדומה לפני הניסוי כדי לא לכלול שקיים PCFP אדום שהומר בטעות.

  1. בחר בכלי סדרת זמן והגדר ל-2 מחזורים ללא מרווח (אחד לקדם ואחד לפוסט המרה).
  2. בחר את הכלי Regions והגדר אזור עניין אחד או יותר (ROI) להמרת תמונות.

הערה 1: אנו ממליצים לקבוע תחילה את הדיוק שבו האזור שהומר בפועל על ידי לייזר הסריקה ב-ROI תואם את ההחזר על ההשקעה שנבחר בתוכנה על ידי מדידת שטח הרקמה/תאים שהומרו באור בכל השלושה (כיוון xy ו-z) בדגימה קבועה שבה לא צפויה תנועת תא או חלבון. עבור ההגדרות המתוארות ביישום זה, ה-ROI התאים את אזור ההמרה לאור בדיוק רב, אך הדבר תלוי במטרה המשמשת ובכמות הלייזר המופעלת להמרת צילום. ניתן להקטין את גודל ההחזר על ההשקעה לגודל של תא בודד בהתאם לצמצם המספרי של המטרה, גורם הזום וכמות אור הלייזר המשמשת להמרת צילום.

  1. בחר בכלי ההלבנה והגדר להתחלת הלבנה לאחר סריקה 1 מתוך 2. השתמשנו בלייזר דיודה של 30 mW 405 ננומטר להמרה לאור וביצענו אופטימיזציה קפדנית לכמות המינימלית של אור לייזר הדרושה להמרת אור מלאה המושגת בעיקר על ידי שינוי עוצמת אור הלייזר, איטרציות הסריקה של ה-ROI וזמן הפיקסלים (כלומר, מהירות הסריקה).

הערה 1: לצורך המרת תמונות השתמשנו במטרה Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

הערה 2: יש לקבוע את עוצמת הלייזר ומספר האיטרציות באופן אמפירי עבור כל הגדרת ניסוי ולהבטיח את ההמרה המלאה מ-PCFP ירוק לאדום בתוך ה-ROI עם הכמות המינימלית הדרושה של אור לייזר כדי להפחית את הפוטוטוקסיות. אנו ממליצים ליזום בדיקות באמצעות הספק לייזר נמוך (למשל 3%, המקביל ל-0.03 mW בתוכנית המטרה) בשילוב עם מספר נמוך של איטרציות (למשל 20), ולאחר מכן להגדיל את עוצמת הלייזר עד להשגת המרה פוטו מלאה שבידינו הייתה ב-10% הספק לייזר (המקביל ל-0.1 mW בתוכנית האובייקטיבית). בתנאים אלה, כל העוברים שנבדקו שרדו את תוכנית הטיפול. עם זאת, ראינו כי קרום החלמון רגיש לפולסי לייזר ויכול להינזק בקלות ולגרום למוות של העובר. מסיבה זו, קטלניות עובר לאחר המרה באור עלולה להיגרם אם מיקום רקמת המטרה קרוב לגוף החלמון.

  1. סרוק את הדגימה על ידי z-Stack באמצעות לייזרים עבור 488 ננומטר ו-561 ננומטר כדי לדמיין את כל הירוק שנותר ואת הקרינה האדומה המומרת לאור של ה-PCFP.

הערה 1: עבור הסריקה לאחר המרת תמונות, השתמשנו ב-Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

4. הסר את העובר מאגרוז

  1. השליכו את התמיסה והוציאו בזהירות את העובר מה-LMA 1% בעזרת מחט או קצה פלסטיק חלק.
  2. שמור את העובר במי ביצים בחושך בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עד לשלב ההתפתחותי הרצוי.

הערה 1: חשוב שהעוברים ימשיכו את התפתחותם במי ביצים, במיוחד בימים הראשונים להתפתחות במהלך הארכת הגוף העוברי. ואכן, חלק מהרקמות/איברים העובריים משנים את מיקומם במהלך ההתפתחות ולכן דורשים כיוונים ספציפיים במהלך ההטבעה התלויים ברקמה/איבר הספציפי המעניין ובשלב ההתפתחותי הרצוי של הניתוח.

5. הטבעה מחדש

  1. המשך כמו בנקודה 2.) של פרוטוקול זה.

6. מעקב אחר רקמות מומרים באור בשלבים עובריים מאוחרים יותר

  1. סריקה של אזור העניין (z-Stack) באמצעות לייזרים עבור 488 ננומטר ו-561 ננומטר עבור אותות פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים, בהתאמה.

הערה 1: עבור הסריקה x שעות לאחר המרת התמונות, השתמשנו ב-Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

הערה 2: מכיוון שפרוטוקול זה אינו משפיע על ההתפתחות התקינה של העובר, ניתן לצפות בעובר שעבר המרה בשלבי התפתחות מאוחרים יותר (לשם כך, המשך כמתואר בסעיפים 4-6).

7. תוצאות מייצגות

דוגמה לבדיקת המרה מוצגת באיור 1. עקבנו אחר תאי אנדותל במהלך התפתחות דג הזברה (לסקירה של האנטומיה של כלי הדם של דג הזברה המתפתח ראה16). בהתאם לכך, השתמשנו בקו מדווח Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 המבטא את KikGR בתוך גרעיני אנדותל17. עוברים הומוזיגוטיים ובעלי ביטוי בהיר גודלו בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עד 48 שעות לאחר ההפריה (hpf). לאחר הדכוריוניזציה, העוברים הורדמו והוטמעו ב-LMA הממקם את הצד הקדמי-גבי של העובר לכיוון זכוכית הכיסוי להדמיה טובה יותר של כלי הראש. אנו משתמשים במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך (Zeiss LSM 710 Meta) המצויד בלייזרים הפועלים ב-405 ננומטר, 488 ננומטר ו-561 ננומטר, ומטרת Plan Apochromat 20x/NA 0.8 לבדיקת המרת האור ומעקב נוסף אחר החלבון המומר באור. כפי שמוצג באיור 1A, לפני המרת האור, KikGR התבטא בתוך רקמת האנדותל וניתן היה לזהות אותו רק כפלואורסצנטיות ירוקה באמצעות לייזר ארגון של 488 ננומטר. סריקות בקרה עם לייזר 561 ננומטר DPSS 561-10 עבור פלואורסצנציה אדומה לא זיהו שום KikGR שהומר לאור לפני ההמרה לאור (איור 1A). לאחר מכן, ה-ROI עבר המרה מלאה באמצעות לייזר דיודה של 405 ננומטר (בעוצמה של 10%, 20 איטרציות) וכלי הראש נסרקו שוב באמצעות לייזרים של 488 ננומטר ו-561 ננומטר (איור 1B). כפי שמוצג באיור 1B, KikGR ירוק עבר לחלוטין לאדום בתוך ההחזר על ההשקעה. לאחר בדיקת ההמרה לאור, העובר הוצא מהאגרוז וגדל בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס במי ביצים. לבסוף, העובר נצפה שוב 24 שעות לאחר ההמרה לאור, בסביבות 72 hpf, כדי לעקוב אחר תאי האנדותל שהומרו באור בשלבים מאוחרים יותר (איור 1C). לפיכך, העובר הוטמע ב-LMA, והדגימה נסרקה מחדש באמצעות לייזרים של 488 ננומטר ו-561 ננומטר. כפי שמוצג באיור 1C, בתוך רקמת האנדותל הנובעת מהחזר ה-ROI המומר, נצפו גם חלבוני KikGR שאינם מומרים וגם פוטו-מומרים עקב היציבות של KikGR הפלואורסצנטי האדום והסינתזה מחדש של KikGR ירוק חדש שאינו מומר לאור.

figure-protocol-1
איור 1. המרת צילום של KikGR במהלך התפתחות דג הזברה. (A,B) אזור ספציפי של כלי הדם של ראש האנדותל הומר בפוטו ב-48 hpf בעוברים טרנסגניים Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 ו-(C) נצפה שוב 24 שעות לאחר ההמרה (בסביבות 72 hpf). מוצגת הקרינה של KikGR (ירוק), KikGR שהומר לאור (אדום) וערוצים ממוזגים. עיגולים מנוקדים מראים את ההחזר על ההשקעה לפני, אחרי ו-24 שעות לאחר המרת התמונות. התמונות הן מראות גביים של עובר דג הזברה, קדמית לקרקעית. מוטות קנה מידה: 50 מיקרומטר.

<גבול טבלה="1"> חלבון (ראשי תיבות) אקס (ננומטר) ב (ננומטר) EC QY מבנה רבעוני בהירות יישום אסמכתא Kaede_G 508 518 99 0.9 טטרמר 259 מעקב אחר תאים 2,6 Kaede_R 572 580 60 0.3 טטרמר 59 KikGR_G 507 517 54 0.7 טטרמר 112 מעקב אחר תאים 3,6,8-10 KikGR_R 583 593 35 0.6 טטרמר 68 mKikGR_G 505 515 49 0.7 מונומר 101 מעקב דינמי תמונות ברזולוציה גבוהה 13 mKikGR_R 580 591 28 0.6 מונומר 53 EosFP_G 506 516 72 0.7 טטרמר 150 מעקב אחר תאים 5,20 EosFP_R 571 581 41 0.5 טטרמר 67 tdEos_G 506 516 34 0.7 טנדם דימר 165 תמונות ברזולוציה גבוהה 12,14,21 tdEos_R 569 581 33 0.6 טנדם דימר 59 mEos2_G 506 519 56 0.7 מונומר 140 מעקב דינמי תמונות ברזולוציה גבוהה 11,18 mEos2_R 573 584 46 0.7 מונומר 90 Dendra2_G 490 507 45 0.5 מונומר 67 מעקב דינמי תמונות ברזולוציה גבוהה 4,11 Dendra2_R 553 573 35 0.55 מונומר 57

טבלה I. מאפיינים של חלבונים פלואורסצנטיים הניתנים להמרה לאור. יחד עם השם הנפוץ ו/או ראשי התיבות של כל PCFPs, אורכי הגל של עירור שיא (Ex) ופליטה (Em), מקדמי הכחדה מולרית (EC, 10-3 M-1 cm-1), תשואה קוונטית (QY), מבנה רבעוני רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, בהירות יחסית (כאחוז מ-EGFP), יישום והפניות מוצגים בטבלה. טבלה מעובדת מ-Day and Davidson, 20101.

<גבול טבלה="1"> PCFP קווים טרנסגניים של דג הזברה מקור Kaede Tg(elavl3:Kaede)rw0130a מעבדת אוקמוטו Tg(EPV. TP1-Mmu.Hbb:Kaede)   Tg(ins:Kaede)   Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede)   Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ זירק Tg(myl7:kaede)   Tg(olig2:Kaede)   Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t זירק Tg(UAS:Kaede)rk8 זירק Tg(vsx2:Kaede)nns2 מעבדת היגאשיג'ימה KikGR Tg(kdrl:nlsKikGR)   Tg(krt4:NTR-KikGR)   Tg(myl7:nlsKikGR)   Tg(sox10:KikGR)   Tg(כטב"ם:KikGR)   EosFP Tg(sox10:EosFP)   Tg(sox10:nlsEosFP)   Dendra Tg(-8mpx:Dendra2)   Tg (כטב"ם:Dendra-kras)  

טבלה II. קווים טרנסגניים של דג הזברה המבטאים PCFPs. נתונים שהתקבלו במסד הנתונים של אורגניזם מודל דג הזברה (ZFIN, http://zfin.org/). זמינות הקווים במרכז המשאבים הבינלאומי של דג הזברה (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/) מצוינת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות נוצרו מודלים של בעלי חיים טרנסגניים לביטוי חלבונים הניתנים להמרה כגון Kaede או KikGR. בעלי חיים אלה מתפתחים באופן נורמלי, מה שמצביע על כך שלחלבונים אלה אין השפעות רעילות על התפתחות העובר. הדיווח הראשון על בדיקת המרה למעקב אחר תאים בעוברים של בעלי חיים בוצע על ידי האטה ומשתפי הפעולה על ידי הזרקת mRNA או DNA המקודד Kaede לעוברים של דג זברה חד-תאי לביטוי בכל מקום, או על ידי ביטוי של Kaede ו-KikGR ברקמה עצבית באמצעות מערכת Gal4-UAS6. הם הצליחו לדמיין תנועות תאים ומעקב אחר צורות עצביות, מה שהדגים את ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר איאן סי סקוט על שסיפק באדיבות את קו Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 של דג הזברה בבית החולים לילדים חולים, טורונטו, קנדה. אנו מודים למתקן הליבה של מיקרוסקופיה קונפוקלית ודו-פוטונית (מרכז מקס דלברוק לרפואה מולקולרית) ולד"ר. Zoltan Cseresnyes, לסיוע טכני מעולה ותמיכה כוללת בהדמיה. ס.א.-ס. נתמך על ידי מלגת הייזנברג של ה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). עבודה זו נתמכה על ידי מענק DFG SE2016/7-1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

מדיום מי ביצה

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומרים:
ציוד הכרחי לגידול דגים ואיסוף ביצים (ראה ספר דג הזברה22 לפרטים).
סטריאומיקרוסקופLeicaLecia MZ6 סטריאומיקרוסקופמצויד בלייזר הפועל
במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליZeissZeiss LSM 710 NLOמצויד בלייזרים הפועלים ב-488 ננומטר, 561 ננומטר ו-405 ננומטר
בלוק
זוג מלקחיים
צלחת תרבית עם תחתית זכוכיתMatTek CorpAshland MA ארה"ב
Microloader Pipette TipsEppendorf
Vortex
needles
Reagents:<
60 μ גרם/מ"ל מלחי ים אינסטנט אוקיינוס ב-ddH2O
E3 בינוני
5 מ"מ NaCl
0.17 מ"מ KCl
0.33 מ"מ CaCl2
0.33 mM MgSO4
0.00001% (w/v) מתילן כחול
4 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי טריקאין
400 מ"ג טריקאין (3-אמינו חומצה בנזואיתאתילאסטר)סיגמא-אולדריץ'
97.9 מ"ל ddH2O
2.1 מ"ל 1M Tris (pH9)
יש להתאים ב-pH 7, לאחסן -20 & מעלות; C
1% LMA (טמפרטורת התכה נמוכה אגרוז, לונזה)
1 גרם LMA / 100 מ"ל E3 בינוני 1X
Aliquot ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; ג
488 ננומטר חימוםDumont #5td colspan="4">

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).
  2. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).
  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).
  4. Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
  5. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).
  6. Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).
  7. Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
  8. Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR. Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).
  9. Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).
  10. Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development. Genesis. 49, 591-598 (2011).
  11. Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes. BMC Cell Biol. 11, 15(2010).
  12. Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
  13. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944(2008).
  14. Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility. Traffic. 11, 782-799 (2010).
  15. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  16. Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).
  17. Lazic, S., Scott, I. C. Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish. Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).
  18. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
  19. Godinho, L. Live imaging of zebrafish development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).
  20. Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest. Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).
  21. Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications. Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).
  22. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Confocal MicroscopyPhoto ConversionFluorescent ProteinsTissue Specific ExpressionLow Melting Temperature AgaroseEgg Water MaintenanceEndothelial Cell Tracking

מאמרים קשורים