מאמר שיטה

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה דרוזופילה

DOI:

10.3791/4355

⸱

4 בדצמבר 2012

 ,  , 
1Center for Sleep and Circadian Neurobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבין את קשר בין התגובה החיסונית ובהתנהגות, שאנו מתארים שיטה למדידת התנהגות רצוניים ב דרוזופילה במהלך זיהום חיידקים, כמו גם את היכולת של זבובים לעלות תגובה חיסונית על ידי ניטור הישרדות, עומס בקטריאלי, ופעילות בזמן אמת של רגולטור מפתח של חסינות מולדת, NFκB.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יחסי גומלין מורכבים בין התגובה החיסונית והתנהגות מארח כבר תאר במגוון רחב של מינים. עודף שינה, בפרט, ידועה להתרחש כתגובה לזיהום ביונקים 1 ויש גם לאחרונה תוארה בדרוזופילה melanogaster 2. הדעה מקובלת היא, שהשינה מועילה למארח במהלך זיהום ושזה חשוב לשמירה על מערכת חיסונית חזקה 3,4. עם זאת, ראיות ניסיוניות שתומכות בהשערה זו הן מוגבלת 4, ותפקיד השינה עודפת במהלך תגובה חיסונית עדיין לא ברור. יש לנו להשתמש בגישה רבה תחומית לטיפול בבעיה מורכבת זו, ובצעו מחקרים במערכת הפשוטה הגנטית המודל, פריזבוב דרוזופילה melanogaster. אנו משתמשים בבדיקה סטנדרטית למדידת התנהגות ושינה של תנועה בזבובים, ולהדגים כיצד בדיקה זו משמשת למדידת התנהגות בזבובים infecteד עם זן הפתוגני של חיידקים. בדיקה זו היא גם שימושית עבור ניטור משך ההישרדות בזבובים בודדים במהלך זיהום. צעדים נוספים של תפקוד מערכת חיסון כוללים את היכולת של זבובים כדי לנקות דלקת וההפעלה של NFκB, גורם שעתוק מפתח שהוא מרכזי בתגובה החיסונית המולדת בדרוזופילה. שניהם תוצאת הישרדות ופינוי במהלך זיהום חיידקים ביחד הם אינדיקטורים של התנגדות וסובלנות לזיהום. התנגדות מתייחסת ליכולת של זבובים כדי לנקות זיהום, תוך סובלנות מוגדרת כיכולתו של המארח כדי להגביל את הניזק מזיהום ובכך לשרוד למרות רמות גבוהות של הפתוגן בתוך המערכת 5. ניטור בזמן אמת של פעילות NFκB במהלך הזיהום מספק תובנה מנגנון מולקולרי של הישרדות במהלך זיהום. השימוש בדרוזופילה במבחנים הפשוטים הללו מאפשר הניתוח הגנטי ומולקולרי של שינהואת התגובה החיסונית ואיך שתי מערכות מורכבות אלה מושפעים הדדיים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משתמש בשני מערכים (איור 1) לרכוש 4 קריאות שונות שנאספו מהזבובים החשופים לזיהום חיידקים. פלטים אלה כוללים 1) שינה / התנהגות בעקבות, 2) תוצאות הישרדות; 3) עומס חיידקים בזבוב; ו4) מדידה בזמן אמת של הפעילות העיתונאית NFκB in vivo. בשילוב עם כלים הגנטיים הזמינות בדרוזופילה, מדידות אלה מספקים תובנה מכניסטית לקישור המולקולרי בין תפקוד חיסוני והתנהגות.

1. פעילות מדידה של תנועה ושינה בזבובים

  1. ההתקנה משמשת למדידת פעילות של תנועה ולישון בזבובים, הכולל את מערכת תסיסנית פעילות הניטור (DAM2, Trikinetics), חממות, חדר חשוך, והכנה של חיות ניסוי וצינורות פעילות, שתוארה בעבר 6. אותה הגישה משמשת כאן, עם כמה שינויים קלים.
    1. התאורה של החממה נשלטת על ידי החממה עצם. לכן, חשוב לסנכרון בין מחשב הגדרת הזמן וחממות.
    2. צינורות פעילות מנוקים לשימוש מחדש על ידי הרתחה על פלטה חשמלית במים מיוננים. כמות קטנה של חומר הניקוי הוסיפה לרתיחה הראשונה, צינורות היטב שטפו והרתיחו עוד פעמים. אם חוט משמש לחבר את הצינור, צינורות ששמשו לפעילות (המכיל מזון, שעווה, זבוב וחוט) ניתן לנקות ללא הסרה מוקדמת של החוט.
  2. לפני שיתחילו בניסוי, המכילות תרבויות מקום מאוחר גלמי זבובים מבוימים בחממות לשלושה עד ארבעה ימים להסתגל לתאורה ניסיונית ותנאים סביבתיים אחרים. אור: תנאי חושך או קבוע היה בשימוש נפוץ למדידת התנהגות שינה. בדוגמה זו, זבובים התאקלמו לאור קבוע כדי למנוע ההשפעה של שעון היממה על התגובה וההתנהגות 2,7,8 החיסוניות. כפי שמתואר באיור 1 א ' , עומס 1-4 זבובי יום ישנים לפעילות DAM2 Trikinetics כצגים תאר 6, ושיא למינימום של שלושה ימים שקדמו לזיהום.

2. להדביק זבובים עם זנים פתוגניים של חיידקים

  1. הפרוטוקול המתואר כאן הוא ספציפי לס marcescens, שהם קלים לגידול ולהתמיד. פרוטוקולים לתנאי תרבות אחסון לטווח ארוך ולמיני חיידקים אחרים ישתנו. ס marcescens מאוחסנים בגליצרול 15-50% ב-80 ° C. כדי להתכונן לאחסון לטווח ארוך, לערבב 2 כרכים של תרבות חיידקי הלילה (OD 600 = 0.5-1.0) לנפח 1 של גליצרול 50% autoclaved ב1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל. זה יגרום לריכוז גליצרול סופי של 17%. אחסנו בצינורות -80 ° C. כדי להתכונן לטווח קצר בשימוש מקור לחיידקים, לגרד את המנייה קפואה עם קצה פיפטה סטרילי 200 μl ולבצע רצף משולש בצלחת אגר LB. דגירת צלחת הלילה ב 37 & dלדוגמה: C כדי לקבל מושבות מבודדות. אחסן את הצלחת ב 4 ° C.
    יום אחד לפני הזיהום שנקבע, לאסוף מושבה אחת מהצלחת אגרה LB עם טיפ סטרילי 200 μl פיפטה ולהטביע את הקצה לתוך צינור תרבות המכיל מדיום LB מ"ל 5. חיידקים לגדול בין הלילה, או עד 16 שעות בתוך אינקובטור שייקר על 37 מעלות צלזיוס ו 250 סל"ד עד שהוא מגיע שלב הצמיחה מעריכית. למדוד את הריכוז בספקטרופוטומטר בOD 600. הריכוז בשלב זה נע בין 0.5-1. אם הריכוז גבוה מדי, תת תרבות החיידקים ולגדול לכמה שעות נוספות כדי לקבל ריכוז אופטימלי. בצע את ההליך בקרבת מקור אש. חלק מזני חיידקים מהונדסים לעמידות לאנטיביוטיקה וגדלים ונבחרו לאנטיביוטיקה מתאימה הוסיף למדיום. ס marcescens (ATCC # 8100) אינו עמיד לאנטיביוטיקה ולכן גדל במדיום סטרילי ללא אנטיביוטיקה. כדי לוודא טכניקה סטרילית, לעשות cultu מדומהמחדש ללא חיידקים כשליטה.
    הפתרון להדביק זבובים מכיל חיידקים (בדילול לOD 600 = 0.1) וצבעי מאכל% 1 (Brilliant Blue FCF) ב PBS. הכן את פתרון לבקרת הזרקה על ידי הוספת כמות שווה של מדיום LB בשימוש בפתרון דלקת וצבע מאכל כחול 1% בPBS. אחסן פתרונות על קרח.
  2. הכן את מחטי זכוכית להזרקה את הזבובים. משוך זכוכית נימים (OD = 1 מ"מ, id = 0.58 מ"מ, WPI) לקצה עדין באמצעות micropipette חולץ (Narishige). תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במלקחיים עדינים לשבור את קצה המחט כך שהפתיחה היא גדולה מספיק כדי להתמלא בנוזל הזרקה באמצעות החלת שאיבה עם מזרק, אך קטנה מספיק כדי למזער את הניזק לזבוב במהלך תהליך ההזרקה. אחרי ששבר את הקצה, את גודל הטיפ צריך להיות בסביבות 40-50 מיקרומטר. מחט הזכוכית מחוברת למזרק פלסטיק 3 סמ"ק עם אורך של צינור. הזרימה בינונית הזרקה נשלטת באופן ידני תוך הפעלת לחץ חיובי או שלuction עם המזרק. למנוע זיהום צינור הגומי עם נוזל בהזרקה, כמנגנון המזרק משמש גם דלקת וזריקות בקרה.
  3. הרדם זבובים על ידי לשים אותם על משטח CO 2. CO 2 עובר דרך מכל אטום של מים כדי ללחלח את הפנקס וכדי להפחית חשמל סטטי, שיכול לסבך מניפולציה של זבובים על הכרית. הזרק זבובים על ידי החדרת מחט הזכוכית אל האזור מעל scutellum של בית החזה הגבה. פטירתו של מדיום הזרקה אל תוך החנות מאומתת על ידי צבע המאכל - זבובים הופכים כחולים כצבע המאכל מתפשט באמצעות המערכת. המינון של חיידקים שזבובים יקבלו ניתן לכמת כמתואר בסעיף 3 להלן. החלק מהעיצובים ניסיוניים כוללים קבוצת ביקורת שמקבלת פציעה האספטי ידי הזרקת זבובים עם צביעת PBS ומזון אך ללא חיידקים.

3. לקבוע את העומס בקטריאלי

גישה אחת לevaluatinגרם לתגובה החיסונית נגד זיהום חיידקים היא לקבוע את הזיהום שלאחר עומס החיידקים. ד melanogaster הוא מודל מצוין כדי לקבוע פרמטר זה, מאחר שניתן homogenized כל הזבוב להעריך את מספרי החיידקים כלל בתוך פרט. הרציונל מאחורי פרוטוקול זה הוא שכאשר גדל על מדיום מוצק כמו מרק וריא (LB) אגר בצלחת פטרי (צלחת LB), חיידק בודד יוצר מושבה להבחין גלויה. לכן, על ידי מאחד זבובים נגועים בנוזל LB, שהניב דילולים סידוריים של homogenate, ומתפשט homogenate המדולל על צלחות LB, מספר התאים חיידקיים מדביק זבוב ניתן לקבוע. קבוצת ביקורת של זבובים הוזרקו צביעת PBS ומזון אך ללא חיידקים יש להשתמש כדי לוודא שהזיהום לא היה מזוהם במיני חיידקים אחרים. לא אמור להיות מושבות על הצלחת אגרה LB במצב זה.

  1. כל חומרי חיטוי שישמשו לכךהליך לפני ביצוע צעד homogenization בפועל. זה כולל 200 טיפי פיפטה μl לגזור במספריים, מדיה LB, ועליים משמשים לתפעול. הכן את הצלחות על ידי שפיכה בינונית autoclaved LB / אגר ל10 סנטימטרי צלחות פטרי סטרילית לפחות היום 1 לפני מאחד זבובים.
  2. הרדם ולאסוף זבובים ב1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל וצינורות חנות על קרח.
  3. לבצע הומוגניזציה ליד להבה על מנת למנוע זיהום. הומוגניזציה שליטה המכילה זבובים ללא זיהום מומלצת במיוחד בעת שימוש זן חיידקים כגון ס marcescens, שאינם עמידים לאנטיביוטיקה. הומוגני מינימום של 2 קבוצות של 10 זבובים בכל תנאי ניסוי לכל. מספר הזבובים המשמשים לhomogenate נקבע על ידי הנסיין. חלק מהקבוצות השתמשו בזבוב אחד לhomogenate, שהיא שימושית להערכת וריאציה בעומס חיידקים בין זבובים בודדים 8, בעוד שאחרים השתמשו 3-10 זבובים לhomogenateכדי להשוות בין הגנוטיפ או תנאי ניסוי 9-12.
    1. הוסף מדיום LB 400 μl לכל צינור המכיל microcentrifuge זבובים והומוגני באמצעות מנוע קטן ועלי (Kontes).
    2. באמצעות טיפי פיפטה לחתוך מעוקרים, סידורי לדלל 1:10 homogenate ידי הוספת LB / בינוני הומוגני μl 20 חיידקים לצינור microcentrifuge μl 1.5 המכיל מדיום LB 180 μl. חיתוך טיפי פיפטה מונע חסימה מפסולת זבוב ומבטיח כי נפח מתאים מועבר.
    3. גורם דילול נקבע באופן אמפירי ותלוי בגנוטיפ של הזבוב, זן החיידקים בשימוש, ותנאי ניסוי. לסוג פראי זבובים נגועים בס marcescens, השתמש דילולים של 1:10 2 או 3 01:10 לזבובי מעוורים מייד לאחר פגיעה, ודילולים של 1:10 4 או 5 01:10 לזבובים homogenized 24 שעות לאחר פגיעה.
    4. הוסף LB 100 μl / בינוני חיידקים מהמיקרופוןצינורות rocentrifuge המכילים דילול הסופי ולהפיץ את המדיום בצלחת LB באמצעות כדורי זכוכית (VWR) כדי להבטיח חלוקה שווה.
    5. השלך את כדורי הזכוכית לתוך 100% פתרון EtOH. מקם את צלחות LB ב37 מעלות צלזיוס חממה בן לילה.
    6. כצעד אופציונלי, השתמש במערכת הדמיה חזותי עם אור כדי להשיג תמונה של צלחות ליברות (FluorChem 8900; אלפא Innotech). לספור את המספרים של שני מושבות על הצלחת עצמו או מהתמונה של צלחת שימוש בכלי סומך על פוטושופ תוכנה (Adobe Photoshop CS3).
    7. לחשב את מספר המושבה להרכיב יחידות ללטוס באמצעות נוסחה: [n / (N * D * V)] * V; כאשר n = מספר מושבות גדלו על צלחת LB; N = מספר הזבובים נקווה ב1 צינור microcentrifuge: D = גורם דילול; וv = נפח של פתרון להתפשט על כל צלחת; V = נפח ראשוני של homogenate.

4. הערך שינה ומשך הישרדות לאחר זיהום

  1. עבורזבובים שלא נקטפו למדידת עומס חיידקים, להמשיך ולעקוב אחר התנהגות של 7-10 ימים נוספים. משך הישרדות מושפע גנוטיפ של תנאי הטיסה, הסביבתיים, ומיני חיידקים המשמשים לזיהום.
  2. לאחר ~ 10 ימים, לסיים את הניסוי, להוריד ולעבד את נתוני התנהגות כפי שתוארו בעבר 6. תוכנת Insomniac2 המותאמת אישית, המבוססת בMatlab, משמשת לניתוח פרמטרי שינה. זה חשוב כדי למנוע זבובים מתים מהניתוח התנהגותי. בדרך כלל, זה מגביל את הניתוח עד למרחק של היום הראשון לאחר הדבקה, תלוי בסוג של זיהום וגנוטיפ לטוס. המוות בassay מסומן על ידי הזמן כל סעיפי הפעילות שהגיעו לאפס. כדי להקל על ניתוח של הישרדות, Drosonex, תוכנה מותאמת אישית שנכתבה ב-Microsoft Visual C + + 6.0, משמש לעיבוד קבצי נתונים גולמיים ממערכת DAM Trikinetics. דיווחי התוכנה כקבצי Excel, משך הישרדותו של כל זבוב (בשעות), הידור הפעילות datמכל המסכים לגיליון אלקטרוני אחת, ומדווח על אחוזי הזבובים ששרדו לאורך הזמן כפי שנקבע על ידי המשתמש. את קבצי Excel נועדו להשתלב בחבילות תוכנה סטטיסטיות אחרות לניתוח נוסף.

5. מדידת פעילות NFκB במהלך זיהום השימוש Assay כתב לוציפראז

המהונדס κB לוק זבובים השתמש בassay זה נוצר בעבר כמתואר בקואו et al., 2010 2. בקצרה, כתב κB לוק מכיל 8 חזרות של רצף מחייב NFκB שהוכנסו לאמרגן במעלה זרם של מסגרת קריאה פתוחה לוציפראז.

  1. התאם זבובים לתנאי תאורה ניסיוניים כמפורטים בסעיף 1.2. בדוגמה זו, 1-4 זבובים ישנים היום κB לוק הם שוכנו בבקבוקונים המכילים סוכרוז 5%, 2% מצע אגר מזון והניח באור קבוע (LL) עבור 2 ימים כדי להגיע לאותו גיל כמו זבובים אחרים במהלך זיהום.
  2. הכן microplate 96 היטב לזבובים. כל באר מכיל 2 שכבות של מזון בינוני (איור 2); השכבה העליונה מכילה luciferin, המצע של לוציפראז. הוסף 300 μl של סוכרוז 5%, 2% לכל פתרון אגר היטב ולאפשר לביסוס. לאחר מכן, להוסיף שכבה עליונה 50 μl לכל סוכרוז גם מכיל 5%, 1% אגר, והמ"מ luciferin 2 (הזהב ביוטכנולוגיה, Inc). ריכוזי luciferin משמשים לפעילות כתב מדידה בדרוזופילה ומגוונים בספרות, ולא היו נמוך כמו 100 מיקרומטר 13. הריכוז הנדרשים ניתן לקבוע באופן אמפירי. בין מהחלק את שכבות מזון, לכסות את הצלחת עם בד רשת דקה כדי להקל על הייבוש, תוך שמירה על סטריליות. הצלחת צריכה להיות מותרת להתייבש היטב, עד לשעה אחת, כדי למנוע מזבובים להיתקע בטיפי עיבוי. בגלל luciferin הוא רגיש לאור, להימנע מלחשוף את הצלחות להדליק יותר מנחוץ.
  3. החל סרט דבק שקוף (למעלהחותם-; פרקין אלמר) לצלחת 96-microwell היטב ולנקב באמצעות מחט עדינה בכמות של 2 חורים לטובים. חורים אלה לא רק לאפשר חילופי אוויר לכל אחד, אבל גם יספקו את הדרך להרדים זבובים על בסיס פרטני. באמצעות סכין חד וקצה ישר, להציג חתך בין כל עמודה. זה יספק דרך קלה לטעון / לפרוק זבובים בקבוצות של 8 בכל פעם.
    כדי לטעון זבובים לתוך צלחת microwell, הסר את הצלוחיות מזבובים להרדים חממה ועל משטח CO 2. עומס זבובים אחד על אחד לכל עמודה אחר עמודה היטב. צריך לטוס בטעות נתקע לחותם הדבק, השאר את הזבוב לבד כפי שהם לעתים קרובות מסוגלים לשחרר את עצמם ללא התערבות. להחזיר את צלחת microwell לחממה בLL עבור 8-24 שעות כדי להסתגל לסביבה החדשה ולצרוך את מצע luciferin.
  4. חיידקי תרבות, S. marcescens, ולהכין פתרון לזיהום כפי שתואר לעיל.
  5. לא לטשטשהוא טס באמצעות טיפ micropipette המצורף לקו 2 CO בלחץ נמוך. הנח את קצה micropipette ישירות מעל פתחי האוורור שנעשו לכל באר. קח זהירות כדי להבטיח שלחץ CO 2 הוא גבוה מספיק כדי לטשטש את הזבוב, אך נמוך מספיק כדי למנוע פגיעה בזבוב. בקבוצה של שמונה, באופן אישי להעביר כל זבוב ל2 משטח CO, ולהדביק כמתואר לעיל. לאחר הדבקה, תחזור בכל הזבוב למקורי וגם reseal microplate.
  6. הארת מידה (הארת TopCount-NXT ומונה נצנץ; פרקין אלמר-). דלפק ההארה TopCount מכיל קלטת לערום לצלחות, מה שמאפשר לקריאה מתוכנתת ואוטומטית רציפים במרווחים רצויים לכל אורך הזמן (בדרך כלל עד חמישה ימים). תכונה זו אינה זמינה בכל המכשירים, ואיסוף נתונים לניסויים שבוצעו עם מכשירים אחרים ולכן עשוי להיות פחות תכוף. דלפק ההארה שוכן בroאום עם טמפרטורה מבוקרת ולוח זמנים של תאורה. בעת טעינת צלחות לקלטת לערום, לערום את הצלחות המכילות את הזבובים בין צלחות ריקות ברורות כדי להבטיח שזבובים יקבלו אור. תכנית luminometer לפי מפרט היצרן לאסוף קריאה בכל שעה למינימום של 24 שעות. בדוגמה זו, הגלאים מתוכנתים לקרוא כל טוב עבור 10 שניות ולבטא את התוצאה כספירות (יחידות שרירותיות) לשנייה. ערך זה בממוצע על פני 3 קריאות לטובות. לייצא את קבצי נתונים לגיליון אלקטרוני ולבצע ניתוח סטנדרטי, גרפים את התוצאות של הארה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. זיהום מקדם שינה. בדוגמה זו, קנטון-S (CS) זבובי בר וזבובי סוג מוטציה חסרת גן NFκB, ממרח (REL E20) 14, הוטענו לשני צגי DAM2 פעילות (n = 32 לכל גנוטיפ) ונדבק כמתוארים לעיל. זבובים הוחזקו באור קבוע כדי למנוע ההשפעה של השעון הביולוגי על התנהגות וזיהום 2,7,8. מוטציות E20 REL היו isogenized לCS כפי שתוארו לעיל 11. שתי הקבוצות של זבובים היו נגועות בס marcescens ותוצאותיו מתוארים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את גישתו לחקור כיצד התנהגות, במיוחד לישון, קשורה לפרמטרי תגובה חיסוניות. פרמטרים אלה כוללים עומס חיידקים, תוצאות הישרדות, ופעילות NFκB כפי שנמדד על ידי עיתונאי לוציפראז in vivo. יחד פרמטרים אלה מספקים מידע על אופן שגם זבוב יכול להילחם בזיהום. עומס חיידקים ותוצאה הם הישרדות פרמטרי תגובה חיסוניים הכרוכים במדידה פשוטה בדרוזופילה. REL E20 מוטציות, אשר חסרה פקטור NFκB שעתוק שהוא מרכזי בתגובה החיסונית, נכנע במהירות לזיהום חיידקים. מניפולציות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומי למדע במסגרת מענק # IOS-1025627 ועל ידי המכון הלאומי לבריאות במסגרת המענק # 1R21NS078582-01 ללסת

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם חומר חברה מספר קטלוגים תגובות
ציוד
חממות פרסיבל מדעי, Inc I30BLLC8
I36VLC8 		החממה מסוגל כל אחד פועל אור מתוכן / לוחות זמנים בטמפרטורה מתאימה.
תסיסנית Activitiy מוניטורים Trikinetics Inc, Waltham, MA DAM2 כפי שתואר במקום אחר 6, מערכת זו דורשת ממשק מחשב, תוכנות ואבזרים אחרים.
פיירקס זכוכית צינורות Trikinetics Inc, Waltham, MA PGT-5x65
נצנץ microplate ודלפק הארה פרקין אלמר TopCount NXT
12 גלאים 		כל קורא מסוגל לאתר הארת microplate ניתן להשתמש עבור סוג זה של בדיקת כתב. TopCount מכיל גלאים מרובים ומערה אוטומטי; הוא מסוגל להיות מתוכן לקריאה רציפה מצלחות מרובות.
FluorChem 8900 אלפא Innotech ההדמיה של תרבויות חיידקים היא אופציונלית; כל מערכת הדמיה דיגיטלית עם אור יכולת החזותית היא מספיק.
Micropipette פולר Tritech Research, Inc Narishige PC-10
ספקים
ורוסיליקט זכוכית נימים Precision Instrument בע"מ העולם 1B100F-4
3 מזרק מ"ל הפישר סיינטיפיק BD 305482
מחטי מזרקים הפישר סיינטיפיק BD 305196 18 G - לחתוך את הקצה של המחט כדי למנוע ניזק לצינור.
אבובי סיליקון, איד (0.030 ") (0.065 OD") עובי דופן (0.018 ") VWR 60985-706 משמש לחיבור מחטי זכוכית נימים למזרק
ברזלי 3 דרך חברת Pharmaseal אמריקנית K75
Kontes גלולת עלי מוטור אלחוטי הפישר סיינטיפיק K749540-0000
Kontes גלולת עלי הפישר סיינטיפיק K749521-1590
כדורי זכוכית 3mm VWR 26396-630
Microplate 1 מטוס קטנטן + Thermo Scientific 7571 Select 96-גם צלחות המתאימים להארה - הם חייבים להיות אטומים.
TopSeal-A microplates :96-כן PerkinElmer 6005185 Microplate עיתונות-על סרט איטום דבק
D-luciferin, מלח אשלגן זהב ביוטכנולוגיה, Inc LUCNA
תוכנה
Insomniac2 זמין לפי בקשה לכותבים מנהג; נכתב על ידי לסלי תשמור, דוקטורט (ווסטמינסטר מכללה) תוכנה מבוססת Matlab שנעשה שימוש שגרתי בניתוח של שינה 2,6,11
Drosonex זמין לפי בקשה לכותבים מנהג; נכתב על ידי תומאס Coradetti (תוכנת מדרכה) MSVC6 תכנית מחשב המשמשת לניתוח הישרדות מקבצי נתוני גלם שנאספה עםTrikinetics מערכת
Photoshop CS3 לבנת טיט שימושי לקבלת מספרים / צלחת CFU מתמונות דיגיטליות (אופציונלי)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
  2. Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
  3. Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. Parasite resistance and the adaptive significance of sleep. BMC Evol Biol. 9, 7(2009).
  4. Imeri, L., Opp, M. R. How (and why) the immune system makes us sleep. Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).
  5. Ayres, J. S., Schneider, D. S. A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections. PLoS Biol. 6, e305(2008).
  6. Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. (43), e2157(2010).
  7. Lee, J. E., Edery, I. Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections. Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).
  8. Stone, E. F., et al. The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila. PLoS Pathog. 8, e1002445(2012).
  9. Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster. Genetics. 183, 1477-1491 (2009).
  10. Short, S. M., Lazzaro, B. P. Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).
  11. Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish. Sleep. 30, 389-400 (2007).
  12. Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. Functional analysis of the Drosophila immune response during aging. Aging Cell. 7, 225-236 (2008).
  13. Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK. Science. 293, 2251-2256 (2001).
  14. Hedengren, M., et al. Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila. Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).
  15. Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).
  16. Wu, L. P., Choe, K. -M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159, 189-199 (2001).
  17. Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum. Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).
  18. Romeo, Y., Lemaitre, B. Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways. Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).
  19. Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase. Genes Dev. 15, 104-110 (2001).
  20. Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).
  21. Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep, aging, and lifespan in Drosophila. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
  22. Allee, W. C. The social life of animals. , W.W. Norton & Company, Inc. (1938).
  23. Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila. Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).
  24. Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Signal analysis of behavioral and molecular cycles. BMC Neurosci. 3, 1(2002).
  25. Ayres, J. S., Schneider, D. S. The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000150(2009).
  26. Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila. Science. 278, 1632-1635 (1997).
  27. Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27, 628-639 (2004).
  28. Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
  29. Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice. J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).
  30. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
  31. Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31, 465-472 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Drosophila Immune ResponseSleep MeasurementBacterial ClearanceNF Kappa B ActivityLocomotor Activity MonitoringSurvival AssayColony Forming UnitsLucifer Reporter TechniqueConstant Light ConditionsFly Infection Protocol

מאמרים קשורים