הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יעילות גבוהה Transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם siRNA שימוש במערכי microelectrode (MEA)

12.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4415

⸱

13 בספטמבר 2012

 , 
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University

במאמר זה

סיכום

את פרטי מאמר פרוטוקול transfection ספציפי לאתר של מקושקש רצף של siRNA בתרבית תאי יונקים חסידה באמצעות מערך microelectrode (MEA).

תקציר

הגילוי של מסלול RNAi באאוקריוטים והפיתוח הבא של סוכני RNAi, כגון siRNA וshRNA, השיג שיטה רבה עצמה להשתקת גנים מסוימים 1-8 לגנומיקה ותרופות תפקודיות. אתגר גדול המעורבים במחקרים מבוססים RNAi הוא המסירה של סוכני RNAi לתאים ממוקדים. טכניקות מסורתיות שאינן נגיפיות משלוח, כגון electroporation בתפזורת ושיטות transfection כימיים לעתים קרובות חוסר השליטה במרחב הנחוצה על משלוח ולהרשות יעילות transfection עניה 9-12. התקדמות בשיטות transfection כימיות כגון שומני קטיוני, פולימרי קטיוני חלקיקים הביאה ליעילות transfection משופרת מאוד 13. עם זאת, שיטות אלו עדיין לא הצליחו להציע שליטה מרחבית מדויקת במסירה שמאוד יכולים להועיל מיניאטורי טכנולוגיות תפוקה גבוהה, מחקרי תא בודדים וחקירות של אינטראקציות תא סלולרי. nt "> ההתקדמות טכנולוגית האחרונה במסירת הגן אפשר transfection תפוקה גבוהה של תאי חסיד 14-23, רובם משתמשים electroporation microscale. electroporation microscale מציע שליטה זמנית spatio מדויקת במסירה (עד תאים בודדים) והוכח כדי להשיג יעילות גבוהה, 19 24-26. בנוסף, גישות מבוססות electroporation אינן דורשות תקופה ממושכת של דגירה (בדרך כלל 4 שעות) עם קומפלקסי siRNA וה-DNA לפי צורך בשיטות transfection מבוססות כימיות ולגרום לכניסה ישירה של siRNA וDNA עירום מולקולות לתוך הציטופלסמה התא. כביטוי גני תוצאה יכולות להיות מושגת כבר בשש שעות לאחר transfection 27. המעבדה שלנו הוכיחה את השימוש במערכי microelectrode (MEA) עבור transfection אתר ספציפי בתרביות של תאי יונקי חסיד 17-19 בעבר. בגישה המבוססת MEA, מסירת המטען גנטי מושגת באמצעות electroporati המקומי מייקרו בקנה מידהבתאים. יישום של פולס חשמלי לאלקטרודות נבחרת יוצר שדה חשמלי מקומי שמוביל לelectroporation נוכחיים בתאים באזור של אלקטרודות מגורה. השליטה העצמאית של אלקטרודות מייקרו מספקת שליטת מרחב ובזמן על transfection וגם מאפשרת ניסויים מבוססים transfection מרובים להתבצע על אותה תרבות הגדלת התפוקה וההפחתה הניסיונית השתנות תרבות לתרבות.

כאן אנו מתארים התקנה הניסיונית ופרוטוקול transfection הממוקד של תאי הלה חסיד עם siRNA מתויג fluorescently מקושקש רצף באמצעות electroporation. אותו פרוטוקול יכול לשמש גם עבור transfection של וקטורי פלסמיד. בנוסף, הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להרחיב בקלות למגוון רחב של שורות תאי יונקים עם שינויים קלים. זמינות מסחרית של MEAs עם דפוסים אלקטרודה מראש מוגדרים והן מותאמים אישית להפוך לא נגיש טכניקה זומעבדות o רוב המחקר עם ציוד תרבית תאים בסיסי.

פרוטוקול

1. MEA הכנה

  1. MEAs לשימוש בניסויי electroporation או יכול להיות מפוברק באמצעות טכניקת photolithography סטנדרטית כפי שתואר לעיל 18 או לרכוש ישירות מספקים של יצרני MEA כגון מערכות מרובות ערוצים (http:/www.multichannelsystems.com/) ואלפא MED מדעי, Inc ( http://www.MED64.com). את MEAs משמש בניסויים שלנו היו מפוברק בתוך הבית במתקן החדר הנקי באוניברסיטת אריזונה, המנוהלת על ידי המרכז למחקר האלקטרוניקה של מצב מוצק (CSSER). את MEAs משמש בניסויים שלנו היה 32 אלקטרודות תחמוצת אינדיום בדיל ב8 על ידי 4 מערך עם גדלי קוטר אלקטרודה 50-200 מיקרומטר בתוך זכוכית 1 סנטימטר קוטר פנימית טובה. הזכוכית גם הייתה קשורה בMEA באמצעות polydimethylsiloxane (PDMS).
  2. לעקר MEA בחיטוי לפני התא שלeeding. שיטות אחרות של עיקור כגון השריה באתנול 70%, טיפול בקרינת UV וטיפול במים חם כמתואר במקום אחר יכולים לשמש גם כזמן הם לא מתפשרים על היושרה של MEA.
  3. העברת MEA autoclaved למכסה מנוע זרימה למינרית ומניח אותו בצלחת פטרי סטנדרטית סטרילי קלקר. לפני זריעת תאים בMEA, לעקר את מכסה מנוע הזרימה למינרית ידי הפעלת אור UV במשך 20 דקות. אם MEA הוא רגיש לאור UV לכסות את צלחת פטרי המכילה MEA ברדיד האלומיניום סטרילי תוך מכסה מנוע הזרימה הוא תחת תאורת UV.

2. תאי זריעה על MEA

  1. תאי אסיף משורת תאי הפעלה של תאי יונקי חסיד באמצעות טריפסין / EDTA ולהעלות אותם לריכוז של 100-200 תאים / μl ב1 תקשורת סלולרית מ"ל לציפוי. בניסויים שלנו היינו מוצלח בקו culturing NIH 3T3 fibroblasts תא, שורת תאי הלה ונוירונים בקליפת מוח וההיפוקמפוס עיקריים על MEA.
  2. הנח טיפת 20-30 μl של תקשורת עם תאים בMEA. להעביר את צלחת פטרי עם MEA לחממה. חשוב לוודא שגודל טיפת התא הוא גדול מספיק כדי לכסות את כל אלקטרודות על MEA.
  3. 2 שעות לאחר זריעת התאים להעביר את צלחת פטרי עם MEA מהחממה למכסה מנוע זרימה למינרית ועדינות להוסיף μl 400-500 של תקשורת חממה מראש (37 ° C) לMEA היטב. בדקו מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שתאים עדיין מחוברים ובאופן שווה על משטח MEA. להעביר בחזרה MEA לחממה. תקופת ההמתנה 2 שעות לפני התוספת של תקשורת מבטיחה מספיק זמן לתאים לדבוק עם משטח MEA. בנוסף לתקשורת סלולרית מוקדם מדי לאחר זריעת התאים יכול לשטוף את התאים. אם תאים אינם דבקים גם בMEA, פני השטח שלו יכולים להיות מטופלים עם גורמי התקשרות סלולרית aspolylysine כזה, פיברונקטין, וlaminin כדי לשפר את הידבקות תא. בניסויי תא הלה אנו בדרך כלל טיפול במשטח MEA עם fibronectin (10 מיקרוגרם / מ"ל) עבור 1-2 שעות.
  4. 8-12 שעות לאחר זריעת התאים, לבצע 1-2 שטיפות עם PBS כדי להסיר את כל תאים מתים. מדיום סלולרי יכול להחליף כל 24-48 שעות לפי צורך. בניסוי טיפוסי, התאים הם בדרך כלל מוכנים ל24-48 שעות לאחר transfection זריעה. כדי לשמור על עקביות ביעילות electroporation מומלץ להמתין עד שהתרבות היא לפחות 80% confluent לפני electroporation.

3. Transfection אתר ספציפי של siRNA

  1. להכין תמיסת חומצת גרעין. לtransfection siRNA, להכין פתרון electroporation siRNA מיקרומטר 1-2 במאגר electroporation קרח קר כדי להשיג נפח סופי של 200-400 μl. במאמר זה אנו מדגימים וידאו transfection של תאי הלה עם מקושקש רצף מצומדת Alexa 488 של siRNA.
  2. העברת MEA עם תאים מן החממה למכסה מנוע זרימה למינרית סטרילי. הסר את התקשורת הסלולרית מMEA ולבצע שטיפה עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 200-400 μl שליפתרון ספירה קרה 1 מיקרומטר siRNA electroporation לטוב.
  3. החל פולסים חשמליים רבועים anodic את האלקטרודות הממוקדת (עיין בשלב 4 לקביעת פרמטרים אופטימליים של פולס החשמלי). בניסויים שלנו השתמשנו במכשירים פרגמטיים מחולל צורת הגל 2414A ליצור פולסים חשמליים ו- חבילה כפולה מוטבעת (מח"ש) 16 קליפ סיכה ליצור קשר עם מגיני אג"ח MEA. מחולל צורת הגל יכול להיות מחובר לקליפ מח"ש באמצעות לוח מעגל מודפס demultiplexor לספק הסלקטיביות של אלקטרודות הבודדה. לאלקטרודה ההשוואתית, הנח קתודת פלדה בתקשורת הסלולרית. תוך הפחתת אלקטרודה השוואתי פלדה בתקשורת זה מאוד חשוב כדי לוודא שהוא לא עושה את המגע עם פני שטח MEA. עם הקשר, זה יכול לגרום לניזק לתאים ומאה. מומלץ להוריד את האלקטרודה ההתייחסות למיקום של 1 מ"מ מעל לתאים. Spacer עם גובה של 1 מ"מ ניתן להציב גם לסייע בהשמה של השופטהאלקטרודה העדפות. גישה חלופית לשימוש באלקטרודה הפניה חיצונית היא להשתמש באלקטרודות שכנות כמו זוגות קתודה-האנודה.
  4. מייד לאחר החלה בפולסים החשמליים לאלקטרודות הממוקדת על MEA, להעביר בחזרה MEA לחממה. לאחר תקופת דגירה של 5 דקות, בעדינות להחליף 75% ממאגר electroporation עם (37 ° C) תקשורת סלולרית מראש טריה. מאוחר יותר, ניאון הדמיה ניתן לעשות כדי לאשר את המשלוח של siRNA מתויג fluorescently לתאים.

4. אופטימיזציה של פרמטרי electroporation

  1. כדי לקבוע את הפרמטרים החשמליים דופק האופטימליים לelectroporation, ניסויי electroporation עיצוב לטווח ערכים של משרעת דופק, דופק משך הזמן, ומספר הפעימות. מניסיוננו עם תאי הלה, שהבחנו כי דופק יחיד מתח של משרעת מ 3 עד 9 הוולט V, ומשך זמן מיום 1 באלפיות עד 10 אלפית לגודל של 100 מיקרומטר האלקטרודה הוביל לelectroporation המוצלח עם מייליםמוות של תאים nimal. ההמלצה שלנו הוא שפרמטר אחד להיות מגוון בזמן ואחרים נשארים קבוע. כדי לכמת את יעילות electroporation לכל אחד מהפרמטרים הדופקים, אנחנו משתמשים ביודיד propidium (PI), צבע impermeant תא שכתמי חומר גרעין, ומתודולוגיה מבוססת assay חייה, כפי שמתואר בצעדים 4.2-4.5.
  2. להקים תרבית תאים בMEA ביצוע ההוראות המפורטות בשלבי 1 ו 2.
  3. לפני electroporation להכין 300-500 μl של פתרון PI מ"ל 30 מיקרוגרם / במאגר electroporation קר כקרח ו400 μl של 4 מיקרומטר calcien AM פתרון ב PBS.
  4. העברת MEA מהחממה למכסה מנוע הזרימה למינרית. הסר את התקשורת הסלולרית מMEA ולבצע שטיפה עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 300-500 μl למאגר electroporation הקר כקרח עם בלש פרטי.
  5. החל פולסים חשמליים עם משרעת דופק רצוי ואת משך זמן לאלקטרודות הממוקדות (ציוד המשמש בניסויים שלנו ליצירה ויישום elecדופק tric לMEA מתואר בשלב 3.3). לאלקטרודה ההשוואתית להנמיך האלקטרודה פלדה למאגר electroporation בMEA היטב או להשתמש באלקטרודה השכנה כהפניה. על ידי יישום סלקטיבי פולסים של אמפליטודות או משכים שונים לאלקטרודות שונות ניסויים מרובים יכולים להתבצע באותו המכשיר. לדוגמה, על האלקטרודה MEA 32, 8 ניסויים יכולים להתבצע על ידי פיצול 32 אלקטרודות ב8 קבוצות, כל אחד בהיקף של 4 אלקטרודות. כל אחד 8 קבוצות אז יכול להיות מגורה על ידי דופק יחיד מלבני מתח של משך 5 אלפיות עם עוצמות המשתנות בטווח 3 V V-6 במרווחים של 0.5 V וקבוצה אחת יכול לשמש כביקורת.
  6. מייד לאחר החלת פולסי המתח להעביר MEA לחממה למשך 5 דקות. לאחר מכן, בעדינות להסיר 75% ממאגר electroporation מMEA היטב ולהחליף אותו בתקשורת סלולרית החמה. להעביר בחזרה MEA לחממה.
  7. לאחר תקופת דגירה של 2-4 שעותלהחליף את התקשורת הסלולרית בMEA היטב עם 300-500 μl של 4 מיקרומטר Calcein AM הפתרון ב PBS. להעביר בחזרה MEA לחממה עבור 30 דקות נוספות.
  8. לאחר הדגירה של התאים עם Calcein הבוקר, להחליף Calcein AM פתרון בMEA היטב עם PBS לאחר שתי שטיפות עם PBS. להשיג תמונות ניאון של תאים באמצעות עם מיקרוסקופ אופטי עם פילטרים לצרכן (עירור / פליטה - 535 nm/617 ננומטר) וCalcein הבוקר (עירור / פליטה - 490 nm/520 ננומטר). הספיגה של PI, בשל electroporation, גורמת לתאים לזרוח אדומים וCalcein הבוקר גורם לתאים הנמצאים בחיים כדי לזרוח ירוק. שלושה תרחישים אפשריים שניתן לצפות הם 1) סלולריים electroporated וחיים (יהיה לזרוח גם אדום וירוק), 2) תאים בחיים אבל לא electroporated (יהיה לזרוח רק ירוק) ו3) תאים עקב electroporation מתים (יהיו לזרוח רק אדום) . כדאיויות התא הייתה מחושבת כאחוז מהמספר הכולל של תאי חיים על האלקטרודה וEFF ​​electroporationiciency חושב כאחוזים מהמספר הכולל של תאים העמוסים PI / siRNA.

5. נציג תוצאות

איור 1 מציג את טעינת אתר הספציפית של תאי הלה עם בלש פרטי. זה יכול להיות ציין כי תאים יחידים על האלקטרודה להפגין ספיגה של PI (1B איור). Assay חיה המבוצע electroporation הודעה שמש להערכת הכדאיות של תאים (איור 1 א). יעילות electroporation וכדאיויות תא לדוגמה שמוצגת באיור 1 הם 81.8% ו96.1% בהתאמה. כדאיויות תא גבוהות ויעילות electroporation ניתן להשיג על ידי אופטימיזציה של פרמטרי דופק electroporation. transfection אתר ספציפי של תאי הלה עם siRNA מתויג fluorescently לדופק electroporation אופטימיזציה (8 V, 1 msec) מוצג באיור 2. יעילות electroporation לsiRNA בשעת 8 V, 1 msec נמצאה 74.4 ± 16.0% וכדאיויות תא נמצאו 87.9 ± 8.4% (כל הנתונים המיוצגים כמתכוון ± סטיית תקן, N = 5).

figure-protocol-1
איור 1. מסירת אתר ספציפי של צרכן בתאי הלה על האלקטרודה 200 מיקרומטר (6 V, 5 אלפיות השני). ) Calcien assay החי המבוסס בוצע electroporation הודעת שעות 2. תאי חיים מסומנים באמצעות פלואורסצנטי ירוקה. B) האדום פלואורסצנטי מדגים את הספיגה של PI על ידי תאים באלקטרודה. ג) תמונה של גבי וB. החיצים הלבנים מצביעה על תאים שelectroporated וחיים. החיצים השחורים מצביעים על תאים שמתו. העיגול הלבן ב, B ו-C מציין את קווי המתאר של האלקטרודה.

figure-protocol-2
איור 2. Transfection של תאי הלה עם scrambl מתויג fluorescentlyרצף דואר של siRNA. א) תמונה של תאי הלה על האלקטרודה 100 מיקרומטר transfected עם אלכסה siRNA מתויג 488 (8 V, 1 אלפיות). B) תמונה של גרעיני תאים מוכתם בDAPI. העיגול הלבן מסמן את הקצה של האלקטרודה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמר זה וידאו שמדגימים את שימוש MEA לtransfection אתר ספציפי של תאי הלה עם מקושקש רצף של siRNA. אחד היתרונות של טכנולוגיה זו היא תחולתו לשורות תאים שונות, כוללים שורות תאים ראשוניות. המעבדה שלנו הוכיחה בעבר את השימוש בטכנולוגיה זו לtransfection אתר ספציפי של התרבות העצבית ביפוקמפוס העיקרית מעכברוש E18 יום ישן ותאי ה-NIH 3T3 עם רצפי siRNA המקושקש וGFP פלסמיד 18, 19. גם היו לנו הצלחה באספקה ​​הפונקציונלי siRNA כנגד מטרת אנדוגני בתאי הלה (נתונים שלא פורסמו). MEA טיפוסי זמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

חומרים

שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות (אופציונלי)
תקשורת סלולרית:
המתקדם MEM
L-גלוטמין 200 מ"מ
פניצילין / סטרפטומיצין
סרום שור עוברי 		Gibco / Invitrogen
Himedia מעבדות / VWR
Lonza הקבוצה בע"מ
Gibco / Invitrogen 		12492-013
95057-448
09-757F
16000-044 		הרכב תא תקשורת:
2% FBS, 2% L-גלוטמין ו% 2 בPennstrep המתקדם MEM
טריפסין EDTA Mediatech, Inc 25-053-CL
PBS Mediatech, Inc 21-040-CV
Alexa 488 וrhodamine מתויג מקושקש sequsiRNA ence Qiagen, Inc 1027292
מאגר electroporation מעבדות Biorad 165-2677
הגל גנרטור פרגמטי 2414A כל גל / מחולל פעימות שיכולות לספק את הקטניות הרצויות יכול להיות בשימוש.

מקורות

  1. Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742(2001).
  3. Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
  4. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550(2002).
  5. Lee, N. S. Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).
  6. Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
  7. Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
  8. Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).
  9. Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15, 1311(1987).
  10. Felgner, P. L. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413(1987).
  11. Raptis, L. H. applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide. Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).
  12. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).
  13. Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers. International Journal of Nanomedicine. 6, 1017(2011).
  14. Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411, 107-110 (2001).
  15. Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes. Nucleic Acids Res. 32, e187(2004).
  16. Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer. Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).
  17. Jain, T., Muthuswamy, J. Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells. Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).
  18. Jain, T., Muthuswamy, J. Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture. Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).
  19. Jain, T., Muthuswamy, J. Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording. Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).
  20. Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays. Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).
  21. Huang, H. An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery. Lab Chip. 11, 163-172 (2010).
  22. Efficient and high-throughput electroporation chips. Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference (TRANSDUCERS), 2011 16th International, , IEEE. (2011).
  23. Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays. Lab Chip. 12, 939-947 (2012).
  24. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
  25. Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region. J. Neurophysiol. 93, 594(2005).
  26. Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).
  27. Boukany, P. E. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

siRNAHeLaCalcium AM
יעילות גבוהה Transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם siRNA שימוש במערכי microelectrode (MEA)
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.