יעילות גבוהה Transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם siRNA שימוש במערכי microelectrode (MEA)

סיכום

את פרטי מאמר פרוטוקול transfection ספציפי לאתר של מקושקש רצף של siRNA בתרבית תאי יונקים חסידה באמצעות מערך microelectrode (MEA).

תקציר

הגילוי של מסלול RNAi באאוקריוטים והפיתוח הבא של סוכני RNAi, כגון siRNA וshRNA, השיג שיטה רבה עצמה להשתקת גנים מסוימים ^1-8 לגנומיקה ותרופות תפקודיות. אתגר גדול המעורבים במחקרים מבוססים RNAi הוא המסירה של סוכני RNAi לתאים ממוקדים. טכניקות מסורתיות שאינן נגיפיות משלוח, כגון electroporation בתפזורת ושיטות transfection כימיים לעתים קרובות חוסר השליטה במרחב הנחוצה על משלוח ולהרשות יעילות transfection עניה ^9-12. התקדמות בשיטות transfection כימיות כגון שומני קטיוני, פולימרי קטיוני חלקיקים הביאה ליעילות transfection משופרת מאוד ^13. עם זאת, שיטות אלו עדיין לא הצליחו להציע שליטה מרחבית מדויקת במסירה שמאוד יכולים להועיל מיניאטורי טכנולוגיות תפוקה גבוהה, מחקרי תא בודדים וחקירות של אינטראקציות תא סלולרי. nt "> ההתקדמות טכנולוגית האחרונה במסירת הגן אפשר transfection תפוקה גבוהה של תאי חסיד ^14-23, רובם משתמשים electroporation microscale. electroporation microscale מציע שליטה זמנית spatio מדויקת במסירה (עד תאים בודדים) והוכח כדי להשיג יעילות ^{גבוהה, 19 24-26.} בנוסף, גישות מבוססות electroporation אינן דורשות תקופה ממושכת של דגירה (בדרך כלל 4 שעות) עם קומפלקסי siRNA וה-DNA לפי צורך בשיטות transfection מבוססות כימיות ולגרום לכניסה ישירה של siRNA וDNA עירום מולקולות לתוך הציטופלסמה התא. כביטוי גני תוצאה יכולות להיות מושגת כבר בשש שעות לאחר transfection ^27. המעבדה שלנו הוכיחה את השימוש במערכי microelectrode (MEA) עבור transfection אתר ספציפי בתרביות של תאי יונקי חסיד ^17-19 בעבר. בגישה המבוססת MEA, מסירת המטען גנטי מושגת באמצעות electroporati המקומי מייקרו בקנה מידהבתאים. יישום של פולס חשמלי לאלקטרודות נבחרת יוצר שדה חשמלי מקומי שמוביל לelectroporation נוכחיים בתאים באזור של אלקטרודות מגורה. השליטה העצמאית של אלקטרודות מייקרו מספקת שליטת מרחב ובזמן על transfection וגם מאפשרת ניסויים מבוססים transfection מרובים להתבצע על אותה תרבות הגדלת התפוקה וההפחתה הניסיונית השתנות תרבות לתרבות.

כאן אנו מתארים התקנה הניסיונית ופרוטוקול transfection הממוקד של תאי הלה חסיד עם siRNA מתויג fluorescently מקושקש רצף באמצעות electroporation. אותו פרוטוקול יכול לשמש גם עבור transfection של וקטורי פלסמיד. בנוסף, הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להרחיב בקלות למגוון רחב של שורות תאי יונקים עם שינויים קלים. זמינות מסחרית של MEAs עם דפוסים אלקטרודה מראש מוגדרים והן מותאמים אישית להפוך לא נגיש טכניקה זומעבדות o רוב המחקר עם ציוד תרבית תאים בסיסי.

פרוטוקול

1. MEA הכנה

1. MEAs לשימוש בניסויי electroporation או יכול להיות מפוברק באמצעות טכניקת photolithography סטנדרטית כפי שתואר לעיל ¹⁸ או לרכוש ישירות מספקים של יצרני MEA כגון מערכות מרובות ערוצים (http:/www.multichannelsystems.com/) ואלפא MED מדעי, Inc ( http://www.MED64.com). את MEAs משמש בניסויים שלנו היו מפוברק בתוך הבית במתקן החדר הנקי באוניברסיטת אריזונה, המנוהלת על ידי המרכז למחקר האלקטרוניקה של מצב מוצק (CSSER).....

דיון

במאמר זה וידאו שמדגימים את שימוש MEA לtransfection אתר ספציפי של תאי הלה עם מקושקש רצף של siRNA. אחד היתרונות של טכנולוגיה זו היא תחולתו לשורות תאים שונות, כוללים שורות תאים ראשוניות. המעבדה שלנו הוכיחה בעבר את השימוש בטכנולוגיה זו לtransfection אתר ספציפי של התרבות העצבית ביפוקמפוס העיקרית מעכברוש E18 יום ישן ותאי ה-NIH 3T3 עם רצפי siRNA המקושקש וGFP פלסמיד ^{18, 19.} גם היו לנו הצלחה באספקה ​​הפונקציונלי siRNA כנגד מטרת אנדוגני בתאי הלה (נתונים שלא פורסמו). MEA טיפוסי זמ.......

חומרים

שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
תקשורת סלולרית: המתקדם MEM L-גלוטמין 200 מ"מ פניצילין / סטרפטומיצין סרום שור עוברי	Gibco / Invitrogen Himedia מעבדות / VWR Lonza הקבוצה בע"מ Gibco / Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	הרכב תא תקשורת: 2% FBS, 2% L-גלוטמין ו% 2 בPennstrep המתקדם MEM
טריפסין EDTA	Mediatech, Inc	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc	21-040-CV
Alexa 488 וrhodamine מתויג מקושקש sequsiRNA ence	Qiagen, Inc	1027292
מאגר electroporation	מעבדות Biorad	165-2677
הגל גנרטור	פרגמטי	2414A	כל גל / מחולל פעימות שיכולות לספק את הקטניות הרצויות יכול להיות בשימוש.