הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Microgavage של זחלי דג זברה

17.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4434

⸱

20 בפברואר 2013

 , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים שיטה חדשנית למיקרו-גבג' (microgavage) של זחלי דגי זברה תוך שימוש בציוד סטנדרטי להזרקה של עוברים ובמיקרוסקופ סטריאו. אנו מדגימים כי מיקרו-גבג' היא טכניקה בטוחה ויעילה, המועילה להחדרה של כמויות מבוקרות של חומרים מגוונים באופן ספציפי אל תוך חלל המעי של זחלי דגי זברה.

תקציר

דג הזברה הפך לאורגניזם מודל רב-עוצמה לחקר התפתחות המעי1-5, פיזיולוגיה6-11, מחלות12-16 ואינטראקציות בין המאחסן למיקרובים17-25. גישות ניסיוניות לחקר הביולוגיה של המעי דורשות לעיתים קרובות הכנסה in vivo של חומרים נבחרים לתוך חלל המעי. במודל של זחלי דג זברה, הדבר משיג בדרך כלל על ידי טבילה של הדגים בתמיסה של החומר הנבחר, או על ידי הזרקה דרך דופן הבטן. בשיטת הטבילה, קשה לנטר או לשלוט במדויק בנתיב או בתזמון של אספקת החומר למעי. מסיבה זו, חשיפה באמצעות טבילה עלולה לגרום לרעילות לא מכוונת ולהשפעות אחרות על רקמות מחוץ למעי, מה שמגביל את טווח הכמויות הפוטנציאלי של החומרים שניתן להחדיר למעי. כמו כן, כמות החומר הנבלעת במהלך חשיפה בטבילה עשויה להשתנות משמעותית בין זחלים בודדים26. למרות שבעיות אלו אינן מופיעות במהלך הזרקה ישירה דרך דופן הבטן, ביצוע הזרקה נכונה הוא קשה וגורם לנזק רקמתי שעלול להשפיע על תוצאות הניסוי. אנו מציגים שיטה למיקרו-גבג' (microgavage) של זחלי דג זברה. מטרתה של שיטה זו היא לספק דרך בטוחה, יעילה ועקבית להחדרת חומרים ישירות לחלל המעי הקדמי בזחלי דג זברה בתזמון מבוקר. מיקרו-גבג' משתמש בציוד סטנדרטי להזרקה מיקרוסקופית של עוברי דגים ובסטריאומיקרוסקופיה, הנפוצים ברוב המעבדות המבצעות מחקרים בדגי זברה. לאחר שהדגים ממוקמים כראוי במתילצלולוז, ניתן לבצע את הגבג' במהירות בקצב של כ-7-10 דגים לדקה, ושיעור ההישרדות לאחר הגבג' שואף ל-100% תלוי בחומר שהוכנס. אנו מראים גם כי מיקרו-גבג' מאפשר טעינה של חלל המעי בריכוזים גבוהים של חומרים שהם קטלניים לדגים כאשר הם נחשפים באמצעות טבילה. כדי להדגים את התועלת של שיטה זו, אנו מציגים בדיקת מיקרו-גבג' של דקסטראן פלואורסצנטי שניתן להשתמש בה כדי לכמת את המעבר מחלל המעי למרחבים מחוץ למעי. בדיקה זו יכולה לשמש לאימות ביצוע תקין של הליך המיקרו-גבג', וכן מספקת בדיקה חדשנית בדגי זברה לבחינת שלמות מחסום האפיתל של המעי תחת תנאים ניסיוניים שונים (למשל מניפולציה גנטית, טיפול תרופתי או חשיפה לגורמים סביבתיים). יתרה מכך, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בגבג' להערכת מוטיליות המעי על ידי הזרקה של מיקרוספירות פלואורסצנטיות וניטור המעבר שלהן לאחר מכן. ניתן להשתמש במיקרו-גבג' להחדרת חומרים מגוונים כגון מיקרואורגניזמים חיים, גורמים/רעלנים מיקרוביאליים מוקרטים, סוכנים פרמקולוגיים וגששים פיזיולוגיים. עם יכולות אלו, לשיטת המיקרו-גבג' בזחלי דג זברה יש פוטנציאל לשפר מגוון רחב של תחומי מחקר המשתמשים במודל דג הזברה.

פרוטוקול

אנו משתמשים בפרוטוקולים שפורסמו עבור גידול ותחזוקה סטנדרטיים של דגי זברה כדי להשיג זחלים עבור מיקרו-גבג' (microgavage)27. אנו משתמשים בעיקר ברבייה טבעית להרביית הדגים, והם נשמרים במחזור של 14 שעות אור/10 שעות חושך. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה עבור מיקרו-גבג' של זחלי דגי זברה ביום ה-6-7 לאחר ההפריה (dpf). אנו צופים ששיטות אלו יהיו ישימות באופן כללי לשלבי התפתחות צעירים ומבוגרים יותר עם שינויים קלים. אלא אם צוין אחרת, השתמשנו בזן דגי זברה מסוג wild-type TL ביום ה-6 ל-dpf, והדגים לא הוזנו. כל הניסויים בוצעו במי מערכת שהושגו ממתקן גידול דגי הזברה הקונבנציונלי שלנו; עם זאת, ניתן להשתמש בכל מצע מתאים לדגי זברה (למשל מצע עוברים או מצע דגי זברה גנוביוטיים (GZM)28). בפרוטוקול זה, אנו מתייחסים ל'מצע דגי זברה' (zebrafish media) כדי לייצג את המצע שבחר המשתמש.

1. הכנת מתילצלולוז, תבנית להזנה (Gavage) וייצור מחט למיקרו-הזנה

ביום שלפני הניסוי או בשעותיו המוקדמות של יום הניסוי, הכינו את המתילצלולוז, את תבנית האגרוז לייצוב הזחלים ואת מחטי המיקרו-גבג' (microgavage).

  1. המס 3 g של methylcellulose ב-100 ml של מים סטריליים דה-יוניים או במצע לגידול דגי Zebrafish (בהתאם ליישום שלך) כדי להכין תמיסה בריכוז 3%. הוסף למבחנה מקל מגנטי, חמם את המים עד לטמפרטורה קרובה לרתיחה, והנח על פלטת ערבוב בחום גבוה. תוך כדי ערבוב, פזר לאט את ה-methylcellulose כדי למנוע היווצרות גושים. הפחת בהדרגה את מהירות הערבוב ואת טמפרטורת הפלטה לאורך היום עד להגעה לטמפרטורת החדר.
  2. המשיך בערבוב איטי למשך הלילה עד להמסה מלאה של ה-methylcellulose. ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים במיכל אטום.
  3. הכן תבנית ג'ל agarose בריכוז 3% בצלחת פטרי של 10 cm באמצעות תבנית פלסטיק (Adaptive Science Tools, TU-1) בהתאם להוראות היצרן. אטום באמצעות parafilm ואחסן ב-4 °C עד לשימוש כדי למנוע התייבשות. חמם לטמפרטורת החדר או ל-28 °C לפני הניסוי. בדרך כלל ניתן להשתמש בתבניות agarose מספר פעמים.
  4. משוך מספר מחטי gavage באמצעות קפילרות זכוכית בורוסיליקט ושלב Flaming Brown Micropipette Puller המצויד בסיב חימום בעל תעלה רחבה (FT330B). התוכניות שבהן אנו משתמשים לייצור המחטים הן כדלקמן:
סוג המחטלחץחוםמתיחהמהירותזמן
עוברית50031510050200
גבג' (gavage)50031512575200

מכיוון שסיבים עשויים להשתנות בין מכשירים שונים, רשמו את זמן העלייה (זמן החימום הפעיל). זמן העלייה שלנו עבור תוכנית זו נע בין 8.57-8.79 ms. תוכנית זו יוצרת מחטים קצרות ועבות יותר ממחטי מיקרו-הזרקה מסורתיות (איור 1). ייתכן שיהיה צורך לבצע אופטימיזציה להגדרות אלו לשימוש במכשירים שונים למשיכת מיקרו-פיפטות.

2. קיטום, טעינה וכיול של מחטי המיקרו-גבג' (Microgavage)

הערה*: קיצורי המחט הוא שלב קריטי בפרוטוקול זה. כמו כן, השיטות לטעינת המחט ולכיול שלה ישתנו בהתאם לסוג יחידת המיקרו-הזרקה שבשימוש. ביצענו אופטימיזציה לפרוטוקול זה באמצעות מיקרו-מזרקים מסוג Drummond II, אך אנו צופים שפרוטוקול זה יהיה ישיים גם למכשירי מיקרו-הזרקה אחרים עם התאמות מינוריות. מכיוון שמתקני ההזרקה ומותחי המחטים משתנים בין מעבדות, חשוב למדוד/לכייל את נפחי ההזרקה (ראו סעיף 2.8).

  1. את המחטים גוזרים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. אנו משתמשים במיקרוסקופ סטריאוסקופי Leica S6E המכוון להגדלה של 2.5x. בהגדרה זו, סרגל המיקרומטר בעין (eyepiece graticle) בעל 100 החלוקות הוא באורך של 2 mm.
  2. יש ליישר את קצה המחט עם קצה סרגל המיקרומטר (סימון חלוקה 100), ולגזור את המחט באמצעות פינצטה עדינה של שעונים במרחק של כ-1 mm מהקצה (סימון חלוקה 48-50) (Figure 1A).
  3. קוטר המחט צריך להיות כ-27-30 μm והקצה צריך להיות קהה. יש לבחון את קצות המחטים בהגדלה של 100x. מחטים חדות או משוננות מובילות להסתברות גבוהה יותר לנזק במהלך ה-gavage ויש להימנע מהן במידת האפשר.
  4. לחלופין, כאשר הדבר זמין, ניתן להשתמש ב-microforge כדי לשלוט טוב יותר בנקודת גזירת המחט ולבצע ליטוש באש (fire-polish) לקצות המחט כדי להסיר קצוות חדים (Figure 1B).
  5. הכינו את תמיסת ה-gavage. עבור רוב היישומים, אנו מכינים את התמיסה עם תוספת של דילול 1:10 של תמיסת phenol red בריכוז 0.5% בתוך Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) (Sigma-Aldrich), כדי להבטיח שניתן יהיה לראות את התמיסה תחת המיקרוסקופ הסטריאוסקופי למעקב אחר התפקוד התקין של המיקרו-מזרק ומיקום תמיסת ה-gavage בבבול הקדמי (anterior bulb). צבעי טעינה אחרים מלבד phenol red לא נבחנו אך ניתן להשתמש בהם.
  6. הכינו את מחט ה-gavage על ידי מילוי בשמן מינרליים באמצעות מזרק של 1 ml עם מחט 25G 5/8. התקינו את המחט על יחידת המיקרו-הזרקה Nanoject II.
  7. עטפו צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 10 cm ב-parafilm כדי לספק משטח שטוח ועמיד במים, והניחו נפח של כ-2 μl מתמיסת ה-gavage על ה-parafilm. מלאו ידנית את מחט ה-gavage מהחלק האחורי, תוך הקפדה להימנע מיצירת בועות אוויר בשמן המינרליים.
  8. כדי לבחון את תפקוד המיקרו-מזרק ולכייל את נפח הפליטה, מלאו צלחת פטרי בקוטר 3 cm בשמן מינרליים והזריקו אל תוך השמן עד שהטיפות יהיו עקביות בגודלן. מדדו את קוטר הטיפות באמצעות סרגל המיקרומטר או באמצעות פונקציית מדידה במיקרוסקופ הסטריאוסקופי, אם קיימת. חשבו את נפח הטיפה (נוסחה: V=4/3πr3). עקביות הנפח בין מחטים מוצגת בגרף (Figure 1C).
  9. שטפו את קצה המחט על ידי טבילות חוזרות במצע נקי של דגי ゼברה (zebrafish media) כדי להסיר שאריות של שמן מינרליים לפני תחילת ה-gavage. שמן מינרליים הוא צפוף מאוד ועלול לגרום לנזק לרקמות אפיתליאליות אם לא ינוקה מקצה המחט.

3. הרדמה, קיבוע והזנה במזלק (Gavage) של זחלי דגי זברה

  1. יש לחמם את תבנית האגרוז בטמפרטורת החדר או ב-28 °C לפני הניסוי.
  2. הכינו את תבנית האגרוז להזנה (gavage) על ידי כיסוי של 3 חריצים במתילצלוז (methylcellulose) בריכוז 3%. השתמשו בכמות מתילצלוז המספיקה כדי לכסות את החריצים ולהחזיק את הדגים, אך לא בכמות קטנה מדי שתיגרום לייבוש מהיר.
  3. בפלטת 6 בארות נקייה, חלקו את זחלי דגי הזברה של כל קבוצת ניסוי לבארים נפרדות, כאשר כל באר מכילה 3.5-4.0 ml של מצע גידול לדגי זברה.
  4. הכינו תמיסת טריקאין (tricaine) בריכוז 3x (0.05% w/v) במצע הגידול המתאים לדגי זברה. הרדימו את הדגים באר אחת בכל פעם על ידי ערבוב של נפח שווה של תמיסת טריקאין 3x לתוך הבאר המכילה את הזחלים, כדי להגיע לריכוז סופי של 1.5x (0.025%), וערבבו בעדינות בתנועות סיבוביות.
  5. ברגע שדגי הזברה מפסיקים לזוז, הוציאו אותם מהבאר באמצעות פיפטת פסטור מזכוכית עם פיה רחבה ומשאבת פיפטה, והניחו אותם אחד אחד על המתילצלוז, כאשר ראשיהם מופנים לזווית של 45° של החריץ וזנבותיהם פונים לזווית של 90° של החריץ. לחצו אותם בעדינות לתוך המתילצלוז באמצעות מחט דיסקציה קהה כדי לייצב את מיקומם.
  6. כוון את מערך המיקרו-הזרקה Nanoject II כך שהמחט תהיה מוטה בזווית נמוכה, שהיא מקבילה בקירוב לזווית של 45° של תבנית האגרוז. ודאו שטווח ההארכה של המחט יהיה מספיק כדי להגיע מעבר לתחתית באר התבנית, כך שיהיה צורך בפחות כיוונים לאחר הצבת הדגים.
  7. הגדירו את יחידת המיקרו-הזרקה לשחרור של 4.6 nl (מקסימום) בהגדרת הזרקה איטית (23 nl/sec). בהגדרות אלו, הנפח המוזרק אמור למלא בדיוק את הפקע הקדמי של המעי ולא לדלוף מהוושט או מהקלואקה. ניתן להשתמש בנפחים קטנים יותר בהתאם למטרת הניסוי.
  8. השתמשו ביד אחת לביצוע כיוונים קלים של הפלטה המכילה את הזחלים מקובעי התנועה, ובמקביל השתמשו ביד השנייה לשליטה במניפולטור של יחידת המיקרו-הזרקה.
  9. תמנו את מחט ההזנה בעדינות אל תוך פיו של הדג המורדם, דרך הוושט, ולחצו קלות על הספינקטר הוושטי כדי להחדיר את קצה מחט ההזנה ממש לתוך הפקע המעי קדמי (Figure 2, step 1-2, a&b).
  10. ברגע שהמחט נמצאת בתוך הפקע הקדמי, לחצו בעדינות על דוושת הרגל או על כפתור ההזרקה כדי להחדיר את החומר. משכו את המחט החוצה במהירות ובחלק, תוך ניסיון להימנע משחרור כמויות משמעותיות של חומר לתוך הוושט (Figure 2, step 3-4).
  11. לאחר ההזנה, השתמשו בפיפטת פסטור מזכוכית עם פיה רחבה ובמשאבת פיפטה כדי להעביר בעדינות את זחלי דגי הזברה למצע גידול טרי. מלאו את הפיפטה במים עד לגובה של כ-1 אינץ' מעל כיפוף הצוואר, צרו כיס מים קטן במתילצלוז ליד ראשו של הזחל כדי לשחררו, הרימו את הראש בעדינות אל תוך פיית הפיפטה, ושאבו את הזחל מתוך המתילצלוז. הוציאו בעדינות את הדגים ואת כל המים מהפיפטה לתוך צלחת של מצע גידול טרי.
  12. שטפו את הזחלים במצע גידול טרי על ידי שאיבה והזרקה עדינה (pipetting up and down) או על ידי התזת מצע מספר פעמים כדי להסיר את המתילצלוז ולהעיר את הזחלים מההרדמה. העבירו את הזחלים לצלחת פטרי או לפלטת 6 בארות עד שיהיו נחוצים לצילום ולניתוח עוקבים.

4. בדיקת דקסטראן לבחינת בטיחות הגavage ושלמות מחסום המעי

ניתן להשתמש במיקרו-גבג' (Microgavage) כדי להחדיר חומרים מגוונים אל המעי. כדוגמה, אנו מספקים להלן פרוטוקול לגבג' של dextran בגודל 10 kD המשולב עם Texas Red לצורך ניתוח של שלמות המחסום של אפיתל המעי. קיימים לפחות שני נתיבים פוטנציאליים לחדירות פאראצלולרית (paracellular permeability), עם הבדלים בסלקטיביות המבוססים על המטען והגודל של המומסים, המכונים נתיבי ה-"pore" (נקב) או ה-"leak" (דליפה)29. מכיוון ש-dextran זה גדול מדי מכדי להיספג דרך אפיתל המעי באמצעות נתיב הנקב הפאראצלולרי (מגבלת גודל של ~4Å, בעוד ש-10kD dextran הוא ~23Å)9,30-32, הוא אמור להישאר בתוך הלומן אם שלמות מחסום המעי אינה פגועה. למרות ש-10 kD dextran יכול להיות מובל דרך נתיב הדליפה הפאראצלולרי, לנתיב זה קיבולת נמוכה יותר וקינטיקה איטית יותר29,33, ולכן סביר להניח שלא יתרחש בתוך מסגרת הזמן של בדיקה זו. טיפול של 'ביקורת חיובית' להפרת שלמות המחסום מתבצע על ידי הוספת EDTA, אשר מפר את הצומתים המהודקים (tight junctions) של האפיתל34,35. ניתן להשתמש בבדיקת גבג' ה-dextran כבדיקת בקרת איכות כדי להוכיח שפרוצדורת הגבג' מבוצעת בבטחה ללא נזק בלתי מכוון לרקמה. בנוסף, ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לבחון את שלמות מחסום המעי כפונקציה של גנוטיפ או טיפול.

  1. הכן את תמיסות ה-gavage הבאות: 1% dextran/1x PBS/0.05% phenol red ו-1% dextran/20 mM EDTA/1x PBS/0.05% phenol red (ביקורת חיובית). את תמיסת המלאי של 5% dextran ב-ddH2O יש לאחסן באליקוטים של 50 μl בטמפרטורה של -20 °C כדי להפחית את מספר מחזורי ההקפאה וההפשרה. כמו כן, הכן תמיסת mock gavage של 1x PBS/0.05% phenol red.
    ביקורת חיובית (+ control) (EDTA)ללא EDTA
 מלאי (stock)סופימקדם דילול10 μl10 μl
EDTA, pH 8200 mM20 mM1010
Dextran5%1%522
PBS10x1x1011
Phenol Red0.50%0.05%1011
   סיכום ביניים:54
   ddH2O:56
   סה"כ:1010
  1. השתמשו בפרוטוקול בסעיף 3 כדי לבצע gavage לקבוצות של 10-20 זחלי zebrafish עבור כל תנאי ניסוי. חזרו על פעולה זו בקבוצות כפולות או משולשות במידת האפשר.
  2. לאחר ה-gavage, המתינו להתאוששות הזחלים מההרדמה ואפשרו להם לשחות בחופשיות במצע טרי.
  3. בטווח של 18-20 דקות לאחר ה-gavage, הרדימו שנית את הזחלים כפי שמתואר בשלב 3.3. מקמו את הזחלים ב-3% methylcellulose על גבי בלוק של 3% agarose (פעולה זו מפחיתה סנוור של הרקע במהלך הדימוג).
  4. דגמו את הזחלים באמצעות סטריאוסקופ פלואורסצנטי (למשל, Leica M205C) וסט מסננים של Texas Red בהגדלה המאפשרת תצוגה של הזחלים מהחרטום ועד לאזור שמיד אחרי קץ ה-cloaca.
  5. רכשו את כל התמונות בהגדרות חשיפה זהות כדי שניתן יהיה לכמת ולהשוות ביניהן מאוחר יותר. הפלואורסצנציה תהיה עזה בחלל המעי של כל הזחלים שהוזרק להם dextran, אך תפקוד המחסום מוערך לפי רמת ה-dextran המופיעה ברקמות חוץ-מעיות (כלומר, בגו ו בכלי הדם) (איור 5). כווננו את החשיפה להגדרות המאפשרות ויזואליזציה של פלואורסצנציה בגו, גם אם הדבר גורם לחשיפת יתר של הפלואורסצנציה בחלל המעי.
  6. דרגו את זמני ה-gavage כך שכל קבוצה תבלה בערך את אותו פרק זמן בהתאוששות לאחר ה-gavage ותדגם בערך באותו זמן לאחר ה-gavage. בניסוי זה, לביצוע הפעולה עבור כל קבוצה על ידי אדם אחד נדרשת כשעה אחת. הדגים מורדמים 18-20 דקות לאחר ה-gavage, והדימוג אורך כ-1-2 דקות לדג.
  7. השתמשו בתוכנה לניתוח תמונות כגון ImageJ כדי לכמת את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת היחסית באזור הגו שמעל המעי. נרמלו ערכים אלו על ידי החסרת מדידת רקע שנלקחה מאזור בתמונה מחוץ לדג.
  8. הציגו בגרף ונתחו את הנתונים מניתוח התמונות באמצעות GraphPad Prism או תוכנה סטטיסטית דומה.

5. בדיקת מיקרוספירות פלואורסצנטיות לבחינת מוטיליות מעית

גבג' (Gavage) מספק שליטה משופרת על התזמון והכמות של החומר המועבר למעי, מה שהופך אותו לשיטה חלופית אידיאלית למחקרי מוטיליות של המעי. טכניקות שפורסמו בעבר למדידת מוטיליות של המעי בזריקים של דגי זברה כוללות תצפית ישירה על התכווצויות וגלים של המעי באמצעות מיקרוסקופיה1,21,36, או האכלת זריקים במזון המעורבב עם מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות בצבע צהוב-ירוק26. במחקרים מסוימים, הכמות של דפוסי המוטיליות של המעי שופרה על ידי טבילת זריקים בתמיסות המכילות צבע מאכל37 או באמצעות טכניקה מיוחדת לניתוח וידאו הנקראת מיפוי מרחבי-זמני (spatiotemporal mapping)38,39. כאן אנו מציגים מחקר הוכחת-היתכנות כדי להראות כי ניתן לבצע גבג' של מיקרוספירות פלואורסצנטיות אל תוך הפקעת הקדמית של המעי, וכי מעקב אחר תנועת המיקרוספירות יכול לשמש להערכת מוטיליות המעי (Figure 6). ההבדל העיקרי בין שיטה זו לגישה של Field ועמיתיו26 הוא שהחרוזיים מוחדרים לבדם ולא ניתן לשלבם במזון בשל מגבלות קוטר מחט הגבג'.

  1. יש להחזיק את זחלי zebrafish בצלחות של 10 cm עם 35 ml מצע עד לביצוע הניסוי ב-7 dpf. יש להתחיל להאכיל את הזחלים פעם אחת בכל בוקר החל מ-5 dpf עם ~0.6 mg מזון באבקה (תזונה לזחלים, כפי שתואר בעבר40; המוגשת באמצעות לולאת הזרקה סטרילית של 1 mm).
  2. יש לנער בעדינות את הבקבוק של מיקרוספירות פוליסטירן Fluoresbrite YG 2.0 μm (סספנזיה מימית של ~2.5%) כדי לערבב את הסספנזיה. יש להעביר טיפה מהבקבוק אל פני פראפילם כדי שניתן יהיה למדוד נפח ספציפי באמצעות פיפטה.
  3. במבחנת Eppendorf, יש לסובב את החרוצים בצנטריפוגה שולחנית במהירות נמוכה, להסיר את הנוזל העליון (supernatant) ולהחליפו ב-1x PBS בנפח המקורי. יש לחזור על תהליך זה כדי לשטוף את המיקרוספירות פעמיים.
  4. יש להכין סספנזיה להזנה ב-gavage המכילה 0.25% מיקרוספירות (דילול 1:10 של סספנזיה ממלאי)/1x PBS/0.05% phenol red. ישנן ~2.6x103 מיקרוספירות בנפח gavage של 4.6 nl המוגש לכל זחל.
  5. יש להשתמש בפרוטוקול בסעיף 3 כדי לבצע gavage למספר הזחלים הרצוי. המיקרוספירות הן בעלות ציפה מסוימת; לכן, יש לבצע את ה-gavage במהירות רבה ככל האפשר כדי למקסם את עקביות הסספנזיה.
  6. בניסוי זה, בוצע gavage ל-15 זחלים, ולאחר ההתאוששות מההרדמה הם הוחזקו בבארים בודדות של פלטת 12 בארים כדי לעקוב אחר המעבר בפרטים בודדים. עם זאת, ניתן לבצע gavage לקבוצות גדולות יותר ולהעריך את המעבר כאוכלוסייה ולא באופן אינדיבידואלי. יש לעיין ב-Field et al. לשיטות עבודה סטנדרטיות26.
  7. יש להעריך את תנועיות המעי על ידי דירוג המיקום הרוסטרלי (או הקדמי) ביותר של המיקרוספירות הפלורסצנטיות בזחלים חיים בזמנים שונים באמצעות סטריאומיקרוסקופ פלורסצנטי. יש להרדימ את הזחלים לזמן קצר ב-1x (0.017%) tricaine, ולדרג את אזורי מיקום המיקרוספירות או לצלם תמונות לצורך דירוג מאוחר יותר.
  8. יש לשרטט גרף ולהשוות את אחוז סך הזחלים עם מיקרוספירות באזור מעי מסוים לאורך זמן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאשר הגavage מבוצע כראוי, החומר שהועבר צריך להיות כלוא כולו בתוך המעי הקדמי, עם מעט מאוד חומר שאריות או ללא חומר בכלל בוושט (איור 3). יש לבחור נפח הזרקה שניתן להכיל בתוך הפקעת הקדמית ושאינו דולף דרך הקלואקה או הוושט. אם נפח החומר או לחץ ההזרקה גבוהים מדי, הכוח הפיזי של הגavage עלול להוביל לנזק לאפיתל או לדליפה דרכו. הדבר עלול גם לדחוף החוצה או לשנות מרכיבים אחרים של הסביבה הלומנלית (למשל, מרה או ריר), מה שעלול לשנות את הסביבה הביוכימית המקומית ולגרום לשיבוש בתוצאות. באופן כללי, נסיגה מהירה של המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול חדש להחדרה ישירה של חומרים למעי של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרו-גavage. ישנם מספר שלבים קריטיים לאורך ההליך שיש לקחת בחשבון. ראשית, זחלי דגי הזברה צריכים להיות במצב בריאותי טוב לפני ניסוי ה-gavage כדי למנוע מקרי מוות שאינם קשורים לטיפול. גורם חשוב נוסף הוא איכות מחט ה-gavage. אחד החלקים הקשים ביותר בפרוטוקול הוא חיתוך המחט במיקום המתאים מבלי ליצור קצוות חדים ומשוננים. ניתן להשתמש במיקרופורג' (microforge) של מיקרופיפטה כדי להשיג שבירה עקבית יותר ולבצע ליטוש באש (fire-polish) לקצוות המחט כדי ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הצהרו על ניגודי עניינים.

תודות

אנו מודים לחברי מעבדת Rawls על הצעות מועילות בנוגע לתוכן, ולד"ר Alan Fanning על דיונים בעלי ערך בנושא חדירות לגודל של צומת מהודק (tight junction) ושיטות להרסו. אנו מודים גם לד"ר Michael Chua ולד"ר Neal Kramarcy ממתקן המיקרוסקופיה Michael Hooker על התמיכה במיקרוסקופ קונפוקאלי. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health) מספרים T32 DK007737-15 (לחניך J.L.C.), F32 DK094592 (עבור J.L.C.), ו-R01 DK081426 (עבור J.F.R.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פינקל (Tricaine methanesulfonate)Argent Chemical LaboratoriesMS-222הרדמת זחלים
תמיסת Phenol RedSigma-AldrichP0290-100 ml0.5% ב-DPBS, נבחן לתרביות תאים
שמן מינרלי, קל, לבן (בטוהר גבוה)AmrescoJ217-500 mlלמילוי חוזר של המחט ובדיקת נפח
TxRed-Dextran, 10,000 MW, lysine fixableInvitrogen/ Molecular ProbesD-1863סספנסיה של 1% ב-1x PBS/phenol red
FM4-64FXInvitrogen/ Molecular ProbesF34653תמיסת מלאי של 5 mM במים
מתילצלולוזMP Biochemicals0215549590
קפילריות זכוכית בורוסיליקטDrummond Scientific3-000-203-G/XOD 1.14 mm, ID 0.53 mm, אורך 3.5 in
תבנית פלסטיק ליצירת תבניותAdaptive Science ToolsTU-1
יחידת מיקרו-הזרקה Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
שובב מיקרו-פיפטות להבאה בלהבה, חריץ פילמנט ברוחב 3.0 mmSutter Instrument Co.P-97, FT330Bייצור מחטים
פינצטה Student Dumont #5Fine Science Tools91150-200.1 x 0.06 mm, קיטום מחטים
סרגל עינית, 5 mm - 100 חלוקותLeica10394771קיטום מחטים
מיקרו-פורג' (Microforge)NarishigeMF-900קיטום מחטים והחלקת להבה
מחט מזרק Tuberculin SlipTipBecton Dickinson3096261 ml, מחט 25G 5/8
מיקרו-ספירות Fluoresbrite YG (2.0 μm)Polysciences, Inc.18338ניתוח מוטיליות מעיים
מיקרוסקופ דיסקציהLeicaS6Eהליך גavage
סטריאו-מיקרוסקופ פלואורסצנציהLeicaM205Cבדיקת מחסום דקסטראן
מיקרוסקופ קונפוקליZeissLSM510דימוי של דקסטראן במחזור הדם

מקורות

  1. Kuhlman, J., Eisen, J. S. Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system. Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).
  2. Pack, M., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  3. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).
  4. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).
  5. Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).
  6. Hama, K., et al. In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).
  7. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).
  8. Rich, A. A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish. Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).
  9. Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut. Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).
  10. Bagnat, M., et al. Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion. Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).
  11. Shepherd, I., Eisen, J. Development of the zebrafish enteric nervous system. Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).
  12. Brugman, S., et al. Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota. Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).
  13. Oehlers, S. H., et al. The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish. Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).
  14. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).
  15. Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish. Zebrafish. 6, 361-376 (2009).
  16. Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study. Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).
  17. Kanther, M., et al. Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract. Gastroenterology. , (2011).
  18. Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).
  19. Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).
  20. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
  21. Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).
  22. Cheesman, S. E., Guillemin, K. We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota. Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).
  23. Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).
  24. Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription. PLoS Genetics. , In Press (2012).
  25. Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).
  26. Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).
  28. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).
  29. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo. Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).
  30. Van Itallie, C. M., et al. The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2. J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).
  31. Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling. Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).
  32. Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).
  33. Rodgers, L. S., Fanning, A. S. Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton. Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).
  34. Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK). J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).
  35. Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder. Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).
  36. Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae. J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).
  37. Rich, A., et al. Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative. 236, 903-911 (2007).
  38. Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae. J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).
  39. Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
  40. Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio. J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).
  41. Clifton, J. D., et al. Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish. PLoS One. 5, e12386(2010).
  42. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  43. Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants. Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Microgavage
Microgavage של זחלי דג זברה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.