העשרה סידורית של גזע Spermatogonial ותאי אב (SSCs) בתרבות לגזירת קווי SSC מאוסים למבוגרים לזמן ארוך

סיכום

שיטה פשוטה לגזור ולשמור גזע spermatogonial ושורות תאי אב מעכברים בוגרים מוצגת כאן. השיטה מנצלת תאים מזינים שמקורם מתא תא סומטי מאשכי העכברים הבוגרים. טכניקה זו היא ישימה זנים נפוצים, כוללים עכבר מהונדס מוחץ, ולדפוק בעכברים.

תקציר

גזע Spermatogonial ותאי אב (SSCs) של האשך מייצגים דוגמה קלסית לתאי גזע של יונקי בוגרים ולשמר פוריות לכמעט כל החיים של בעלי החיים. בעוד המנגנון המדויק ששולט בהתחדשות עצמית ובידול in vivo מאתגר למחקר, מערכות שונות שפותחו בעבר כדי להפיץ SSCs Murine במבחנה באמצעות שילוב של אמצעי תקשורת תרבות מיוחד ותאים מזינים ^1-3.

רוב הגיחות במבחנה לביולוגיה של SSCs שנבעו משורות תאי ילודים, אולי בשל הקושי בהשגת שורות תאי בוגרים ^4. עם זאת, האשך ממשיך להבשיל עד ~ 5 שבועות של גיל ברוב הזנים של עכברים. בתקופה הראשונה שלאחר הלידה, שינויים דרמטיים בארכיטקטורה של האשך ובביולוגיה של תאים והן גופניים spermatogenic, כוללים שינויים ברמות הביטוי של גזע רב הקשור לתאגנים. לכן, קווי SSC נגזרים-neonatally לא יכולים לסכם באופן מלא את הביולוגיה של SSCs המבוגר כי נמשך לאחר האשך המבוגר הגיע למצב יציב.

מספר גורמים שעכבו את הייצור של קווי מבוגרי SSC מבחינה הסטורית. ראשית, חלקם של תאי גזע פונקציונליים עשוי לרדת במהלך הבגרות, או בשל גורמים פנימיים או חיצוניים ^5,6. יתר על כן, כמו בתאי גזע בוגרים אחרים, זה כבר קשה להעשיר SSCs מספיק תאים מאשכים בוגרים כלל ללא שימוש בשילוב של אסטרטגיות מיון immunoselection או אחרות ^7. אסטרטגיות מועסק נפוץ כוללות שימוש בעכברים טמירים כמקור לתאי תורם בשל יחס גבוה יותר של תאי גזע לתאים מסוגים אחרים ^8. בהתבסס על ההשערה כי הסרת תאים הסומטיים מהתרבות הראשונית משבשת אינטראקציות עם נישת תאי הגזע שהם חיוניים להישרדות SSC, פתחו שיטות עבר כדי להפיק ליטר מבוגראינס, שאינו דורש immunoselection או תורמים טמירים אלא להעסיק העשרה סידורית של SSCs בתרבות, המכונה להלן כSESC ^2,3.

השיטה המתוארת להלן כרוכה הליך פשוט לגזירת קווי SSC במבוגרי dissociating תורם המבוגר seminiferous tubules, ואחריו ציפוי של תאים במתקני ההאכלה המורכבות משורת אשכי סטרומה תא (JK1) ^3. דרך סידורי passaging, חזק נדבק, לזהם תאי ניבט שאינו מתרוקנים מהתרבות עם העשרה קשורה של SSCs. תרבויות שנוצרו בדרך זו מכילות תערובת של spermatogonia בשלבים שונים של התמיינות, המכילות SSCs, המבוסס על יכולת התחדשות עצמית לטווח ארוך. עיקרה של שיטת SESC הוא שהוא מאפשר SSCs לבצע את המעבר הקשה מהתחדשות עצמית in vivo להתחדשות עצמית לטווח ארוך במבחנה בmicroenvironment שונה בתכלית, מייצר קווי SSC לטווח ארוך, ללא זיהוםתאים הסומטיים, ובכך מאפשר מניפולציה ניסויית הבאה של SSCs.

פרוטוקול

1. הכנת תאי Feeder

שים לב שכל המגיבים המתוארים להלן צריכים להיות מוכנים בצורה סטרילית (ראה לוחות 1 ו 2). פרוטוקול זה מעסיק שורת תאי JK1 (Cell Biolabs, Inc, קטלוג # CBA-315) כמאכילים שהוא נגזר הפך לתאים בוגרים עכבר אשכים סומטיות וכבר תארו במקום אחר ^3. שימו לב גם שכל הליכי בעלי החיים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות ותקנות מוסדיות.

1. JK1 תאים יכולים להישמר בתרבות ובשמשו בהצלחה כמאכילים עד חלוף 39. תרבות JK1 תאים בצלחת 100 מ"מ תא תרבות (BD פלקון, קטלוג # 353003) עם 10 מ"ל של מדיום גידול מזין מסנן מעוקר-(DMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברי [FBS], 2 מ"מ L-גלוטמין ואנטיביוטיקה). כשמגיעה למפגש התרבות 95%, לפצל את התאים 1:06 -1:10 יחס.
2. הסירו בינוני ממונו תא confluent JK1 מזיןשכבה.
3. שטוף את שכבת תאים פעם עם PBS בלי סידן ומגנזיום.
4. הוסף טריפסין מראש מחומם / EDTA, 1x (trypsin/0.53 mM EDTA 0.05%; קטלוג קורנינג Cellgro, # 25-051-CI), ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 5-10.
5. להשבית טריפסין עם נפח שווה של מדיום גידול מזין. איסוף תאים וסרכזת ב 300 XG למשך 5 דקות. Re-להשעות תאים במדיום גידול מזין.
6. טרום מעייל צלחות רבות גם תא תרבות על ידי הוספת 0.4% פתרון ג'לטין מספיק כדי לכסות היטב ומסירים אחרי 5 דקות בטמפרטורת חדר.
7. צלחת ~ 250 תאים למ"מ ² בצלחת תרבית תאי ג'לטין המצופה (למשל בפורמט 48 היטב או 6-היטב). דגירת תרבות על 37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות.
8. הסר תרבות בינונית מבארות. זהירות: כדי להשבית את גדילת תאים, להוסיף פתרון חדש של mitomycin-C ב 10 מיקרוגרם / מ"ל המדולל בDMEM לכל באר (200 μl למשל / גם לצלחת גם 48). Mitomycin-C היא רעילה. לטפל ולהיפטר ממנו בזהירות. לדגור על37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
9. הסר פתרון mitomycin-C מתאים. לשטוף 3 פעמים עם DMEM לפני ציפוי תאי גזע.
10. הסר DMEM מתאי מזין בארות ולהוסיף את המקור של תאי גזע (100 μl / גם של צלחת גם 48; ראה טבלה 3) מספיק כדי למנוע התייבשות של המאכילים במהלך passaging. הוסף SSCs באותו היום, כפי שיתואר להלן בסעיפי 3.1 או 3.4, באמצעות גדלים מצוינים של בארות המכילות מתקני האכלה.

2. התפרקות של רקמות אשך מאוס להשיג תאי ניבט תורם

1. אשכי קציר מבוגרי עכבר בצורה סטרילית ולאחסן באופן זמני את האשכים בצלחת פטרי מכוסית (ללא נוזל הוסיף). המנה חייבת הניחה מייד על קרח כדי למנוע dessication ולשמור על כדאיויות תא.
2. שימוש במלקחיים עדינים סטריליים ומספרי קנס בברדס תרבית תאים, לעשות חתך רוחבי בalbuginea Tunica ללא חוצה את האשך (כלומר, לחתוך ~ ½ לחלוטין - ¾ מרחק through) ולהשתמש במלקחיים כדי לסחוט tubules seminiferous לפינה של הצלחת; Tunica נזרק ורקמות מצורפות. שמור על צלחת על קרח לאורך לשמור על רקמה מצוננת, ובכך השמירה על שלמותה ומניעת אידוי.
3. מהירות לרכך tubules עם מספריים נאים של האביב לפחות 3 דקות לאשכים, תוך שמירה על צלחת על קרח.
4. לאסוף את שהברים אבובית בצינור חרוטים 50 מ"ל ולשטוף ב~ 40 מ"ל של סרום שור% PBS / 1 מצונן אלבומין.
5. צנטריפוגה XG ב 60 למשך 10 דקות כדי להפריד ברים אבובית מתאי זרע ופסולת. בטל supernatant.
6. בצינור 15 מיליליטר חרוטים, resuspend גלול ב 3 מ"ל לאשך של דיסוציאציה החיץ מראש התחמם (DMEM, טריפסין 0.05%, 0.03% סוג collagenase אני, שור אלבומין 80 U / מ"ל של DNAse אני ו0.5% בסרום; ראה טבלה 2 לפרטים יותר ספציפיים של דיסוציאציה חיץ).
7. הנח את צינור החרוטים אופקיים במתלה בסט שייקר עד 150 סל"ד על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות על מנת למקסםgitation.
8. ספין למטה XG ב 60 למשך 10 דקות לתאים יחידים נפרדים מגושי undissociated.
9. שמור את הגלולה המכילים נתחים עד לשלב הבא. איסוף supernatant מהשלב 2.8 ולהוסיף DMEM/10% סרום 3 מיליליטר עוברים מבקרים לנטרל חיץ דיסוציאציה. הנח צינור על קרח באופן זמני.
10. חזור על השלב 2.6-2.7 עם הגלולה הצילה מצעד 2.9 לנתחים מחדש לעכל שנותרו לאחר השלב 2.8.
11. הוסף נפח שווה של DMEM/10% FBS לנטרל חיץ דיסוציאציה.
12. השעית recombine מצעד 2.11 עם השעית תא הציל מצעד 2.9. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 x גרם.
13. Resuspend גלולה במדיום בתאי גזע בנפח של 16 מ"ל לזוג אשכים (ראה טבלה 3).

3. ציפוי של השעית תא אשכים

1. 2 מיליליטר צלחת של השעית תא להיטב בתאים מזינים 6-כן צלחת המכיל mitotically-להיכבות עם mitomycin-C ומקום בתא תרבות חממה ב 37 &מעלות; C ב 5% CO _2.
2. לאחר 48 שעות בינוניות, aspirate, להוסיף 2 מ"ל בינוני טרי ולחזור לחממה.
3. אחרי 48 שעות, להוסיף 0.5 מ"ל בינוני טריה בתאי גזע לכל באר ולחזור לחממה.
4. לאחר 48 שעות, לאחר מכן להאכיל את התאים שלוש פעמים בשבוע לאחר מכן, כמפורט להלן עד מושבות גדולות, דיסקרטיות (> 50 תאים) מופיעות (תוך 7 עד 21 ימים). להאכלה ראשון והשני בכל שבוע (למשל יום שני ויום רביעי) להסיר ~ 50% הבינוניים ולהוסיף 50% בחזרה על ידי נפח בינוני טריה. להאכלה שלישית (לדוגמא יום שישי), לשאוב כל המדיום ולהחליף עם 2 מ"ל בינוני טריה. גישה זו מבוססת על הנימוק שהימנעות משינויים בינוניים מלאים ממזערת תנודות בריכוזים של אותות paracrine שמופרשים למדיום התרבות ^9.

4. קטיף מושבה למעבר ראשון

1. הסר בינוני ממושבות בארות המכילות להיות passaged ולהוסיף את מקור תאי גזע טרי.
2. זהה את המושבות באמצעות אובייקטיבי 10x. עם מיקרוסקופ מעט דה ממוקדת, מושבות SSC בקצה גם תופענה כגושים בהירים הומוגניים, מורכבים מהרבה תאי 11-12 קוטר מיקרומטר, שבם קשה או בלתי אפשרי להבחין בגבולות התא הבודדים, שכן התאים מופיע התמזג יחד (איור 1 א). מושבות ללא SSC עשויות להופיע כהות יותר, מפורטות יותר, או פחות הומוגני, ניתן להבחין בגבולות (איור 1 א, הבלעה).
3. באמצעות קצה פיפטה 200 μl, עם סט pipetteman עד 50 μl, לקחת 1 עד בינוני מהבאר ולגרש להרטיב את הקצה. ואז, בעדינות לדחוף את המושבה עם הקצה לפני הנסיגה של 50 μl בינוני במהירות כדי לסלק את המושבה על ידי יניקה לקצה (1B איור).
4. לגרש את המדיום המכיל את המושבה לאחת גם בצלחת 48-גם מזין המכילה תאים מומתים עם 100 μl של מדיום תאי גזע (האיור 1C).
5. חזור על שלב4.3 ולהוסיף עד 8 מושבות לאותו גם בלי העולה על 500 μl לטוב.
6. חזור על שלבים 4.3-4.5 להכין בארות נוספות של הצלחת גם 48 עם מושבות קטע אחד SSC.
7. הוולס יהיה מוכן לפצל ב7-14 ימים או אחרי גושים גדולים של עד 500 תאים צמחו (1D איור).

5. לאחר ההרחבה וPassaging של SSCs ידי טחינה דקה

1. תאים בקטע אחד יש subcultured על מתקני האכלה טריים לאחר עד 14 יום בביחס פיצול של 01:02 ל3 הקטעים הראשונים ולאחר מכן 1:04-01:06 (כל 7 ימים) לאחר מכן כדלקמן. עדינות triturate מושבות off היטב למחצה confluent (למשל ~ 300.000 SSCs / היטב צלחת 6-היטב) עם טיפ 1 מיליליטר פיפטה ידי שטיפה בינונית על פני התאים. מושבות ניתן לראות ניתוק. יותר מדי כוח עם הזרם של נוזל יגרום לתאים מזינים בלתי רצויים לבוא גם ממנו.
2. איסוף תאים נכתשו בצינור וצנטריפוגה חרוטים ב 300 XG עבור5 דקות. הערה: צעד trypsinization ניתן להוסיף בבטחה כאן אם רצוי על ידי החוקר.
3. לשאוב supernatant מחדש להשעות במדיום תאי גזע טרי על ידי pipetting יסודיות למעלה ולמטה כדי לשבש מושבות.
4. SSCs צלחת על תאים מזינים טרייה מומתים עם mitomycin-C כמתואר בסעיף 1.
5. להאכיל את התאים שלוש פעמים בשבוע, כמפורט להלן. להאכלה ראשונה ושנייה (לדוגמא יום שני ורביעים) להוסיף 50% לפי נפח בינוני טריה. להאכלה שלישית (לדוגמא יום שישי), לשאוב כל המדיום ולהחליף עם 2 מ"ל בינוני טריה. צלחות תהפוכנה confluent כעבור 7-10 ימים. תרבויות צריכות להיות מורכבות מתאים> 98% ניבט (כלומר, תאים <1% מזהמים גופניים) אחרי 5-7 קטעים, המבוססים על immunostaining (למשל באמצעות העכברי ניבטו תא סמן GCNA) כדי להבדיל תאי ניבט מתאים הסומטיים ^10. הערה: שיטות אלו פותחו בעמידה בתקנות ובדרישות שנקבעו על ידי המכוןטיפול בבעלי חיים ואל הוועדה השתמש ב-Weill Cornell Medical College.

תוצאות

הופעתו של זן בר חלוף אפס, מושבות בוגרות SSC לאחר 7 ימים מוצגת באיור 1. מושבות תלת ממדיות מורכבות משכבה של תאים שטוחים המחוברים למתקני ההאכלה או המטריצה ​​זוטרה תאית שהפקידו את מתקני ההאכלה בשכבות מרובות של SSCs גידול בראש. בעוד SSCs הבריא הם בהיר ואחיד refractile 11-12 קוטר מיקרומטר, את גבולות התא הם קשים להבחין והגודל של המושבות עשוי להיות שונה מאוד, היא בתוך הבאר ובין בארות שהוכנו מעכברים שונים. ויזואליזציה של המושבות נעזרה במיקרוסקופ שלב עם תצוגה דיגיטלית ומוקד...

דיון

שיטה זו להפקת SSCs המבוגר באמצעות תאים מזינים המופקים מאשך למבוגרים היא חזקה והצליחה כאשר רקע גנטי משותף (למשל FVB, C57Bl6 ו129SV/C57Bl/6 המעורב) וזנים מוטנטים שונים הועסקו ^2,3,7,14. למעשה, microenvironment נוצר על ידי מערכת התרבות הוא מספיק כדי להתגבר על כמה מהמחסומים הגנטיים לשמירת SSCs המבוגר in vivo (למשל, במקרה של plzf ^{- / -} חיות) ^7. בעוד אנו מעסיקים JK1 תאים כניזונים, תאים שאינם הופכים למבוגרים בלבד, אשכים גופניים יכולים לשמ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב / חומרים	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
DMEM	קורנינג	10-013	Diluent לניתוק חיץ
טריפסין / EDTA	Mediatech	25-051-CI
בינוני בסיס תאי גזע (StemPro-34)	חי טכנולוגיות	10639-011	דורש תוספת לפי Shinohara et al. (2003) *
גזע תוספים בינוניים סלולריים	שונה	ראה טבלה 3	דורש תוספת לפי Shinohara et al. (2003) *
JK1 תאים	תא Biolabs, Inc	CBA-315	יכול להחליף עם תאי סטרומה אשכי מבוגרים כלSeandel et al. (2007)
mitomycin-C (זהירות)	סיגמה אולדריץ	M4287	רעיל; טפל בזהירות.
ג'לטין	סיגמה אולדריץ	G1890	0.4% פתרון במים
EVOS xl דיגיטלי מיקרוסקופ ההפוך	קבוצה מיקרוסקופית מתקדמת	-
			טבלת 1. ריאגנטים וציוד ספציפיים. * ראה טבלה 3
DMEM	קורנינג	10-013	Diluent לניתוק חיץ
טריפסין (1:250)	חי טכנולוגיות	27250-018	דיסוציאציה חיץ: 0.05% סופיים wt / כרך
collagenase, הקלד, 235 U / ml	וורטינגטון	CLS1 235	דיסוציאציה חיץ: 0.03% סופיים wt / כרך
אני DNAse	Sigmאולדריץ	DN25	דיסוציאציה חיץ: גמר 80 U / ml
שור אלבומין	ICP יו	ABRE-100g	דיסוציאציה חיץ: 0.5% סופיים wt / כרך
			טבלה 2. דיסוציאציה חיץ
StemPro-34 SFM	חי טכנולוגיות	10639-011
StemPro-34 תוסף תזונתי	חי טכנולוגיות	10639-011
תוספים נוספים **
חומצות אמינו לא חיוניות	סיגמה אולדריץ	M7145	1X
פתרון MEM ויטמין	חי טכנולוגיות	11120-052	1X
L-גלוטמין	Mediatech	25-005	2 מ"מ
שור אלבומין	ICP יו	ABRE	0.50%
פתרון לאנטיביוטיקה Antimycotic	Mediatech	30-004-CI	1X
D (+) גלוקוז	סיגמה אולדריץ	G8769	6 מ"ג / מ"ל
β-אסטרדיול	סיגמה אולדריץ	E2758	30 ng / ml
פרוגסטרון	Calbiochem	5341	60 ng / ml
סרום שור עוברי	משתנה	n /	1%
שור הולוגרמות transferrin	סיגמה אולדריץ	T1283	100 מיקרוגרם / מ"ל
אינסולין	ג'מיני Bio-מוצרים	700-112P	25 מיקרוגרם / מ"ל
GDNF האנושי	החיים technologies	PHC7041	10 ng / ml
bFGF האנושי	חי טכנולוגיות	PHG0023	10 ng / ml
העכבר EGF	חי טכנולוגיות	PHG0313	20 ng / ml
פוטרסין	Organics מחקר	0778P	60 מיקרומטר
סלניום	סיגמה אולדריץ	S5261	30 ננומטר
חומצת pyruvic	אלפא Aesar	A13875	30 מיקרוגרם / מ"ל
חומצה לקטית DL-	JT בייקר	0196-04	1 מיקרוגרם / מ"ל
β-mercaptoethanol	חי טכנולוגיות	21985-023	50 מיקרומטר
חומצה אסקורבית	סיגמה אולדריץ	A4544	100 מיקרומטר
D-ביוטין	סיגמה אולדריץ	B4639	10 מיקרוגרם / מ"ל
			לוח 3. גזע בינוני תא
			* הערה: הוספת תוספים מתחת לפני שימוש בינוני. סננו לעקר ולשמור אותו ב 4 ° C. הבינוני הוא יציב במשך לפחות 2 שבועות.
			** יש לנו מועסקים יצרנים שונים, פורמולציות, ו / או מספרים הרבה ריאגנטים אלה ללא כל השפעות מזיקות לכאורה. באופן כללי, ריאגנטים כיתת תרביות תאים צריכים להיות מועסקים.