הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

סיכום

אנו מתארים רזולוצית סופר שיטת הדמיה כדי לבחון את המבנה הארגוני של FtsZ טבעת החיידקים, מנגנון חיוני לחלוקת תא. שיטה זו מבוססת על ניתוחים כמותיים של מיקרוסקופיה תמונות לוקליזציה photoactivated (PALM) ויכולה להיות מיושמת על חלבוני cytoskeletal חיידקים אחרים.

תקציר

חלוקת תא חיידק דורשת הרכבה המתואמת של יותר מעשרה חלבונים חיוניים בmidcell ^1,2. מרכזי לתהליך זה הוא ההיווצרות של suprastructure דמוי טבעת (Z-טבעת) על ידי חלבון FtsZ בתכנית חלוקת ^3,4. Z-הטבעת מורכבת מprotofilaments FtsZ היחיד תקוע המרובים, וההבנה שההסדר של protofilaments בתוך Z-הטבעת תספק תובנה לתוך המנגנון של הרכבת Z-טבעת ותפקודו כמחולל כוח ^5,6. מידע זה נותר חמקמק בשל מגבלות נוכחיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי במיקרוסקופ אלקטרונים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי אינו יכול לספק תמונה ברזולוציה גבוהה של Z-הטבעת בשל גבול השתברות אור (~ 200 ננומטר). אלקטרוני cryotomographic הדמיה זיהתה מפוזרת protofilaments FtsZ בג הקטן תאי crescentus ^7, אבל קשה ליישם לתאים גדולים יותר כגוןחיידק או B. subtilis. כאן אנו מתארים את היישום של שיטת מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוצית סופר, מיקרוסקופי לוקליזציה Photoactivated (PALM), כדי לאפיין כמותית הארגון המבני של ה coli Z-טבעת ^8.

PALM הדמיה מציעה היא ברזולוציה מרחבית גבוהה (~ 35 ננומטר) וסימון ספציפי כדי לאפשר זיהוי חד משמעי של חלבוני היעד. אנחנו מתויגים FtsZ עם mEos2 photoactivatable ניאון החלבון, אשר עובר מהירוק פלואורסצנטי (עירור = 488 ננומטר) לאדום פלואורסצנטי (עירור = 561 ננומטר) עם הפעלה ב405 ננומטר ^9. במהלך ניסוי PALM,-mEos2 FtsZ מולקולות בודדות מופעלות stochastically ועמדות centroid המקבילות המולקולות הבודדות נקבעות עם <דיוק ננומטר 20. תמונה ברזולוצית סופר של Z-טבעת אז שוחזר על ידי superimposing את העמדות של כל centroid-mEos2 FtsZ המולקולות זוהו. <כיתת p = "jove_content"> שימוש בשיטה זו, מצאה כי Z-הטבעת יש רוחב קבוע של ~ 100 ננומטר והוא מורכב מצרור רופף של protofilaments FtsZ חופפים זה לזה בשלושה ממדים. נתונים אלה מספקים קרש קפיצה לחקירות נוספות של השינויים התלויים מחזור התא של ^Z-10 הטבעת ויכולים להיות מיושמים לחלבונים אחרים של עניין.

פרוטוקול

1. לדוגמא הכנה

1. לחסן תקשורת LB עם מושבה בודדה של זן JB281 [BW25113 / pJB042 (P _אק: FtsZ-mEos2)]. לגדול בלילה שייקר על 37 ° C.
2. דלל את תרבות 1:1,000 לM9 ⁺ תקשורת מינימאליים [מלחי M9, גלוקוז 0.4%, 2 מ"מ, ₄ MgSO 0.1 המ"מ CaCl _2, חומצות אמינו ויטמינים וממ] ותגדל לשלב יומן האמצע-(OD ₆₀₀ = 0.2-0.3) בנוכחות chloramphenicol (150 מיקרוגרם / מ"ל) בטמפרטורת חדר (RT).
3. לגרום לתרבות עם 20 מיקרומטר IPTG ל2 שעות (ראה הערת המס '1).
4. תרבות גלולה בmicrocentrifuge (8,000 סל"ד, דקות 1) וresuspend בנפח שווה של M9 ^+; חוזרת. לאחר resuspension השני, להמשיך את הצמיחה בRT עבור 2 שעות.
5. תקן את התרבות מושרה עם paraformaldehyde 4% ב PBS (pH = 7.4) בRT עבור 40 דקות. תרבות גלולה וresuspend בנפח שווה של PBS; חוזר. אם תאים חיים הדמיה, דלג קיבעון, תרבות גלולה, וResuspend עם נפח שווהשל M9 ^- [מלחי M9, גלוקוז 0.4%, 2 המ"מ ₄ MgSO, 0.1 המ"מ CaCl _2, חומצות אמינו ממ]; חוזרים.
6. דלל חרוזי זהב 1:10 עם תרבות resuspended. החל מדגם לחדר הדמיה שהוכן (ראה שלב 2.4).

הערה [1]: פרוטוקול האינדוקציה לעיל (1.1-1.3 צעדים) כבר מותאם למערכת הביטוי של זן JB281. תנאי אינדוקציה מפורטות עשויים להשתנות בהתאם למערכות אחרות ביטוי או חלבונים של עניין.

2. אסיפה של לשכת ההדמיה

1. הפוך 3% (w / v) פתרון agarose בM9 ^-. ממס agarose על 70 מעלות צלזיוס בבלוק חום עליון ספסל עבור 40min. החנות נמסה agarose ב 50 מעלות צלזיוס למשך עד 5 שעות.
2. הנח שקופית microaqueduct נקיה במחצית העליונה של חדר הדמיה עם אלקטרודות פונות מטה. יישר את האטם התחתון בשקופית microaqueduct כך שתכסה את ערוצי זלוף.
3. תחול ~ 50 μl של agarose נמס למרכז הזכוכיתשקופית. מייד עליונת טיפת ג'ל agarose עם coverslip נקי ויבש. אפשר ג'ל לגיבושו RT למשך 30 דקות.
   1. כדי לנקות coverslips: לארגן coverslips במכל קרמיקה וsonicate במשך 20 דקות בסיבוב אמבטיות של אצטון, אתנול ו1M KOH בצנצנות זכוכית. חזור על התרגיל שלוש פעמים במחזור, עבור סכום כולל של 9 sonications, ואחרי sonication יחיד בDH ₂ O. אחסן את coverslips ניקה בד"ה הטריה ₂ O. לפני שימוש, לפוצץ coverslips היבש עם אוויר מסונן.
4. מוציא בזהירות את coverslip, עוזב כרית ג'ל בשקופית microaqueduct. מייד להוסיף μl 1 מתוך מדגם תרבית תאים (ראה שלב 1.6) לראש כרית ג'ל. חכה ~ 2 דקות, המאפשר פתרון לייקלט על ידי כרית ג'ל. כרית ג'ל למעלה עם coverslip חדש נקי ויבש. להרכיב את חדר ההדמיה השלמה בהתאם להוראות יצרן.

3. יבוא תמונות

1. הפעל מיקרוסקופ, המצלמה ולייזרים. פתח MetaMorph רךהכלי (התקנים מולקולריים).
2. הנח מסנני עירור / פליטה מתאימים בדרך ההדמיה (איור 1).
3. הגדרת סמכויות והגדרות ליזר רכישה בהתאם.
   1. 488-nm ליזר = 15 mW (ראה הערת המס '2)
   2. 561-nm הליזר = 75 mW
   3. 405 ננומטר הליזר = 2 mW ± מסנן צפיפות ניטראלי (ראה הערת המס '3)
4. נעילת תא הדמיה לבמה באמצעות מתאם השלב המשלים.
5. לייעד אזור הדמיה מתאימה (100x100 פיקסלים), כי הוא האיר homogenously על ידי כל השלושה הלייזרים.
6. זהה את אזור מדגם המכיל שני תאים וסמני fiducial (חרוזי זהב) בסמיכות אך לא חופפים.
7. פוקוס על פני השטח של תאים הקרובים ביותר לcoverslip. לרכוש תמונת brightfield עם זמנו 50 מילי אינטגרציה והעברת המוקד 0.5 מיקרומטר לתוך המדגם (איור 3Ai).
8. לרכוש תמונה פלואורסצנטי ירוקה הרכב עם עירור מ488-n מ 'ליזר באמצעות זמן אינטגרצית ms 50 (איור 3Aii).
9. לרכוש הזרמת וידאו במסלול אדום עם תאורה רציפה מ 405 ננומטר ולייזרים 561-nm. לתאים קבועים, שיעור 50 מילי מסגרת משמש עבור סכום כולל של 20,000 מסגרות (~ 17 דקות סך הכל) עם כוח הליזר 405 ננומטר ramped ידי ~ 10% כל 1,000 מסגרות (ראה הערת המס '4). לתאים חיים, שיעור של 10 אלפיות מסגרת משמש עבור סכום כולל של 3,000 מסגרות (סה"כ ~ 30 ים) בכוח ליזר מתמיד 405 ננומטר.
10. להעביר את המיקוד בחזרה למשטח התחתון של התאים ולרכוש תמונה אחרת brightfield כמו בשלב 3.7.

[2] הערה: העצמה המשולבת של הקרינה הירוקה של תא עומדת ביחס ישר למספר הכולל של mEos2 FtsZ מולקולות לידי ביטוי בתא. כוח העירור 488-ננומטר והגדרות רכישה פלואורסצנטי הרכב חייבים להישמר קבוע לכל התאים כך שיחסית FtsZ-mEos2 רמות ביטוי בתאים שונים ניתן להשוות.

ontent "> [3] הערה:. תאים קבועים הם צלמו עם צפיפות הניטראלית (ND) המסנן (1 איור, רכיב אופטי # 5) במקום על מנת להשיג שיעור הפעלה איטי, כך שכל מולקולה בודדה ניתן לזהות במדויק מסנן ND מוסר כאשר הדמיה לחיות תאים להגביר את קצב ההפעלה, תוך שמירה על סבירות נמוכה של שתי מולקולות שהופעלה בו זמנית באזור עקיפה מוגבלת. הקצב המהיר להחיל הדמיה לחיות תאים נדרש כדי להקטין את זמן הרכישה הכולל, כך "הקפאה" Z-הטבעת בזמן ובכך מגביל את ההשפעה של ניזקי שמש לתא.

[4] הערה: המספרים של מסגרות שנרכשו היו מותאמים למערכת שלנו ותלויים במבנה התאי המסוים, תיוג צפיפות, קצב הפעלה ואם למצות את כל המאגר של fluorophores חשובים לניתוח. בתאים חיים, חשוב לקבל מספר מספיק של מגויר בתקופה קצרה של TIככל האפשר כדי למנוע את הטשטוש של התמונה עקב תנועה של המבנה התאי.

4. בניית תמונת PALM

1. קביעת מיקום של כל נקודה centroid זוהה.
   1. טען את ערימת התמונה לתוך Matlab (MathWorks, Inc).
   2. חתוך את ערמת התמונה לאזור שסביב תא אחד שאינו כולל את כל חרוזי fiducial.
   3. בחר סף עצמה לאיתור מקום שנמצא מעל רמת הרקע, אך מתחת לממוצע עוצמת המקום. אנו מהווים וריאציה ברמת רקע לאורך כל ניסוי על ידי החישוב הממוצע פועל עוצמתו המרבית באמצעות חלון מסגרת 150. סף העצמה לכל מסגרת ואז אינטרפולציה מהערכים הממוצעים הריצה.
   4. חיסור הסף המתאים מכל מסגרת. כתמים פוטנציאליים מזוהים כשלושה פיקסלים סמוכים עם עוצמות מעל הסף.
   5. התאם את עוצמת הקרינה של כל מקום פוטנציאלי לGaussia דו ממדיםפונקצית n [משוואת # 1] באמצעות אלגוריתם ריבועים לפחות קוי (איור 2). דיוק הלוקליזציה של כל נקודה מחושב לפי המספר הכולל של פוטונים שאותרו [המשוואה # 2]. כל נקודה גרועה כושר, עם דיוק לוקליזציה יותר מ 20 ננומטר (תאים קבועים) או 45 ננומטר (תאי חיים) נמחקה (ראה הערת המס '5). כל נקודה בעצמה גדולה יותר מכפול מממוצע העצמה, אולי בשל emitters החופף, גם מושלכת.
   6. לתאים קבועים, להסיר תצפיות חוזרות ונשנות של אותה המולקולה על ידי התעלמות מכל נקודה שהיא בעמדת centroid 45 ננומטר מכל נקודה אחרת שקדמה לו על ידי 6 מסגרות או פחות. לתאי חיים, את כל הנקודות נשמרות.
2. כייל להיסחף מדגם באמצעות תנועת הסמן fiducial.
   1. גזירת אזור פיקסל 10x10 סביב סמן fiducial.
   2. חיסור הסף המתאים שנקבע ב4.1.3 מכל מסגרת.
   3. מתאים לפרופיל בכל העוצמתמסגרת באמצעות אלגוריתם מתאים לפחות בהנחה מרובע צורת גאוסי דו ממדים.
   4. לחשב תזוזה בין העמדות ביחס למסגרת 1 centroid.
3. תקן את עמדת centroid של כל מולקולה ייחודית מזוהית עם 4.1 בסחף המדגם המתאים מחושב ב4.2. השווה את תמונות brightfield נרכשו ב3.7 ו 3.10. אם תאים הם נצפו לנוע זה ביחס לסמני fiducial, הנתונים נזרקים החוצה.
4. להרכיב את כל עמדות centroid המתוקנות על תמונה אחת מורכבת מפיקסלים ננומטר 15X15. עלילה כל מולקולה ייחודית כיחידה באזור פרופיל, דו ממדי Gaussian המרוכז בעמדת centroid עם סטייה שווה לדיוק הלוקליזציה [המשוואה # 2] סטנדרטית. התוצאה היא מפת צפיפות הסתברות, שבו עוצמתו של פיקסל היא פרופורציונלית לסיכוי למצוא מולקולה שבפיקסל (איור 3Aiv).
5. השוואה בין תמונות PALM לתמונות הרכב.
   1. Replot centroתפקידים כאיד ב4.4, אבל במישור באמצעות 150X150 פיקסלים ננומטר וסטייה שווה ל 250 ננומטר סטנדרטית. זה יוצר תמונת PALM שמחקה תמונת התאבכות מוגבלת, אשר ניתן להשתמש כדי להשוות, תמונת ההרכב עקיף המוגבלת שנרכשה ב3.8 (האיור 3Aiii).
   2. כדי לאשר כי המולקולות שהתגלו הן נציג של כל האוכלוסייה, להשוות את תמונת ההרכב המשוחזרת (האיור 3Aiii, צעד 4.5.1) עם תמונת ההרכב הניסיונית פלואורסצנטי (איור 3Aii, צעד 3.8) כדי לאשר ששתי התמונות מראות מבנים של צורה דומה , התמצאות ועצמה יחסית.

[5] הערה: דיוק הלוקליזציה המינימאלית הנדרש נקבע באופן אמפירי לכל שיטת הדמיה ידי התוויית את precisions של כל המולקולות למדגם נתון ובחירת חיתוך מתאים.

5. ניתוח תמונת PALM

1. מדידת Z-טבעת Widtח וקוטר.
   1. לסובב את תמונת PALM כדי להתמצא אנכי על ציר זמן של התא (איור 4 א).
   2. גזירת האזור תאי המכיל את Z-הטבעת.
   3. לחשב את העצמה המצטברת באמצעות הקרנת פרופיל אינטנסיביות לאורך הציר הארוך של התא.
   4. מתאים לפרופיל העצמה להפצת גאוס. רוחב הטבעת מוגדר כמרבי מלאת רוחב המחצית (FWHM) של התפלגות גאוס המצוידת (איור 4 ב).
   5. פרויקט פרופיל העצמה המצטברת של 5.1.2 לאורך הציר הקצר של התא. קוטר הטבעת מוגדר כאורך המלא של פרופיל העצמה (האיור 4C).
2. זומם צפיפות FtsZ (ראה הערה # 6).
   1. Replot עמדות centroid כב( 4.4), אך ללא פרופיל כזה, כי כל מולקולה ייחודית ניתן ערך של 1 והוקצתה לפיקסל המתאים לעמדת centroid אחת גאוס. בדרך זו, את עוצמתו של כלפיקסל מייצג את המספר הכולל של מולקולות שהתגלו בפיקסל. תמונת PALM הצפיפות יכולה גם להיות דמיין כמו עלילת מתאר (האיור 5E).
3. קביעת רזולוציה מרחבית.
   1. רזולוציה מרחבית תיאורטית-ברת השגה: ליצור נציג כוחות הביטחון פלסטיני לכל המדגם באמצעות דיוק הלוקליזציה הממוצעת הנחוש של כל המולקולות אותרו ולחשב FWHM (משוואת המס '3).
   2. רזולוציה מרחבית הושגה-בניסוי: לחשב את התזוזה הממוצעת בין תצפיות חוזרות של אותה המולקולה.

[6] הערה: השתמשתי PALM השתקפות הפנימית המוחלט (TIR-PALM, איור 1 ו 5) כדי להגביל את ההפעלה והעירור לשכבה דקה (~ 200 ננומטר) מעל לממשק התא / זכוכית. כך שמולקולות FtsZ רק קשורים בקרום הקרוב ביותר לcoverslip תזוהינה.

תוצאות

באיור 3Aiv הוא עיבוד דו ממדים, ברזולוצית הסופר של Z-הטבעת שנוצרה משיטת הדמית PALM שתוארה לעיל. להלן אבקש לסכם מידע איכותי וכמוני, שניתן להשיג אותם.

איכותי, ראה שZ-הטבעת היא מבנה לא סדיר, המאמץ תצורות מרובות (להקה יחידה או קשת סליל) שאינן מובחנים בתמונות פלואורסצנציה קונבנציונליות (איור 3A-להשוות Dii וד). תצפיות כגון אלה יכולים לשמש כדי לקבוע אחוזים מאוכלוסיית התא שמציגה תצורה מבנ...

דיון

תמונות PALM מכילות מידע אודות ספירת מולקולה ועמדות בתוך תא, המאפשרים ניתוח מפורט של החלוקה והסידור של מולקולות חלבון המטרה שקשה להשיג באמצעים אחרים. להלן מתארים אמצעי זהירות שיש לנקוט כדי לחלץ מידע כמוני מדויק תוך שמירה על רלוונטיות הביולוגיות של תמונות PALM. אנחנו גם לחקור את המידע שניתן להשיג באמצעות תאי חיים טובים לעומת קבועים. לבסוף, אנו מציעים דרכים להשגת מידע רזולוצית סופר נוסף על מכונות חלוקת התא.

השיטה שת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב / חומרים	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
50 x MEM חומצות אמינו	סיגמא	M5550
100 x MEM ויטמינים	סיגמא	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16% Paraformaldehyde	אלקטרוני מדעי Micrsocopy	15710-S
SeaPlaque GTG agarose	Lonzo	50111
50 חרוזי זהב ננומטר	Microspheres-nanospheres	790113-010
FCS2 הדמיה קאמרית	BIOPTECHS
מתאם שלב	אסי	I-3017
מיקרוסקופ ההפוך	אולימפוס	IX71
1.45 NA, מטרת 60x	אולימפוס
מצלמת iXon EMCCD	תידור טכנולוגיה	DU897E
488-nm ספיר ליזר	קוהירנט
561-nm ספיר ליזר	קוהירנט
ליזר CUBE 405 ננומטר	קוהירנט