הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Summary

אנו מתארים רזולוצית סופר שיטת הדמיה כדי לבחון את המבנה הארגוני של FtsZ טבעת החיידקים, מנגנון חיוני לחלוקת תא. שיטה זו מבוססת על ניתוחים כמותיים של מיקרוסקופיה תמונות לוקליזציה photoactivated (PALM) ויכולה להיות מיושמת על חלבוני cytoskeletal חיידקים אחרים.

Abstract

חלוקת תא חיידק דורשת הרכבה המתואמת של יותר מעשרה חלבונים חיוניים בmidcell ^1,2. מרכזי לתהליך זה הוא ההיווצרות של suprastructure דמוי טבעת (Z-טבעת) על ידי חלבון FtsZ בתכנית חלוקת ^3,4. Z-הטבעת מורכבת מprotofilaments FtsZ היחיד תקוע המרובים, וההבנה שההסדר של protofilaments בתוך Z-הטבעת תספק תובנה לתוך המנגנון של הרכבת Z-טבעת ותפקודו כמחולל כוח ^5,6. מידע זה נותר חמקמק בשל מגבלות נוכחיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי במיקרוסקופ אלקטרונים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי אינו יכול לספק תמונה ברזולוציה גבוהה של Z-הטבעת בשל גבול השתברות אור (~ 200 ננומטר). אלקטרוני cryotomographic הדמיה זיהתה מפוזרת protofilaments FtsZ בג הקטן תאי crescentus ^7, אבל קשה ליישם לתאים גדולים יותר כגוןחיידק או B. subtilis. כאן אנו מתארים את היישום של שיטת מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוצית סופר, מיקרוסקופי לוקליזציה Photoactivated (PALM), כדי לאפיין כמותית הארגון המבני של ה coli Z-טבעת ^8.

PALM הדמיה מציעה היא ברזולוציה מרחבית גבוהה (~ 35 ננומטר) וסימון ספציפי כדי לאפשר זיהוי חד משמעי של חלבוני היעד. אנחנו מתויגים FtsZ עם mEos2 photoactivatable ניאון החלבון, אשר עובר מהירוק פלואורסצנטי (עירור = 488 ננומטר) לאדום פלואורסצנטי (עירור = 561 ננומטר) עם הפעלה ב405 ננומטר ^9. במהלך ניסוי PALM,-mEos2 FtsZ מולקולות בודדות מופעלות stochastically ועמדות centroid המקבילות המולקולות הבודדות נקבעות עם <דיוק ננומטר 20. תמונה ברזולוצית סופר של Z-טבעת אז שוחזר על ידי superimposing את העמדות של כל centroid-mEos2 FtsZ המולקולות זוהו. <כיתת p = "jove_content"> שימוש בשיטה זו, מצאה כי Z-הטבעת יש רוחב קבוע של ~ 100 ננומטר והוא מורכב מצרור רופף של protofilaments FtsZ חופפים זה לזה בשלושה ממדים. נתונים אלה מספקים קרש קפיצה לחקירות נוספות של השינויים התלויים מחזור התא של ^Z-10 הטבעת ויכולים להיות מיושמים לחלבונים אחרים של עניין.

Protocol

1. לדוגמא הכנה

1. לחסן תקשורת LB עם מושבה בודדה של זן JB281 [BW25113 / pJB042 (P _אק: FtsZ-mEos2)]. לגדול בלילה שייקר על 37 ° C.
2. דלל את תרבות 1:1,000 לM9 ⁺ תקשורת מינימאליים [מלחי M9, גלוקוז 0.4%, 2 מ"מ, ₄ MgSO 0.1 המ"מ CaCl _2, חומצות אמינו ויטמינים וממ] ותגדל לשלב יומן האמצע-(OD ₆₀₀ = 0.2-0.3) בנוכחות chloramphenicol (150 מיקרוגרם / מ"ל) בטמפרטורת חדר (RT).
3. לגרום לתרבות עם 20 מיקרומטר IPTG....

Results

באיור 3Aiv הוא עיבוד דו ממדים, ברזולוצית הסופר של Z-הטבעת שנוצרה משיטת הדמית PALM שתוארה לעיל. להלן אבקש לסכם מידע איכותי וכמוני, שניתן להשיג אותם.

איכותי, ראה שZ-הטבעת היא מבנה לא סדיר, המאמץ תצורות מרובות (להקה יחידה או קשת סליל) שאינן מובחנים בתמונות פלואורסצנציה קונבנציונליות (איור 3A-להשוות Dii וד). תצפיות כגון אלה יכולים לשמש כדי לקבוע אחוזים מאוכלוסיית התא שמציגה תצורה מבנ.......

Discussion

תמונות PALM מכילות מידע אודות ספירת מולקולה ועמדות בתוך תא, המאפשרים ניתוח מפורט של החלוקה והסידור של מולקולות חלבון המטרה שקשה להשיג באמצעים אחרים. להלן מתארים אמצעי זהירות שיש לנקוט כדי לחלץ מידע כמוני מדויק תוך שמירה על רלוונטיות הביולוגיות של תמונות PALM. אנחנו גם לחקור את המידע שניתן להשיג באמצעות תאי חיים טובים לעומת קבועים. לבסוף, אנו מציעים דרכים להשגת מידע רזולוצית סופר נוסף על מכונות חלוקת התא.

השיטה שת.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב / חומרים	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
50 x MEM חומצות אמינו	סיגמא	M5550
100 x MEM ויטמינים	סיגמא	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16% Paraformaldehyde	אלקטרוני מדעי Micrsocopy	15710-S
SeaPlaque GTG agarose	Lonzo	50111
50 חרוזי זהב ננומטר	Microspheres-nanospheres	790113-010
FCS2 הדמיה קאמרית	BIOPTECHS
מתאם שלב	אסי	I-3017
מיקרוסקופ ההפוך	אולימפוס	IX71
1.45 NA, מטרת 60x	אולימפוס
מצלמת iXon EMCCD	תידור טכנולוגיה	DU897E
488-nm ספיר ליזר	קוהירנט
561-nm ספיר ליזר	קוהירנט
ליזר CUBE 405 ננומטר	קוהירנט