Assay השביט הוא דרך יעילה לאיתור הפסקות בודדות וגדיל כפול, לרבות אתרים אלקלי רופפים וDNA-DNA/DNA-protein-קישורי צלב שעל ה-DNA בכל התאים, כוללים נוירונים ביפוקמפוס. השיטה מנצלת את הגירת ההפרש של ה-DNA בשדה חשמלי בשל הבדלים בכמות הניזק לדנ"א.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Assaying ניזק לדנ"א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט
במאמר זה
סיכום
תקציר
מספר התרופות למקד את מסלולי תיקון DNA ולגרום לתא הורג על ידי יצירת ניזק לדנ"א. לפיכך, תהליכים ישירות למדידת ניזק לדנ"א נבדקו בהרחבה. שיטות מסורתיות הן זמן, משאבים רבים, יקרים אינטנסיביים ודורשות תאים משתכפלים. לעומת זאת, בדיקת השביט, assay אלקטרופורזה ג'ל תא בודד, הנה אמצעי מהיר, לא פולשנית, זול, ישיר ורגיש של ניזק לדנ"א ותיקון. כל הצורות של ניזק לדנ"א, כמו גם תיקון DNA יכולות להיות דמיינו ברמת התא הבודדה באמצעות טכניקה זו עצמה.
העיקרון העומד ביסוד assay השביט הוא שדנ"א שלם הוא הורה מאוד ואילו ניזק לדנ"א משבש את הארגון הזה. מחלחל לתוך DNA הפגום agarose המטריצה וכאשר נתון שדה חשמלי, ה-DNA הטעון שלילי נודד לכיוון הקתודה הטעונה במטען חיובי. את גדילי הדנ"א הניזוק הגדולים אינם מסוגלים להעביר רחוק מהגרעין. ניזק לדנ"איוצר מקטעי דנ"א קטנים שנוסעים רחוק יותר מאשר ה-DNA בשלמותה. השביט Assay, תוכנת תמונת ניתוח, אמצעים ומשווה את עוצמת הניאון הכוללת של ה-DNA בגרעין עם DNA שהגר אל מחוץ לגרעין. אות ניאון מהדנ"א הגר פרופורציונלית לניזק לדנ"א. זנב דנ"א כבר בהיר מסמל גדל ניזק לדנ"א. חלק מהפרמטרים שנמדדו הוא רגע זנב שהוא מדד של שניהם כמות ה-DNA וההפצה של ה-DNA בזנב, אורך הזנב והאחוז של ה-DNA בזנב. בדיקה זו מאפשרת למדוד תיקון DNA גם מאז רזולוציה של ניזק לדנ"א מסמנת תיקון התרחש. המגבלה של רגישות היא כ 50 הפסקות גדיל ל1,2 התא דיפלואידי יונקים. תאים שטופלו עם כל סוכנים מזיקים DNA, כגון etoposide, יכולים לשמש כביקורת חיובית. כך assay השביט הוא הליך מהיר ויעיל למדידת ניזק לדנ"א.
פרוטוקול
1. תא תרבות
- תאי תרבות עצביים ולטפל בם כנדרש.
- תאי קציר לתוך צינורות 15 מ"ל: תקשורת לשאוב, לשטוף עם פוספט נאגרו מלוח (PBS, סידן ומגנזיום חינם), להוסיף טריפסין, לאסוף בצינורות 15 מ"ל, ולנטרל את טריפסין עם מדיה מתאימה המכילה סרום.
- ספין ב1000 XG למשך 5 דקות.
- לשאוב תקשורת.
- Resuspend תאים בPBS.
- ספין ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Assay השביט יש את היכולת הייחודית של ניתוח תאים בודדים. זהו יתרון בזיהוי של אוכלוסיות של תאים הממחישות תגובת הפרש לסוכנים ציטוטוקסיות. כמה מגבלות מעשיות צריכות להילקח בחשבון. מספר התאים שניתן להעריך בנפרד עשוי להשתנות בהתאם לפרט. גודל המדגם צריך להיות מוגבר אם יש שונה בניזק לדנ"א בתוך אוכלוסייה. השעית קיימא תא בודד היא קריטית עבור assay זה מאז נוכחות דומיננטית של תאים נמקית או אפופטוטיים תוסיף לשגיאה. צעדי תמוגה ואלקטרופורזה מסלק תאים אפופטוטיים, שברים קטנים של DNA (קטן מ 50k.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
עבודה זו נתמכה בפרס IMPACT מהמחלקה לאונקולוגיה קרינה, אוניברסיטת אלבמה-בירמינגהם המקיף במרכז הסרטן, קרן הסרטן של לחימת הילדים, ואנג'ל הקרן של גבריאל (לESY.) על ידי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם המגיב | חברה | מספר קטלוגים | תגובות (אופציונלי) |
| 1.5 צינורות מ"ל | סנט קרוז ביוטכנולוגיה, Inc | SC-200271 | |
| TBE 10X (טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA) | הפישר סיינטיפיק | BP13331 | |
| 15 מיליליטר צינור | הפישר סיינטיפיק | 0553851 | |
| Agarose | סיגמא | A5093 | |
| רדיד אלומיניום | הפישר סיינטיפיק | 01213101 | |
| כוס | הפישר סיינטיפיק | FB102300 | |
| סרכזת | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| תוכנת Assay שביט | מערכת השביט Assay IV תמונת ניתוח | ||
| גליל | הפישר סיינטיפיק | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| קאמרי אלקטרופורזה | Thermo Scientific | 09528101 | |
| אתנול | הפישר סיינטיפיק | A407P4 | |
| מיקרוסקופ פלורסנט | Zeiss Vision Axio | כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן ירוק יספיק | |
| Hemacytometer | הפישר סיינטיפיק | 0267152 | |
| נקודת התכה הנמוך agarose | Promega | V2111 | |
| מיקרוגל | סרס | ||
| פוספט שנאגר סידן, מגנזיום המלוח, חופשי חופשי | HyClone | SH3025601 | |
| אספקת חשמל | BioRad | 1645050 | |
| מקרר | סרס | ||
| שליט | סטייפלס | ||
| להחליק | הפישר סיינטיפיק | 12550143 | |
| נתרן כלורי | סיגמא | S7653 | |
| נתרן הידרוקסידי | סיגמא | S5881 | |
| נתרן Lauryl sarcosinate | הפישר סיינטיפיק | S529 | |
| Sybr ירוק | Invitrogen | S7585 | |
| מגש | FISהמדעי | 15242B | |
| טריס בסיס | סיגמא | T6066 | |
| טריטון X-100 | סיגמא | T8787 | |
| טריפסין | HyClone | SH3023601 | |
| מערבולת | הפישר סיינטיפיק | 02216108 | |
| אמבט מים | הפישר סיינטיפיק | 154622Q |
מקורות
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleu....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
