Assay השביט הוא דרך יעילה לאיתור הפסקות בודדות וגדיל כפול, לרבות אתרים אלקלי רופפים וDNA-DNA/DNA-protein-קישורי צלב שעל ה-DNA בכל התאים, כוללים נוירונים ביפוקמפוס. השיטה מנצלת את הגירת ההפרש של ה-DNA בשדה חשמלי בשל הבדלים בכמות הניזק לדנ"א.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Assaying ניזק לדנ"א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט
במאמר זה
סיכום
תקציר
מספר התרופות למקד את מסלולי תיקון DNA ולגרום לתא הורג על ידי יצירת ניזק לדנ"א. לפיכך, תהליכים ישירות למדידת ניזק לדנ"א נבדקו בהרחבה. שיטות מסורתיות הן זמן, משאבים רבים, יקרים אינטנסיביים ודורשות תאים משתכפלים. לעומת זאת, בדיקת השביט, assay אלקטרופורזה ג'ל תא בודד, הנה אמצעי מהיר, לא פולשנית, זול, ישיר ורגיש של ניזק לדנ"א ותיקון. כל הצורות של ניזק לדנ"א, כמו גם תיקון DNA יכולות להיות דמיינו ברמת התא הבודדה באמצעות טכניקה זו עצמה.
העיקרון העומד ביסוד assay השביט הוא שדנ"א שלם הוא הורה מאוד ואילו ניזק לדנ"א משבש את הארגון הזה. מחלחל לתוך DNA הפגום agarose המטריצה וכאשר נתון שדה חשמלי, ה-DNA הטעון שלילי נודד לכיוון הקתודה הטעונה במטען חיובי. את גדילי הדנ"א הניזוק הגדולים אינם מסוגלים להעביר רחוק מהגרעין. ניזק לדנ"איוצר מקטעי דנ"א קטנים שנוסעים רחוק יותר מאשר ה-DNA בשלמותה. השביט Assay, תוכנת תמונת ניתוח, אמצעים ומשווה את עוצמת הניאון הכוללת של ה-DNA בגרעין עם DNA שהגר אל מחוץ לגרעין. אות ניאון מהדנ"א הגר פרופורציונלית לניזק לדנ"א. זנב דנ"א כבר בהיר מסמל גדל ניזק לדנ"א. חלק מהפרמטרים שנמדדו הוא רגע זנב שהוא מדד של שניהם כמות ה-DNA וההפצה של ה-DNA בזנב, אורך הזנב והאחוז של ה-DNA בזנב. בדיקה זו מאפשרת למדוד תיקון DNA גם מאז רזולוציה של ניזק לדנ"א מסמנת תיקון התרחש. המגבלה של רגישות היא כ 50 הפסקות גדיל ל1,2 התא דיפלואידי יונקים. תאים שטופלו עם כל סוכנים מזיקים DNA, כגון etoposide, יכולים לשמש כביקורת חיובית. כך assay השביט הוא הליך מהיר ויעיל למדידת ניזק לדנ"א.
פרוטוקול
1. תא תרבות
- תאי תרבות עצביים ולטפל בם כנדרש.
- תאי קציר לתוך צינורות 15 מ"ל: תקשורת לשאוב, לשטוף עם פוספט נאגרו מלוח (PBS, סידן ומגנזיום חינם), להוסיף טריפסין, לאסוף בצינורות 15 מ"ל, ולנטרל את טריפסין עם מדיה מתאימה המכילה סרום.
- ספין ב1000 XG למשך 5 דקות.
- לשאוב תקשורת.
- Resuspend תאים בPBS.
- ספין ב1000 XG למשך 5 דקות.
- לשאוב תקשורת ותאי resuspend ב PBS הטרי.
- ספירת תאים באמצעות hemacytometer או נגד התא המועדף עליך.
- דגימות תאים צריכות להיות מוכנות מייד לפני תחילת הבדיקה.
- כל הדגימות צריכות להיות מטופל באור הכהה או צהוב כדי למנוע ניזק לדנ"א מאור אולטרה סגול.
2. Assay שביט
1. הכנת מצגת
- ממסי 1% agarose (1 גר '/ 100 מ"ל ב1X טריס בסיס, בורה חומצה, EDTA, שהחפתה) במיקרוגל במשך 3 דקות עד שכל הגרגירים ייעלמו.
- טובלים את השקופיות לagarose המותך ולנגב צד לנקות עם kimwipe. אפשר agarose לאוויר יבש לסרט שקוף. ניתן לעשות זאת מראש ושקופיות ניתן לאחסן.
2. Assay שביט הניטראלי
- פתרון צינת תמוגה (2.5 מ 'NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM טריס בסיס, 1% sarcosinate אוריל נתרן, ו1% Triton X-100, 10 pH) בשעת 4 מעלות צלזיוס למשך שעות לפחות 1 לפני השימוש.
- 2.2.2. ממס% ההיתוך agarose נקודה נמוך 1 (1 גר '/ 100 מ"ל ב1X טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA) במיקרוגל במשך 3 דקות עד שכל הגרגירים ייעלמו. Agarose צריך להיות מקורר ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים כדי להימנע מזירוז מלאכותי של זנב שביט. באופן אידיאלי, agarose צריך להיות מקורר למשך חצי שעה לפני השימוש.
- 2.2.3. לדלל את השעית התא כך שיש 100.000 תאים למ"ל. מערבב את השעית התא עם נקודת ההיתוך agarose הנמוך (על 37 מעלות צלזיוס) בשעהיחס של 1:10 (v / v), בקצרה מערבולת, ופיפטה 50 μl מייד על שקופיות השביט. השתמש בצד של קצה פיפטה להפיץ את השעית התא באופן שווה על פני שטח המדגם. כל קבוצת טיפול צריכה להיות לפחות בשלושה עותקים.
- מקום מחליק שטוח במקרר למשך 30 דקות עד שהעיגול מופיע בפריפריה של השקופית.
- Prechill פתרון תמוגה ושקופיות להטביע בפתרון זה למשך 30 דקות בחושך ב 4 ° C (או במקרר).
- יוצק מעל או לשאוב את פתרון תמוגה ולהוסיף חיץ אלקטרופורזה ניטראלית 1X (טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA, 1X TBE). השאר שקופיות במאגר זה במשך חצי שעה במקרר.
- הוסף הצפת prechilled 1X ניטראלית אלקטרופורזה (TBE) בחדר אלקטרופורזה, שקופיות מקום בשקופית מגש אלקטרופורזה. יישר שקופיות, כך הם במרחק שווים מהאלקטרודות.
- יוצק אלקטרופורזה הניטראלית 1X חיץ עד 0.2 סנטימטרים מעל שקופיות. חיץ עודף ביןfere עם אלקטרופורזה.
- קבע מתח חשמל לV 1 לכל סנטימטר (נמדד האלקטרודה לאלקטרודה) ולהפעיל למשך 30 דקות ב 4 ° C (או בחדר הקר) בחושך.
3. Assay השביט אלקליין
- פתרון צינת תמוגה (2.5 מ 'NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM טריס בסיס, 1% sarcosinate אוריל נתרן, ו1% Triton X-100, 10 pH) בשעת 4 מעלות צלזיוס למשך שעות לפחות 1 לפני השימוש.
- ממסי 1% נמוך היתוך agarose נקודה (1 גר '/ 100 מ"ל ב1X טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA) במיקרוגל במשך 3 דקות עד שכל הגרגירים ייעלמו. אז מגניב ב° אמבט מים 37 ג ללפחות 30 דקות.
- שלבו את התאים במיליליטר 1 x 105 / עם נקודת התכה הנמוכה agarose המותך (על 37 מעלות צלזיוס) ביחס של 1:10 (v / v), בקצרה מערבולת, ופיפטה 50 μl מייד על שקופיות השביט. השתמש בצד של קצה פיפטה להפיץ את השעית התא באופן שווה על פני שטח המדגם. כל קבוצת טיפול צריכה להיות לפחות בשלושה עותקים.
- המקום החליקes השטוח במקרר למשך 30 דקות עד למעגל מופיע בפריפריה של השקופית.
- שקופיות לטבול בתמיסת תמוגה prechilled ועוזב ב4 מעלות צלזיוס למשך שעות 1 עד הלילה בחושך.
- הסר את השקופיות מפתרון תמוגה, לנקז את השקופיות ולשטוף פעם אחת עם חיץ נטרול קר למשך 5 דקות כדי להסיר חומרי ניקוי ומלחים שיורית לפני צעד אלקלי התרה-.
- שקופיות מקום בתא אלקטרופורזה ג'ל מלא במאגר prechilled טרי אלקטרופורזה (300 המ"מ NaOH, 1 mM EDTA, pH> 13) לא יעלה על 0.5 סנטימטרים מעל שקופיות. יישר שקופיות, כך הם במרחק שווים מהאלקטרודות.
- בואו שקופיות לשבת במאגר הבסיסי למשך 30 דקות בחושך כדי לאפשר להתרה של ה-DNA והביטוי לניזק אלקלי אחראי.
- קבע מתח חשמל לV 1 לכל סנטימטר (נמדד האלקטרודה לאלקטרודה) ולהפעיל למשך 30 דקות ב 4 ° C (או בחדר הקר).
4. תיקון וStaתאי ining
- מסנן מאגר אלקטרופורזה עודפת
- לטבול במים מזוקקים מחליק מראש מקוררים למשך 5 דקות בRT.
- שקופיות לטבול באתנול 70% מראש מקורר למשך 5 דקות בRT.
- דגימות יבשות בן הלילה. אל תחשוף את שקופיות לאור בהיר. דוגמאות יכולות להיות מאוחסנות במשך חודשים בטמפרטורת חדר לפני הבקיע בשלב זה.
- כתם שקופיות על ידי הטבילה בSybr ירוק (1X המדולל ב PBS) למשך 20 דקות במקרר.
- הסר שקופיות ולאפשר להם להתייבש לגמרי בחושך. Agarose יהפוך שקוף כשיבש לחלוטין.
4. יבוא תמונות וניתוח
- לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המוגדר הירוק המסנן (Zeiss AxioVision) ולנתח באמצעות תוכנת Assay שביט (מכשירי Perceptive).
- לחץ על "ראש השביט" (גרעין) והתוכנה מחשבת את הפרמטרים כוללים רגע ממוצע הזנב וכמות ה-DNA בגרעין.
- לנתח לפחות 200 תאים לכל טיפול.
- יצוא נתונים ל-Microsoft Excel.
- חישוב מתכוון לרגע זנב לכל קבוצת טיפול ונתוני עלילה על פי צורך.
5. נציג תוצאות
דוגמה לניתוח assay שביט על תאים עצביים מוצגת באיור 2 ואיור 3. במקרה זה, הקרנה של התאים העצביים גורמת ניזק לדנ"א. כאשר התאים נחשפים לשדה החשמלי, ה-DNA נודד בשיעורים שונים בשל הבדלים בגודל שנותח לאחר מכן באמצעות תוכנת Assay שביט. יותר הניזק לדנ"א, רחוק יותר את ה-DNA נודד אל מחוץ לגרעין. זה מקטין את עוצמת הניאון בגרעין שהרימה לאחר מכן על ידי התוכנה ותוצאות ברגע זנב גבוה. טבלה 1 מציגה טבלת נציג מהניתוח והאיור 4 assay שביט תערוכות יציגותגרף באשר היא מסוגלת להשוות ניזק לדנ"א בתאים עצביים בעקבות קרינה, כפי שנמדד על ידי assay השביט.
איור 1. תרשים זרימה של assay השביט. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. תמונות מייצגות של תאים עצביים () ללא ו( ב ') עם זנב שביט.
איור 3. ניתוח assay שביט באמצעות תוכנת Assay שביט. () תמונות מסך יציג של תמונה נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Carl Zeiss ונותחה באמצעות שביטתוכנת assay. (ב) לחיצה על הגרעין או "ראש השביט" (מוקף בעיגול ירוק) יוצרת מפת ניאון וגרף (מוקף בעיגול צהוב) וטבלה (ג') נתונים (מוקף בעיגול אדום). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. גרף נציג מתקבל על ידי זומם רגע הזנב הממוצע שהושג על ידי ניתוח הניזק לדנ"א בתאים עצביים מוקרנים ובלתי מוקרנים באמצעות assay שביט ניטראלי. כצפוי, קרינת 3Gy (רנטגן) גורמת ניזק לדנ"א כמתואר על ידי רגע זנב הממוצע הגבוה יותר בתאים העצביים המוקרנים. שמוצג הוא רגע ממוצע הזנב (+ / - שגיאה סטנדרטית), ** P <0.01.
טבלת 1. שולחן נציג מתקבל על ידי ניתוח assay שביט על תאים עצביים מוקרנים ולא מוקרנים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Assay השביט יש את היכולת הייחודית של ניתוח תאים בודדים. זהו יתרון בזיהוי של אוכלוסיות של תאים הממחישות תגובת הפרש לסוכנים ציטוטוקסיות. כמה מגבלות מעשיות צריכות להילקח בחשבון. מספר התאים שניתן להעריך בנפרד עשוי להשתנות בהתאם לפרט. גודל המדגם צריך להיות מוגבר אם יש שונה בניזק לדנ"א בתוך אוכלוסייה. השעית קיימא תא בודד היא קריטית עבור assay זה מאז נוכחות דומיננטית של תאים נמקית או אפופטוטיים תוסיף לשגיאה. צעדי תמוגה ואלקטרופורזה מסלק תאים אפופטוטיים, שברים קטנים של DNA (קטן מ 50k...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
עבודה זו נתמכה בפרס IMPACT מהמחלקה לאונקולוגיה קרינה, אוניברסיטת אלבמה-בירמינגהם המקיף במרכז הסרטן, קרן הסרטן של לחימת הילדים, ואנג'ל הקרן של גבריאל (לESY.) על ידי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם המגיב | חברה | מספר קטלוגים | תגובות (אופציונלי) |
| 1.5 צינורות מ"ל | סנט קרוז ביוטכנולוגיה, Inc | SC-200271 | |
| TBE 10X (טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA) | הפישר סיינטיפיק | BP13331 | |
| 15 מיליליטר צינור | הפישר סיינטיפיק | 0553851 | |
| Agarose | סיגמא | A5093 | |
| רדיד אלומיניום | הפישר סיינטיפיק | 01213101 | |
| כוס | הפישר סיינטיפיק | FB102300 | |
| סרכזת | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| תוכנת Assay שביט | מערכת השביט Assay IV תמונת ניתוח | ||
| גליל | הפישר סיינטיפיק | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| קאמרי אלקטרופורזה | Thermo Scientific | 09528101 | |
| אתנול | הפישר סיינטיפיק | A407P4 | |
| מיקרוסקופ פלורסנט | Zeiss Vision Axio | כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן ירוק יספיק | |
| Hemacytometer | הפישר סיינטיפיק | 0267152 | |
| נקודת התכה הנמוך agarose | Promega | V2111 | |
| מיקרוגל | סרס | ||
| פוספט שנאגר סידן, מגנזיום המלוח, חופשי חופשי | HyClone | SH3025601 | |
| אספקת חשמל | BioRad | 1645050 | |
| מקרר | סרס | ||
| שליט | סטייפלס | ||
| להחליק | הפישר סיינטיפיק | 12550143 | |
| נתרן כלורי | סיגמא | S7653 | |
| נתרן הידרוקסידי | סיגמא | S5881 | |
| נתרן Lauryl sarcosinate | הפישר סיינטיפיק | S529 | |
| Sybr ירוק | Invitrogen | S7585 | |
| מגש | FISהמדעי | 15242B | |
| טריס בסיס | סיגמא | T6066 | |
| טריטון X-100 | סיגמא | T8787 | |
| טריפסין | HyClone | SH3023601 | |
| מערבולת | הפישר סיינטיפיק | 02216108 | |
| אמבט מים | הפישר סיינטיפיק | 154622Q |
מקורות
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4(2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
- Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
- Electrophoresis, F. I., et al. Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
